Name: Immuno-fluorescence étiquetage des Microtubules et des centrosomes protéines dans les tissus intestinaux Ex Vivo et 3D In Vitro intestinale organoïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Apprenez l'immunofluorescence des microtubules et protéines centrosomales dans les organoïdes intestinaux 3D et tissus ex vivo. Cette méthode préserve l'architecture tout en permettant l'étude de la biologie cellulaire.

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Les auteurs remercient Paul Thomas pour aide et conseils de microscope. Ce travail ici en cause a été soutenu par le BBSRC (subvention no. BB/J009040/1 à M.M.M. et T.W.).

<ol><li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li>
<li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li>
<li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-organizing+centers%3A+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li>
<li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Colorectal+Cancer+Rep%22%5BJournal%5D)">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li>
<li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042(2015).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
<li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIS1%2C+CLIP-170%27s+key+to+the+dynein%2Fdynactin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li>
<li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li>
<li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Isolement de tissu intestinal Isolement des petites cryptes intestinales et les villosités et les cryptes du côlon consiste à exposer la surface des muqueuses, traitement avec une solution d’EDTA pour desserrer la centrifugation, le fractionnement (secousses) et contacts de la cellule. Le protocole présenté villosités/cryptes intestinales a été modifié par Belshaw et coll. et Whitehead et al. 17 , 18
Exposer la surface de la muqueuse Nous avons expérimenté avec un certain nombre d’approches pour exposer la surface muqueuse du tractus intestinal dans le développement de cette procédure. Une approche classique consiste à evert (tourner à l’envers) le tube, généralement dans les segments environ 100 mm de longueur, à l’aide d’une tige métallique qui est prise dans un pli du tissu à une extrémité, puis le tube restant a glissé au-dessus du tube19. Pour les tissus de souris, une tige de métal (2,4 mm de diamètre) avec les extrémités arrondies est idéale. Cette approche a l’avantage d’élargir la surface des muqueuses permettant un accès meilleur à PBS et d’EDTA. Nous avons initialement utilisé cette approche mais s’installe à découper le tube en petites longueurs (environ 5 cm) et l’ouverture de chaque section avec ciseaux de dissection, comme cela s’est avéré plus facile. Cette approche est appropriée si seulement quelques intestins sont obligatoires ; mais si plus d’animaux devaient être utilisés lors d’une expérience puis un dispositif spécialement conçu pour coupe ouvert le tube longitudinalement, tel que décrit par Yoneda et al. 14 serait plus efficace.
Détachement des villosités et les cryptes de la couche musculaire Au départ, nous avons utilisé 3 mM EDTA dans du PBS et temps d’incubation relativement longue de plus de 60 min pour desserrer la surface muqueuse de tissus sous-jacents17,18. À cette concentration d’EDTA, nous avons constaté qu'une durée d’incubation de 30 min ne suffisait pas à desserrer les cryptes du colon de la souris. Toutefois, pour l’isolement de crypte/villosités de l’intestin, nous avons essayé sur EDTA plus concentré pour un temps plus court, qui s’est avéré pour être une approche efficace. Tous les travaux ultérieurs a été entrepris avec tissu extrait à l’aide de la technique de 30 mM EDTA générant des fractions pertinentes pour les villosités ou cryptes. Pour les cryptes, nous avons mis en commun normalement fractions 3-5 avant de fixer mais il est important de vérifier si ce sont les fractions appropriées comme les timings dépendra d’un certain nombre de facteurs tels que la position le long du tractus intestinal, l’âge de la souris, l’inflammation, régime précédent , etc. de la même façon, la longueur de temps, le tissu doit être ébranlé après le traitement à l’EDTA soit efficace peut varier dans des conditions différentes. Il en résulte des fractions isolées de tissus contenant un mélange de villosités et de cryptes ou principalement les villosités ou cryptes (Figure 2). Comme il ne sont a aucun villosités dans le côlon, l’extraction de la crypte peut-être être obtenue en une seule étape en secouant le tissu dans le tube pendant 30 s. Ces fractions peuvent alors être fixées et traitées pour immuno-marquage.
