Name: Techniques pour induire et Quantifier cellulaire sénescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Découvrez des protocoles pour induire et quantifier la sénescence cellulaire en biologie cellulaire. Ces méthodes permettent de surveiller les marqueurs de sénescence et d'étudier les facteurs biologiques du vieillissement.

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Cette étude a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros des Instituts nationaux de la santé, l&#39;Institut national sur le vieillissement. Les auteurs tiennent à remercier Myriam Gorospe et Kotb Abdelmohsen pour de nombreuses discussions utiles sur la sénescence et Kotb Abdelmohsen pour la lecture aussi critique du manuscrit. Nous remercions également les membres de notre laboratoire, en particulier Douglas Dluzen pour la lecture critique du manuscrit.

<ol><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Dimri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Pospelova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudo-DNA+damage+response+in+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Pseudo-DNA damage response in senescent cells.</a> Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).</li>
<li>Narita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb-mediated+heterochromatin+formation+and+silencing+of+E2F+target+genes+during+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence.</a> Cell. 113 (6), 703-716 (2003).</li>
<li>Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signals+and+pathways+activating+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signals and pathways activating cellular senescence.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%2C+tumor+suppression%2C+and+organismal+aging%3A+good+citizens%2C+bad+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors.</a> Cell. 120 (4), 513-522 (2005).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Tominaga-Yamanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+coordinately+represses+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype.</a> Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunction+Induces+Senescence+with+a+Distinct+Secretory+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype.</a> Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Hoare, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOTCH1+mediates+a+switch+between+two+distinct+secretomes+during+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence.</a> Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).</li>
<li>Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+senescence-associated+secretory+phenotype+%28SASP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP).</a> Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).</li>
<li>Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+microRNAs%3A+individual+gene+repressors%2C+global+translation+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers.</a> Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).</li>
<li>Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+control+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA control of cellular senescence.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).</li>
<li>Bhaumik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-146a%2Fb+negatively+modulate+the+senescence-associated+inflammatory+mediators+IL-6+and+IL-8%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8.</a> Aging. 1 (4), 402-411 (2009).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-SCARS%3A+distinct+nuclear+structures+that+sustain+damage-induced+senescence+growth+arrest+and+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion.</a> J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).</li>
<li>Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cell+and+organ+senescence+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Assessing cell and organ senescence biomarkers.</a> Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Rubio, M. A., Kim, S. -H., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Manipulation+of+Telomerase+Expression+and+Telomere+Length%3A+implications+for+the+ionizing+radiation+response+and+replicative+senescence+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells.</a> J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).</li>
<li>Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Senescent+Phenotype+from+Telomere+Shortening+in+Hydrogen+Peroxide-Treated+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts.</a> Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cell+Senescence+in+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Nyunoya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+Smoke+Induces+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence.</a> J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).</li>
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<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
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<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Essential+Role+for+Senescent+Cells+in+Optimal+Wound+Healing+through+Secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin-mediated+increase+in+DICER1+regulates+microRNA+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence.</a> Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).</li>
<li>Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+as+a+Tool+to+Target+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin as a Tool to Target Aging.</a> Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).</li>
<li>Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin%3A+from+mechanisms+of+action+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin: from mechanisms of action to therapies.</a> Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).</li>
<li>Cahu, J., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+to+quantify+senescent+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A sensitive method to quantify senescent cancer cells.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+detection+of+senescence-associated+beta+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase.</a> Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).</li>
<li>Redon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+detection+in+peripheral+blood+lymphocytes%2C+splenocytes%2C+bone+marrow%2C+xenografts%2C+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin.</a> Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Kennedy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+mouse+cells+fail+to+overtly+regulate+the+HIRA+histone+chaperone+and+do+not+form+robust+Senescence+Associated+Heterochromatin+Foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci.</a> Cell Div. 5, 16(2010).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ici, nous avons décrit des méthodes pour réplicative induite et l&#39;ADN des dommages sénescence en utilisant des fibroblastes diploïdes humains. En outre, les techniques de quantification de la protéine et les taux d&#39;ARNm de différentes protéines associées à la sénescence sont incluses, ainsi que pour la coloration SA-β-gal et pour le marqueur d&#39;ADN dommages γ-H2AX. Ces protocoles peuvent être largement utilisés pour évaluer phénotypes sénescentes in vitro et in vivo, bien que de nombreuses m...

