Techniques pour induire et Quantifier cellulaire sénescence

L’objectif global de ces techniques est de fournir une boîte à outils pour permettre l’induction, la surveillance et la quantification de la sénescence cellulaire. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés sur l’identification et la quantification de la sénescence cellulaire et les facteurs biologiques qui régulent le vieillissement cellulaire et organique. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles englobent une variété de méthodes pour surveiller la sénescence cellulaire dans différents modèles, tissus et types de cellules.

Commencez par plaquer les cellules prolifératives d’intérêt à passage précoce à une densité clairsemée dans la boîte appropriée pour l’analyse. Et cultivez les cellules pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire. Lorsque les cellules sont confluentes à 50-60 %, aspirez le milieu de croissance et lavez les cellules avec du PBS deux fois.

Après le deuxième lavage, recouvrez les cellules d’une fine couche de PBS. Et exposez les cellules à une dose unique de 10 degrés d’irradiation gamma. Remplacez le PBS par un milieu de croissance.

Et retournez les cellules dans l’incubateur. Changement de milieu toutes les 48 à 72 heures avec surveillance quotidienne des changements morphologiques au microscope optique. Sept à 10 jours après l’irradiation, décongeler tous les réactifs d’un kit commercial de dosage de la bêta-galactosidase associée à la sénescence dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Lorsque tous les réactifs atteignent la température ambiante, préparez les solutions de fixateur et de coloration selon les instructions du fabricant. Et lavez doucement chacun avec du PBS à température ambiante. Prenez soin de rincer soigneusement les cellules car les cellules de sénescence n’adhèrent pas bien et peuvent être facilement éliminées lors des lavages.

Fixez les cellules de chaque puits avec un millilitre de solution fixatrice par puits pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Suivi de deux lavages de deux millilitres avec PBS par puits. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de coloration à la bêta-galactosidase dans chaque puits et couvrez la plaque de papier d’aluminium pour une culture de 24 à 48 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone.

Vérifiez les cellules à 24 heures. Lorsque les cellules sont suffisamment colorées, remplacez la solution bêta-gal par du PBS frais et examinez les cultures au microscope optique avec une caméra attachée à un objectif 10x ou plus. Les cellules bêta-galactosidases associées à la sénescence apparaîtront bleues.

Ensuite, obtenez au moins cinq images non superposées par puits. Et comptez manuellement le nombre total de cellules bêta-galactosidase positives associées à la sénescence et le nombre total de cellules par image pour calculer le pourcentage de cellules bêta-galactosidase associées à la sénescence par puits. 10 jours après l’irradiation gamma, lavez les cellules trois fois avec du PBS.

Après le dernier lavage, remplacez le PBS par 2,5 millilitres de milieu exempt de sérum, complété par des antibiotiques par boîte de six centimètres et remettez les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez le fluide dans un tube conique sur de la glace. Et lavez les cellules deux fois avec du PBS frais.

Ensuite, essayez de le faire et comptez les cellules. Ensuite, centrifugez le surnageant récolté sur la plaque de culture cellulaire. Ensuite, filtrez-le à travers une passoire à seringue de 0,45 micromètre et congelez le milieu dans des aliquotes de 500 microlitres à 80 degrés Celsius jusqu’à leur analyse par ELISA.

Une augmentation de la sénescence associée à la coloration bêta-gal se produit avec la sénescence réplicative et induite par des dommages à l’ADN. Notez la forme plate élargie des cellules sénescentes par rapport à l’aspect fusiforme des fibroblastes proliférants. Dans cette expérience, des cellules sénescentes jeunes ou répliquatives proliférantes ont été fixées comme décrit dans le protocole écrit.

Et coloré avec un anticorps contre un biomarqueur pour les cassures double brin de l’ADN et le DAPI. Avec une augmentation apparente du nombre de cassures double brin d’ADN observées dans les cellules sénescentes. L’analyse RT-qPCR des facteurs phénotypiques sécrétoires associés à la sénescence révèle qu’au moins certains facteurs sont régulés à la hausse après la sénescence induite par l’irradiation gamma dans les fibroblastes diploïdes humains à faible passage au niveau de l’ARNm.

Ce qui est encore confirmé par l’ELISA des surnageants de culture cellulaire irradiés aux rayons gamma. Une fois maîtrisés, l’induction des dommages à l’ADN et la coloration au bêta-gal SA peuvent être réalisées en environ 30 minutes de temps de manipulation. Les milieux de condition pour quantifier les niveaux de protéines SASP peuvent être préparés en 30 minutes environ.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de les surveiller subissant des changements morphologiques dans les cultures cellulaires avant de procéder à la quantification des marqueurs sénescents. Après leur développement, ces techniques ont ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines du vieillissement et du cancer pour explorer la sénescence dans une variété de tissus, de cultures cellulaires et d’organismes modèles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire, de surveiller et de quantifier la sénescence cellulaire.