Isolement des organoïdes intestinal de la matrice de sous-sol Isolement des organoïdes de dômes de matrice de sous-sol est possible en utilisant la solution de récupération des cellules. La solution fonctionne par dépolymérisation de la matrice gélifiée sous-sol mais la température doit être 2-8 ° C. Une note de prudence, c’est que les microtubules dynamiques ne peuvent pas être conservés. Ainsi, par immuno-marquage des microtubules dynamiques et + conseils tels que la cellule de l’EBs, récupération de la matrice du sous-sol avant de fixation n’est pas recommandée. Cependant, la plupart des microtubules dans les cellules organoïde différenciation est relativement stable et ceux-ci ont été préservés (Figure 6). Il a travaillé aussi bien pour l’immuno-marquage des protéines centrosomes et jonctionnelles, mais aussi des marqueurs de cellules.
Protocoles de fixation Formaldéhyde (fraîchement faite de PFA) est un action relativement rapide fixateur qui forme réversible cross-links et 4 % PFA fonctionne bien par exemple, dans l’immuno-marquage des microtubules et gamma-tubuline et des filaments d’actine coloration avec la phalloïdine. Plus de solutions PFA par exemple 1 % a bien fonctionné pour immuno-marquage par exemple, avec le marqueur de cellules de marqueurs Lgr5 et Paneth CD24 cellules souches dans la niche de cellules souches crypte, tandis que des concentrations plus élevées de l’IFP ne fonctionnaient pas diluent.
L’addition de glutaraldéhyde, meilleure conservation des microtubules et la fixation de PHEMO dite, qui se compose d’un mélange de 3,7 % PFA, glutaraldéhyde à 0,05 % et 0,5 % de détergent dans le tampon (tuyaux de 68 mM, 25 mM HEPES, EGTA 15 mM et 3 mM MgCl2) PHEMO2 donne excellente conservation des microtubules sans compromettre l’antigénicité. Il fonctionne aussi bien pour les immuno-marquage gamma-tubuline β-caténine et E-cadhérine et des filaments d’actine coloration avec la phalloïdine. Toutefois, dans le tissu 3D et organoïde cultures, la fixation de PHEMO produit des résultats incohérents et n’était donc pas utilisée.
Le méthanol est un fixateur coagulant qui donne relativement bonne pénétration et tend à préserver l’antigénicité. Fixation avec 100 % de méthanol (-20 ° C) présente un rétrécissement, donne préservation de morphologie modérée et travaille pour les microtubules, + de conseils et de nombreux anticorps centrosomes, dont ninein dans les cultures cellulaires 2D. Toutefois, certains organoïdes se sont effondrés lors de l’utilisation de cette méthode de fixation. En outre, la pénétration des anticorps à travers tout cryptes, villosités ou organoïdes a d’abord été un problème mais l’ajout de détergent, 0,1 % pour la solution de lavage et un lavage prolongé atteint de meilleurs résultats.
Une combinaison de méthanol et de formaldéhyde avait été précédemment utilisée par Rogers et al. 20 à immuno-étiquette EB1 dans Drosophila. Un protocole de fixation basé sur un mélange de formaldéhyde et de méthanol a donc été développé pour le tissu intestinal et organoïdes basé sur 3 % formaldéhyde et 97 % de méthanol réfrigérée à-20 ° C, mais en omettant le carbonate de sodium 5 mM du mélange qui a été utilisé par Rogers et al. 20 en outre, les échantillons ont été fixés dans le congélateur à-20 ° C. Cela a travaillé particulièrement bien pour l’immuno-marquage + conseils, tels que le CLIP-170 et l’EBs, mais aussi s’est avéré excellent pour fixation et immuno-marquage des microtubules et l’actine dans les tissus et 3D organoïdes. Très bonne conservation structurale était évidente et antigénicité a été préservée pour plusieurs protéines du cytosquelette et associés ainsi que des protéines centrosomes comme gamma-tubuline et ninein, bien que l’étiquetage à des ninein plus systématiquement travaillé avec du méthanol fixation.