Il y a plus d&#39; un demi - siècle, Hayflick et ses collègues ont décrit comment les cellules prolifèrent dans la culture non transformée, mais seulement pour une période de temps limitée 1. la culture à long terme des fibroblastes humains a provoqué les cellules pour arrêter la prolifération; cependant, ils étaient métaboliquement actifs, ce qui a été appelé sénescence cellulaire. Sénescence peut être bénéfique pour inhiber la tumorigenèse, mais il peut aussi être préjudiciable, car on pense contribuer à la perte de la capacité de régénération qui se produit avec le vieillissement 2, 3. Les cellules sénescentes ont été montré à accumuler dans les tissus humains comme 4 ans et ont été impliqués dans un certain nombre de processus biologiques, y compris le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, la réparation des tissus et l&#39; inflammation liée à l&#39; âge 2. repiquage continue des cellules en culture induit la sénescence réplicative, qui a été liéeà télomère attrition et de l&#39;instabilité génomique. Divers stress cellulaires, y compris les lésions de l&#39; ADN et des oncogènes, peuvent également provoquer la sénescence 3. Sénescence causés par des facteurs autres que l&#39; attrition des télomères est souvent appelé sénescence induite par le stress ou prématurée et dépend généralement de la voie INK4A / Rb p16 5. Bien que la prolifération, les cellules non transformées apparaissent généralement broche en forme, des cellules sénescentes peuvent être identifiés comme ayant certaines caractéristiques, comprenant un plat, une grande morphologie et augmentation de l&#39; activité β-galactosidase associé à la sénescence (SA-β-gal) (figures 1 et 2). Les cellules sénescentes accumulent également ADN marqueurs de dégâts, y compris γ-H2AX (Figure 3) 6, et, éventuellement, des foyers d&#39;hétérochromatine associée sénescence (SAHF) (Figure 4) 7. Les cellules sénescentes ont des niveaux plus élevés de régulateurs du cycle cellulaire, y compris les p<html> 16 (p16 INK4A) et / ou p21 et p53 (Figure 5) 8, 9. De plus, des données récentes ont montré que les cellules sénescentes peuvent avoir des effets non autonomes en sécrétant un certain nombre de cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines appelé le phénotype sécrétoire associée sénescence (SASP) 10. Bien que ce phénomène de SASP peut varier d&#39;un type de cellule du type de cellule, en général, il est démontré par une augmentation de l&#39;interleukine-6 ​​(IL-6), IL-8, les colonies de granulocytes-macrophages facteur de stimulation (GM-CSF), growth- réglementé oncogène α (GRO-α), et GRO-β, entre autres (Figure 6). La contrainte particulière ou des dommages qui induit sénescence peuvent également influencer le phénotype sécrétoire 11, 12, 13. SASP peut être détectée en mesurant les niveaux de protéines sécrétées à l&#39;aide de tests ELISA ou des réseaux cytokine / protéines = &quot;xref&quot;&gt; 10, 14. Bien que les mécanismes post-transcriptionnel peuvent réguler les taux de protéines 11, 15 SASP, 16, 17, des changements dans de nombreux cas peuvent également être détectés dans les niveaux d&#39; ARNm. Ces changements sont généralement plus sensibles et plus faciles à quantifier que les mesures de niveau de protéines. D&#39; autres marqueurs de sénescence peuvent également être évalués, y compris les lésions de l&#39; ADN nucléaire persistante foyers, appelés segments d&#39;ADN avec des altérations de la chromatine de renfort sénescence (ADN-CICATRICES) 18 et divers autres marqueurs 3, 19, 20. Ici, nous décrivons des techniques communes pour induire la sénescence dans les cellules en culture et aussi pour mesurer plusieurs marqueurs de sénescence, y compris SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, et la protéine et l&#39;ARNm de sénescencence molécules-associé.

<table><tbody><tr><td>16 % Tris-glycine gels</td><td>Invitrogen</td><td>XP00160BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acide-Phénol ChCl3</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 568 chèvre anti-souris</td><td>Anticorps Invitrogen</td><td>A11031</td><td>dilution 1:300</td></tr><tr><td>Élévateurs de cellules</td><td>Corning Inc.</td><td>3008</td><td>Racleur</td></tr><tr><td>cellulaire ECL anti-souris HRP anticorps</td><td>lié Amersham</td><td>NA931V</td><td></td></tr><tr><td>ECL Plus Western Blot Substrate</td><td>Pierce</td><td>32132</td><td>ECL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sondes moléculaires</td><td>MP01306</td><td>stock 5 mg/mL en dH2O</td></tr><tr><td>GAPDH Anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32233</td><td>1:1 000 - 5 000</td></tr><tr><td>dilution GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3 diméthyl K9 anticorps monoclonal</td><td>Abcam</td><td>1220</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Essai ELISA de l’IL-6 Quantikine humaine</td><td>R& D systems</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Essai ELISA de l’IL-8 Quantikine humaine</td><td>R& D systems</td><td>D8000C</td><td></td></tr><tr><td>Human GROa Quantikine ELISA test</td><td>R& D systems</td><td>DRG00</td><td></td></tr><tr><td>N-N-diméthylformamide&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td>DMF</td></tr><tr><td>p16 anticorps monoclonal</td><td>BD Biosciences</td><td>51-1325gr</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>p21 anticorps monoclonal</td><td>Millipore</td><td>05-345</td><td>dilution 1:750</td></tr><tr><td>p53 anticorps monoclonal</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>clone de dilution 1:500 DO-1</td></tr><tr><td>phospho-H2AX (Ser139) Anticorps conjugué FITC</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9719</td><td>1:2 000 dilution</td></tr><tr><td>POWER SYBR-green PCR master mix&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Marqueurs de poids moléculaire pré-colorés</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade&nbsp ;</td><td>Membrane PVDF Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration de la sénescence &bêta ;-galactosidase</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion/Life Tech</td><td>10296028</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques pour induire et quantifier cellulaire sénescence

