Immuno-fluorescence étiquetage des Microtubules et des centrosomes protéines dans les tissus intestinaux Ex Vivo et 3D In Vitro intestinale organoïdes

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des organoïdes intestinaux intégrés dans la matrice basale 3D in vitro, puis de fixer et d’immunomarquer les microtubules et les organoïdes centrosomaux proteins. 3D in vitro qui sont des modèles idéaux pour étudier les questions biologiques clés en biologie cellulaire et du développement. Mais la localisation des protéines et des structures endogènes dans les modèles 3D est plus complexe que dans les cultures 2D.

Il est important de noter que le fixateur doit préserver l’architecture 3D délicate tout en préservant l’antigénicité de l’anticorps. Les méthodes présentées comprennent l’isolement, la fixation et l’immunomarquage d’organoïdes intestinaux in vitro en 3D. Mais les protocoles de fixation et d’immunomarquage peuvent également être utilisés dans des tissus isolés ex vivo.

Le principal avantage du protocole de fixation du méthanol au formaldéhyde présenté est qu’il préserve les structures 3D tout en préservant l’antigénicité. Il permet une bonne pénétration et une bonne élimination des anticorps de tevel post-fixés pour un marquage efficace des microtubules, des filaments d’actine et des protéines de liaison et de plusieurs protéines centrosomales, dont la nineine. La démonstration de la procédure sera faite par le docteur Deborah Goldspink, postdoc officielle dans mon laboratoire, et le docteur Zoe Matthews, co-auteure.

Suite à l’isolement des cryptes intestinales et des villosités, des structures épithéliales isolées peuvent être fixées pour l’immunomarquage. Les cryptes isolées peuvent être alternativement assises dans des dômes matriciels qui formeront ensuite des organoïdes. Après environ cinq à sept jours d’incubation, des organoïdes se seront formés.

Utilisez 500 microlitres de RT-PBS pour laver les puits contenant les dômes de matrice du sous-sol avec des organoïdes. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de solution de récupération de cellules froides dans chaque puits. Ensuite, à l’aide d’une micropipette P1000, grattez les dômes de la matrice du sous-sol et pipetez soigneusement de haut en bas dans tout le puits pour briser et retirer la matrice du sous-sol du plastique.

Assurez-vous que la solution de récupération est froide pour aider à décomposer la matrice. Lors du grattage, utilisez uniquement une micropipette P1000 afin de ne pas casser les organoïdes et de les garder intacts. Prélever le surnageant dans des tubes de microcentrifugation à faible liaison de 1,5 millilitre.

Ensuite, retournez le tube plusieurs fois et vérifiez au microscope à un grossissement de 50 que les organoïdes ont été isolés, se déplacent librement et ne sont pas en amas. Granulez les organoïdes par centrifugation à 1 000 g et à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le réactif de récupération et procédez immédiatement à la fixation.

Pour fixer des organoïdes précédemment isolés avec du formaldéhyde et du méthanol, remettez les organoïdes en suspension dans une solution fixatrice de méthanol de formaldéhyde à moins 20 degrés Celsius. Incuber les organoïdes à moins 20 degrés Celsius dans un congélateur pendant 15 minutes, en inversant le tube toutes les cinq minutes. Ensuite, granulez les organoïdes par centrifugation à 1 000 g pendant cinq minutes.

Retirez le fixateur, puis ajoutez la solution de lavage composée soit de PBS avec 1 % de sérum d’espèces d’anticorps secondaires, soit de PBS avec 0,1 % de détergent et 1 % de sérum. Après avoir granulé l’échantillon comme précédemment, retirez la solution de lavage et remettez l’échantillon en suspension dans une solution de lavage fraîche. À l’aide d’un rotateur de tube, lavez les cellules pendant un total d’une heure, en granulant les organoïdes par centrifugation toutes les 15 minutes et en remplaçant la solution de lavage.

Pour bloquer les échantillons d’organoïdes intestinaux, ajoutez 10 % de sérum d’espèce d’anticorps secondaire au PBS. Granulez les organoïdes à 1 000 g pendant cinq minutes et retirez le surnageant. Ajoutez une solution bloquante d’un millilitre à chaque échantillon à incuber dans les différents anticorps.