Formation de l’épithélium avec polarité apico-basal est un processus fondamental dans le développement et implique une réorganisation dramatique des microtubules et des centrosomes protéines. Un tableau de microtubules radial émanant d’un microtubule centrosomes situé centre organisateur (MTOC) est importante dans plusieurs cellules animales et c’est bien adapté pour les piles relativement plates. En revanche, les cellules épithéliales prismatiques, telles que celles de l’intestin, assemblent les tableaux de microtubules non radiaux transcellulaire supportant mieux la forme et des fonctions spécialisées de ces cellules. Cette réorganisation dramatique des microtubules est obtenue par le centrosome vers l’apex et apicales MTOCs non-centrosomal (n-MTOCs) formant, qui devient responsable de l’ancrage des microtubules transcellulaire1,2 , 3 , 4 , 5.
Une grande partie de nos connaissances de la différenciation épithéliale et la réorganisation des microtubules associés vient des enquêtes de 2D en vitro couches de cellules qui n’affichent pas l’architecture de tissu in vivo . Développement des cultures 3D in vitro organoïde, mis au point par6Clevers et collègues de travail, représente une avancée technologique majeure car ils imitent en vivo de l’architecture et de développement. Une hiérarchie de différenciation épithéliale est évidente dans l’intestin ; les cellules souches au fond des cryptes donnent lieu au transit immature amplifier les cellules qui prolifèrent et se différencient progressivement alors qu’ils migrent vers le haut de la crypte sur le petites villosités intestinales ou de la surface du côlon, où ils deviennent complètement différenciés avant d’être hangar dans le lumen7. Ce qui est important, c’est reproduit dans organoïdes intestinal où les cellules de la niche de cellules souches prolifèrent formant kystes qui génèrent ensuite des bourgeons au fond et progresse graduellement vers la région du kyste, la différenciation des cellules souches ressemblant à des cryptes qui devient villosités type8. L’organoïde intestinal représente donc un modèle puissant d’étudier non seulement des microtubules et des centrosomes réorganisation au cours de la différenciation épithéliale mais plusieurs autres protéines, ainsi que fournir une plate-forme idéale pour le dépistage des drogues et de l’alimentation composés du potentiel thérapeutique bénéficie de9,10.
Organoïdes sont bien adaptés pour vivre-l’imagerie des protéines fluorescentes et les deux knock-in et knock out organoïdes peut être généré à l’aide de gène CRISPR/Cas9 édition11,12. Toutefois, établir l’expression et la localisation des protéines endogènes à étudier est important, en particulier de vérifier le comportement des protéines étiquetés. Immuno-marquage 3D organoïdes cultivés dans la matrice de sous-sol ou ex vivo isolée des tissus sont plus complexe que les cellules cultivées dans des récipients de culture en 2D. Le protocole de fixation doit préserver l’architecture 3D délicat d’organoïdes tout en conservant l’antigénicité des anticorps (c.-à-d., les épitopes permettant de lier les anticorps). Par exemple, 4 % de paraformaldéhyde (PFA) est couramment utilisé comme fixateur mais alors que c’est un fixateur d’action relativement rapide et donne bonne préservation morphologique, dans notre expérience il souvent résulte en une perte d’antigénicité et ne convient pas pour un grand nombre anticorps centrosomes. On envisagera également la capacité de l’anticorps et fixateur de pénétrer dans les tissus et les structures 3D. À cette fin, nous avons modifié et protocoles développés pour isolation de tissu et immuno-marquage indirecte de 3D en vitro organoïdes et ex vivo isolement de tissu intestinal. Nous décrivons comment isoler les petites cryptes intestinales et les villosités et les tissus du côlon et inclure un protocole pour l’isolement d’organoïdes 3D comme une alternative à la fixation et immuno-marquage inclus dans le sous-sol. Nous présentons trois protocoles alternatifs de fixation pour l’immuno-marquage des microtubules et des centrosomes protéines, tels que ninein et des protéines microtubulaires suivi plus-bout (+ conseils), tels que les protéines EB et CLIP-170 (voir aussi les références8, 13). Nous discuterons les avantages et les inconvénients associés à chaque protocole.