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

En réponse au stress cellulaire ou les dommages, les cellules qui prolifèrent peuvent induire un programme spécifique qui déclenche un état d&#39;arrêt du cycle cellulaire à long terme, appelé sénescence cellulaire. L&#39; accumulation de cellules sénescentes se produit avec le vieillissement organismal et par mise en culture continue in vitro. Les cellules sénescentes influencent de nombreux processus biologiques, y compris le développement embryonnaire, la réparation et la régénération des tissus, la suppression des tumeurs et le vieillissement. Poinçons de cellules sénescentes comprennent, mais sans s&#39;y limiter, l&#39;augmentation de l&#39;activité β-galactosidase associée sénescence (SA-β-gal); p16 INK4a, p53 et p21 niveaux; des niveaux plus élevés de dommages à l&#39;ADN, y compris les γ-H2AX; la formation d&#39;hétérochromatine associée à la sénescence Foci (SAHF); et l&#39;acquisition d&#39;une sécrétoire associée sénescence Phénotype (SASP), un phénomène caractérisé par la sécrétion d&#39;un certain nombre de cytokines pro-inflammatoires et des molécules de signalisation. Ici, nous décrivons les protocoles pour les réplicative etADN sénescence dommages induits dans les cellules en culture. De plus, nous mettons en évidence des techniques pour surveiller le phénotype sénescent en utilisant plusieurs marqueurs associés à la sénescence, y compris SA-β-gal, γ-H2AX et la coloration SAHF, et de quantifier les niveaux de protéines et d&#39;ARNm des régulateurs du cycle cellulaire et les facteurs SASP. Ces méthodes peuvent être appliquées à l&#39;évaluation de la sénescence dans divers modèles et tissus.

Les figures 2 - 6 montrent des résultats représentatifs de coloration SA-β-gal; coloration pour la γ-H2AX et SAHF; l&#39; évaluation des niveaux de protéines de p16 INK4a p21 et p53; et de l&#39;ARNm et des protéines de molécules sénescentes associée. Une coloration accrue SA-β-gal se produit avec réplicatif et de l&#39;ADN de la sénescence induite par endommagement. En outre, observer les changements morphologiques qui se produisent à la sénescence. Les cellu...

Cellulaire sénescence, l&#39;état irréversible de l&#39;arrêt du cycle cellulaire, peut être induite par diverses contraintes cellulaires. Ici, nous décrivons les protocoles pour induire la sénescence cellulaire et des méthodes pour évaluer les marqueurs de sénescence.

Techniques pour induire et Quantifier cellulaire sénescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

L’objectif global de ces techniques est de fournir une boîte à outils pour permettre l’induction, la surveillance et la quantification de la sénescence cellulaire. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés sur l’identification et la quantification de la sénescence cellulaire et les facteurs biologiques qui régulent le vieillissement cellulaire et organique. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles englobent une variété de méthodes pour surveiller la sénescence cellulaire dans différents modèles, tissus et types de cellules.Commencez par plaquer les cellules prolifératives d’intérêt à passage précoce à une densité clairsemée dans la boîte appropriée pour l’analyse. Et cultivez les cellules pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire. Lorsque les cellules sont confluentes à 50-60 %, aspirez le milieu de croissance et lavez les cellules avec du PBS deux fois.Après le deuxième lavage, recouvrez les cellules d’une fine couche de PBS. Et exposez les cellules à une dose unique de 10 degrés d’irradiation gamma. Remplacez le PBS par un milieu de croissance.Et retournez les cellules dans l’incubateur. Changement de milieu toutes les 48 à 72 heures av

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Techniques pour induire et Quantifier cellulaire sénescence

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