Ensuite, incubez les échantillons et la solution de blocage sur un rotateur de tube à température ambiante pendant une heure. Ensuite, diluez les anticorps primaires dans du PBS contenant 10 % de sérum et 0,1 % de détergent. Ensuite, après avoir fait tourner les échantillons et retiré la solution de blocage, utilisez la solution d’anticorps primaires pour remettre en suspension la pastille organoïde.

Faites pivoter les tubes à 20 tr/min et quatre degrés Celsius pendant la nuit pour maintenir les organoïdes en suspension. Le lendemain, ramenez les échantillons à température ambiante sur le rotateur de tube pendant une heure. Après avoir essoré l’échantillon, retirez la solution d’anticorps primaire, ajoutez un millilitre de solution de lavage dans chaque tube et remettez en suspension les pastilles organoïdes.

Ensuite, retirez immédiatement la solution par centrifugation. Ajoutez un millilitre de solution de lavage fraîche et mélangez les cellules sur un rotateur de tube à 20 tr/min pendant deux heures. Ensuite, diluez les anticorps secondaires dans le PBS avec 1 % de sérum et 0,1 % de détergent.

Ensuite, après avoir granulé le tissu, remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de solution d’anticorps secondaires. Incuber les tubes sur un rotateur de tube à température ambiante pendant une heure. Après avoir essoré et retiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans la solution de lavage et centrifuger immédiatement les échantillons pour granuler les organoïdes.

Ensuite, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de solution de lavage fraîche. Mélangez les échantillons sur un rotateur de tube à température ambiante pendant 1,5 à deux heures, en changeant la solution de lavage toutes les 20 à 30 minutes comme décrit précédemment. Pour monter les organoïdes, après avoir essoré et retiré toute la solution de lavage, ajoutez deux gouttes de milieu de montage dur avec un réactif anti-décoloration à la pastille.

Coupez l’extrémité d’une micropipette P200 et remettez soigneusement la pastille en suspension dans le support de montage. Lors de la remise en suspension d’organoïdes fixes et colorés dans un support de montage, veillez à ne pas introduire de bulles. Si des bulles sont présentes, laissez-les flotter à la surface, puis évitez de les transférer sur la lame.

À l’aide de la micropipette, distribuez les organoïdes avec le milieu de montage en ligne le long du centre d’une lame de microscope. Ensuite, placez soigneusement un verre de couverture sur le dessus et évitez de générer des bulles. Placez la lame de verre dans un livre de diapositives et conservez-la toute la nuit au réfrigérateur pour que le support de montage prenne avant de l’analyser sur un microscope confocal.

On voit ici des images de la fraction deux de tissu isolé de l’intestin grêle contenant à la fois des villosités et des cryptes et un échantillon de la fraction trois contenant principalement des cryptes. Comme on le voit sur ces images, une bonne conservation et un bon marquage des microtubules et de l’actine dans les villosités et les cryptes ont été obtenus grâce au protocole de fixation et d’immunomarquage au formaldéhyde et au méthanol décrit dans cette vidéo. Des organoïdes de l’intestin grêle ont été générés et cultivés dans la matrice basale pendant trois semaines ou plus, puis isolés comme le montre cette vidéo.

Les cellules différenciées au sein des domaines des villosités organoïdes contiennent des microtubules apicobasaux stables qui ont été bien marqués dans la plupart des cas. EB1 pouvait également être observé le long du réseau des microtubules. On voit ici un organoïde au stade de kyste et à un stade précoce du développement des cryptes.

Les deux échantillons ont été fixés dans du méthanol de formaldéhyde et immunomarqués pour les microtubules et le ninein, ce qui démontre une bonne conservation des microtubules et un bon marquage dans les centres d’organisation des microtubules apicaux non centrosomaux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée avec plusieurs échantillons et sur deux jours. Lors de cette procédure, il est important de gratter soigneusement les puits lors de la collecte des organoïdes pour éviter de perturber leur structure 3D.

Soyez également prudent lors de l’ajout ou du retrait de solutions pour éviter la perte d’organoïdes tout au long de la procédure de coloration. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fixer, d’immunomarquer et de monter des organoïdes isolés et d’autres structures épithéliales telles que les cryptes intestinales. N’oubliez pas que l’utilisation de réactifs fixateurs dans cette procédure peut être extrêmement dangereuse.

Des évaluations des risques de cette procédure doivent être effectuées et des mesures de confinement appropriées et des EPI doivent toujours être pris lors de l’exécution de cette procédure.