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td>solution de lavage et</td></tr><tr><td>de récupération</td> cellulaire PFA <td>Corning</td><td>354253</td><td>isoler les organoïdes</td></tr><tr><td>lobind microtubes à centrifuger</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td>empêcher les cellules de coller</td></tr><tr><td>0,5 M Solution EDTA, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>03690-100ML</td><td>Isolation de la crypte</td></tr><tr><td>70 &mu ; Passoire à cellules m</td><td>Fisher Scientific</td><td>11517532</td><td>Isolat des cryptes à partir de villosités</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>détergent</td></tr><tr><td>sérum de chèvre</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td>agent bloquant</td></tr> sérum de <tr><td>veau fœtal (FBS)</td><td>Sigma</td><td></td><td>utilisé comme agent antiadhésif</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, 4 % dans PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>fixateur</td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde (36,5 po 38 % dans H2O)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>utilisé comme fixateur</td></tr><tr><td>Méthanol 99,9 % Qualité analytique</td><td>Fisher</td><td>M/4000/17</td><td>utilisé comme fixateur</td></tr><tr><td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td><td>Maxvision Biosciences</td><td>MF01-S</td><td>commercial immunofluorescence ; pour réduire l’étiquetage non spécifique</td></tr><tr><td>Rotator SB2 ou SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>rotateur de tube de microcentrifugeuse</td></tr><tr><td>Récupération de l’antigène</td>du<td>citrate</td><td></td><td></td> de sodium</tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>mountant</td></tr><tr><td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td><td>Sigma</td><td>D27802</td><td>agent anti-décoloration</td></tr><tr><td>Permanent Chargé positivement, prélavé, 90 degrés Bords rectifiés</td><td>Clarté</td><td>N/C366</td><td>lames</td></tr><tr><td>Lamelles en verre - épaisseur n° 1, 22 x 50 mm</td><td>Clarity</td><td>NQS13/2250</td><td>lamelles</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matrice socle pour la culture d’organoïdes 3D</td></tr><tr><td>50 mL tubes coniques</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>pour le traitement des tissus/organoïdes</td></tr><tr><td>15 mL Tubes coniques</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>pour le traitement des tissus/organoïdes</td></tr><tr><td>1,5 mL Tubes LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td>pour organoïdes isolés</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-E-cadhérine de souris</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td> anticorps <td>primaire 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-tubuline YL1/2 de rat</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>Anticorps primaire 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps alpha-tubuline de lapin</td><td>Abcam</td><td>ab15246</td><td>Anticorps primaire 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps anti-bêta-actine de lapin</td><td>Abcam</td><td>Anticorps primaire ab8227</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-p150 de rat</td><td>BD Bioscience</td><td>Anticorps primaire 610473/4</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal EB3KT36 de rat</td><td>Abcam</td><td>ab53360</td><td>Anticorps primaire 1:200</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal EB1 de souris</td><td>BD Bioscience</td><td>610535</td><td>anticorps primaire 1:200</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Lgr5 de lapin</td><td>Abgent</td><td>AP2745d</td><td>Anticorps primaire 1:100</td></tr><tr><td>Dylight anti-rat 488</td><td>Jackson</td><td>112545167</td><td>anticorps secondaire 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-souris 488</td><td>Jackson</td><td>ST115545166</td><td>secondaire anticorps 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-lapin 647</td><td>Jackson</td><td>111605144</td><td>secondaire anticorps 1:400</td></tr></tbody></table>

immuno-fluorescence étiquetage des microtubules et des centrosomes protéines dans les tissus intestinaux ex vivo et 3d in vitro intestinale organoïdes

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

L’avènement de la 3D en vitro organoïdes qui imitent le in vivo l’architecture tissulaire et la morphogenèse a grandement contribué à améliorer la capacité d’étudier des questions biologiques clés en biologie cellulaire et du développement. En outre, organoïdes ainsi que les progrès techniques récents dans l’édition de gène et de livraison de gènes viraux promet de faire avancer la recherche médicale et le développement de nouveaux médicaments pour le traitement des maladies. Organoïdes cultivés in vitro dans la matrice de sous-sol fournissent des systèmes puissants modèles pour étudier le comportement et la fonction des protéines différentes et sont bien adaptés pour vivre-l’imagerie des protéines fluorescentes-étiquetées. Toutefois, établir l’expression et la localisation des protéines endogènes dans le tissu ex vivo et in vitro organoïdes est important de vérifier le comportement des protéines étiquetés. À cette fin, nous avons développé et modifié les tissus isolation, fixation et immuno-marquage des protocoles pour la localisation des microtubules, protéines centrosomes et associés en tissu intestinal ex vivo et in vitro intestinale organoïdes. L’objectif était pour le fixateur préserver l’architecture 3D du organoïdes/tissu tout en préservant l’antigénicité des anticorps et qui permet la bonne pénétration et dégagement de fixateur et d’anticorps. Exposition au froid depolymerizes tous sauf les microtubules stables et c’était un facteur clé lors de la modification des protocoles différents. Nous avons constaté qu’augmentant la tétraacétique (EDTA) concentration de l’acide de 3 mM à 30 mM a détachement efficace des villosités et les cryptes de l’intestin grêle tandis que 3 mM EDTA ne suffisait pas pour les cryptes du côlon. Le protocole de fixation développés formaldéhyde/méthanol a donné très bonne préservation structurelle tout en préservant l’antigénicité pour un étiquetage efficace des microtubules, actine et des protéines (EB) fin. Il a également travaillé pour la protéine centrosomal ninein, bien que le protocole de méthanol a travaillé plus de Constance. Plus loin, nous avons établi que la fixation et l’immuno-marquage de microtubules et de protéines associées pourraient être atteints avec organoïdes isolé ou restant dans la matrice du sous-sol.

Nous présentons des protocoles pour l’isolation de bâtiments 3D intestinales in vivo des tissus du et matrice de sous-sol en vitro intégrée organoïdes et différentes de fixation détail et souillant des protocoles optimisés pour l’immuno-marquage des microtubules, les protéines centrosomes et jonctionnelles ainsi que cell marqueurs dont la protéine des cellules souches Lgr5.

Immuno-fluorescence étiquetage des Microtubules et des centrosomes protéines dans les tissus intestinaux Ex Vivo et 3D In Vitro intestinale organoïdes

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des organoïdes intestinaux intégrés dans la matrice basale 3D in vitro, puis de fixer et d’immunomarquer les microtubules et les organoïdes centrosomaux proteins. 3D in vitro qui sont des modèles idéaux pour étudier les questions biologiques clés en biologie cellulaire et du développement. Mais la localisation des protéines et des structures endogènes dans les modèles 3D est plus complexe que dans les cultures 2D.Il est important de noter que le fixateur doit préserver l’architecture 3D délicate tout en préservant l’antigénicité de l’anticorps. Les méthodes présentées comprennent l’isolement, la fixation et l’immunomarquage d’organoïdes intestinaux in vitro en 3D. Mais les protocoles de fixation et d’immunomarquage peuvent également être utilisés dans des tissus isolés ex vivo.Le principal avantage du protocole de fixation du méthanol au formaldéhyde présenté est qu’il préserve les structures 3D tout en préservant l’antigénicité. Il permet une bonne pénétration et une bonne élimination des anticorps de tevel post-fixés pour un marquage efficace des microtubules, des filaments d’actine et des protéines de liaison et de plusieurs protéines centrosomales, dont la nineine. La démonstration de la procédure sera faite par le docteur Deborah Goldspink, postdoc officielle dans mon laboratoire, et le docteur Zoe Matthews, co-auteure.Suite à l’isolement des cryptes intestinales et des villosités, des structures épithéliales isolées peuvent être fixées pour l’immunomarquage. Les cryptes isolées peuvent être alternativement assises dans des dômes matriciels qui formeront ensuite des organoïdes. Après environ cinq à sept jours d’incubation, des organoïdes se seront formés.Utilisez 500 microlitres de RT-PBS pour laver les puits contenant les dômes de matrice du sous-sol avec des organoïdes. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de solution de récupération de cellules froides dans chaque puits. Ensuite, à l’aide d’une micropipette P1000, grattez les dômes de la matrice du sous-sol et pipetez soigneusement de haut en bas dans tout le puits pour briser et retirer la matrice du sous-sol du plastique.Assurez-vous que la solution de récupération est froide pour aider à décomposer la matrice. Lors du grattage, utilisez uniquement une micropipette P1000 afin de ne pas casser les organoïdes et de les garder intacts. Prélever le surnageant dans des tubes de microcentrifugation à faible liaison de 1,5 millilitre.Ensuite, retournez le tube plusieurs fois et vérifiez au microscope à un grossissement de 50 que les organoïdes ont été isolés, se déplacent librement et ne sont pas en amas. Granulez les organoïdes par centrifugation à 1 000 g et à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le réactif de récupération et procédez immédiatement à la fixation.Pour fixer des organoïdes précédemment isolés avec du formaldéhyde et du méthanol, remettez les organoïdes en suspension dans une solution fixatrice de méthanol de formaldéhyde à moins 20 degrés Celsius. Incuber les organoïdes à moins 20 degrés Celsius dans un congélateur pendant 15 minutes, en inversant le tube toutes les cinq minutes. Ensuite, granulez les organoïdes par centrifugation à 1 000 g pendant cinq minutes.Retirez le fixateur, puis ajoutez la solution de lavage composée soit de PBS avec 1 % de sérum d’espèces d’anticorps secondaires, soit de PBS avec 0,1 % de détergent et 1 % de sérum. Après avoir granulé l’échantillon comme précédemment, retirez la solution de lavage et remettez l’échantillon en suspension dans une solution de lavage fraîche. À l’aide d’un rotateur de tube, lavez les cellules pendant un total d’une heure, en granulant les organoïdes par centrifugation toutes les 15 minutes et en remplaçant la solution de lavage.Pour bloquer les échantillons d’organoïdes intestinaux, ajoutez 10 % de sérum d’espèce d’anticorps secondaire au PBS. Granulez les organoïdes à 1 000 g pendant cinq minutes et retirez le surnageant. Ajoutez une solution bloquante d’un millilitre à chaque échantillon à incuber dans les différents anticorps.Ensuite, incubez les échantillons et la solution de blocage sur un rotateur de tube à température ambiante pendant une heure. Ensuite, diluez les anticorps primaires dans du PBS contenant 10 % de sérum et 0,1 % de détergent. Ensuite, après avoir fait tourner les échantillons et retiré la solution de blocage, utilisez la solution d’anticorps primaires pour remettre en suspension la pastille organoïde.Faites pivoter les tubes à 20 tr/min et quatre degrés Celsius pendant la nuit pour maintenir les organoïdes en suspension. Le lendemain, ramenez les échantillons à température ambiante sur le rotateur de tube pendant une heure. Après avoir essoré l’échantillon, retirez la solution d’anticorps primaire, ajoutez un millilitre de solution de lavage dans chaque tube et remettez en suspension les pastilles organoïdes.Ensuite, retirez immédiatement la solution par centrifugation. Ajoutez un millilitre de solution de lavage fraîche et mélangez les cellules sur un rotateur de tube à 20 tr/min pendant deux heures. Ensuite, diluez les anticorps secondaires dans le PBS avec 1 % de sérum et 0,1 % de détergent.Ensuite, après avoir granulé le tissu, remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de solution d’anticorps secondaires. Incuber les tubes sur un rotateur de tube à température ambiante pendant une heure. Après avoir essoré et retiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans la solution de lavage et centrifuger immédiatement les échantillons pour granuler les organoïdes.Ensuite, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de solution de lavage fraîche. Mélangez les échantillons sur un rotateur de tube à température ambiante pendant 1,5 à deux heures, en changeant la solution de lavage toutes les 20 à 30 minutes comme décrit précédemment. Pour monter les organoïdes, après avoir essoré et retiré toute la solution de lavage, ajoutez deux gouttes de milieu de montage dur avec un réactif anti-décoloration à la pastille.Coupez l’extrémité d’une micropipette P200 et remettez soigneusement la pastille en suspension dans le support de montage. Lors de la remise en suspension d’organoïdes fixes et colorés dans un support de montage, veillez à ne pas introduire de bulles. Si des bulles sont présentes, laissez-les flotter à la surface, puis évitez de les transférer sur la lame.À l’aide de la micropipette, distribuez les organoïdes avec le milieu de montage en ligne le long du centre d’une lame de microscope. Ensuite, placez soigneusement un verre de couverture sur le dessus et évitez de générer des bulles. Placez la lame de verre dans un livre de diapositives et conservez-la toute la nuit au réfrigérateur pour que le support de montage prenne avant de l’analyser sur un microscope confocal.On voit ici des images de la fraction deux de tissu isolé de l’intestin grêle contenant à la fois des villosités et des cryptes et un échantillon de la fraction trois contenant principalement des cryptes. Comme on le voit sur ces images, une bonne conservation et un bon marquage des microtubules et de l’actine dans les villosités et les cryptes ont été obtenus grâce au protocole de fixation et d’immunomarquage au formaldéhyde et au méthanol décrit dans cette vidéo. Des organoïdes de l’intestin grêle ont été générés et cultivés dans la matrice basale pendant trois semaines ou plus, puis isolés comme le montre cette vidéo.Les cellules différenciées au sein des domaines des villosités organoïdes contiennent des microtubules apicobasaux stables qui ont été bien marqués dans la plupart des cas. EB1 pouvait également être observé le long du réseau des microtubules. On voit ici un organoïde au stade de kyste et à un stade précoce du développement des cryptes.Les deux échantillons ont été fixés dans du méthanol de formaldéhyde et immunomarqués pour les microtubules et le ninein, ce qui démontre une bonne conservation des microtubules et un bon marquage dans les centres d’organisation des microtubules apicaux non centrosomaux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée avec plusieurs échantillons et sur deux jours. Lors de cette procédure, il est important de gratter soigneusement les puits lors de la collecte des organoïdes pour éviter de perturber leur structure 3D.Soyez également prudent lors de l’ajout ou du retrait de solutions pour éviter la perte d’organoïdes tout au long de la procédure de coloration. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fixer, d’immunomarquer et de monter des organoïdes isolés et d’autres structures épithéliales telles que les cryptes intestinales. N’oubliez pas que l’utilisation de réactifs fixateurs dans cette procédure peut être extrêmement dangereuse.Des évaluations des risques de cette procédure doivent être effectuées et des mesures de confinement appropriées et des EPI doivent toujours être pris lors de l’exécution de cette procédure.

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Biologie du développement

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Imagerie par immunofluorescence à monture entière : une technique de fixation et de coloration pour évaluer les organoïdes intacts

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Procédé basé sur l’immunofluorescence pour visualiser des cellules de touffe dans des cryosections de jéjunum

La technologie d’imagerie améliorée permet l’imagerie tridimensionnelle des organes au cours du développement. Nous décrivons ici un système complet de culture d’organes qui permet l’imagerie en direct des villosités en développement dans l’intestin fœtal de la souris.

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Système de modèle intestinal tridimensionnel (3D) de base avec une composante immunitaire

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Imagerie 3D haute résolution sans marquage et analyse par apprentissage automatique d’organoïdes intestinaux par holotomographie à faible cohérence

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Immuno-fluorescence étiquetage des Microtubules et des centrosomes protéines dans les tissus intestinaux Ex Vivo et 3D In Vitro intestinale organoïdes (Vidéo) | JoVE Journal

Immuno-fluorescence étiquetage des Microtubules et des centrosomes protéines dans les tissus intestinaux Ex Vivo et 3D In Vitro intestinale organoïdes

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