Une méthode d'agrégation cellulaire efficace et flexible pour 3D Spheroid production

NARRATEUR L'objectif général de cette méthode est de produire efficacement de grandes quantités de sphéroïdes cellulaires robustes par agrégation cellulaire, afin de les utiliser dans divers tests cellulaires. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation d'une matrice hydrosoluble non protéique pour l'agrégation cellulaire et la formation de sphéroïdes, ce qui permet une isolation facile et rapide des sphéroïdes. Cette méthode peut aider à obtenir de nouvelles connaissances en biologie cellulaire sur les effets des interactions cellule-cellule et cellule/matrice sur la croissance tissulaire dans un microenvironnement tridimensionnel.

NARRATEUR Avant de préparer les agrégats, chauffer 50 millilitres d'eau ultrapure à 80 degrés Celsius et ajouter 10 grammes de poudre de méthylcellulose. Agiter la suspension jusqu'à ce que les particules soient uniformément dispersées. Puis ajouter de l'eau ultrapure froide jusqu'à un volume final de 100 millilitres, et conserver la suspension toute la nuit à 4 degrés Celsius jusqu'à ce que la solution devienne limpide et de couleur jaune paille, sans solides visibles.

Filtrer la solution à travers un filtre de 0,45 micromètre pour éliminer les fragments non dissous, puis diluer au 1:5 milligrammes par millilitre de la solution filtrée dans le milieu de culture approprié. Ensuite, filtrer le milieu supplémenté en méthylcellulose à l’aide d’un tamis de 0,22 micromètre. Puis, dans une cabine de sécurité biologique, laver une sous-culture à 70 % de confluence avec du PBS et détacher les cellules à l’aide de trois millilitres de tampon d’association Trypsine-EDTA dans une incubateur de culture cellulaire.

Après quelques minutes, examiner les cellules au microscope optique avec un objectif de 10x. Lorsque les cellules se sont détachées de la plaque, neutraliser la réaction avec sept millilitres de milieu de culture supplémenté en sérum. Transférer la solution cellulaire dans un tube neuf de 15 millilitres, puis recueillir les cellules libérées par centrifugation.

La cause la plus fréquente d'une formation infructueuse de sphéroïdes, outre la présence de particules contaminantes, est l'utilisation de concentrations sous-optimales de méthylcellulose ou de sérum pour l'agrégation et la croissance de votre lignée cellulaire spécifique. NARRATEUR—À l’aide d’une micropipette P1000 équipée d’une pointe filtrante, triturez le culot trois à cinq fois avec un millilitre de milieu de formation des sphéroïdes, en appuyant la pointe de la pipette contre le fond du tube selon un léger angle, tout en pipetant lentement sans expulser entièrement le contenu de la pointe afin de cisaillement le culot. Après le comptage, diluez la suspension cellulaire à une concentration de un fois dix puissance quatre cellules par millilitre, puis rincez un réservoir stérile pour pipette multicanal avec de l’eau ultrapure filtrée afin d’éliminer toute poussière et fibre.

Dispenser les cellules dans le réservoir et utiliser des pointes filtrantes pour transférer 100 microlitres de cellules dans chaque puits d'une plaque en U à 96 puits et à surface répulsive pour les cellules, en mélangeant périodiquement la suspension cellulaire afin d'empêcher les cellules de se déposer au fond du réservoir. Une fois que toutes les cellules se sont déposées, placer la plaque dans un incubateur à culture tissulaire et inspecter quotidiennement les puits pour vérifier la formation de sphéroïdes. Les cellules doivent se déposer au fond de chaque puits dans les six heures et s'agréger généralement en un sphéroïde dans un délai de 24 à 48 heures.

Pour confirmer la formation d'un sphéroïde réussi, utilisez une pipette P10 sous un microscope optique pour prélever doucement le milieu au-dessus du sphéroïde. Les sphéroïdes correctement formés se détacheront de la plaque et rouleront, confirmant ainsi leur structure tridimensionnelle. Pour intégrer les sphéroïdes dans du collagène, utilisez la pipetage inverse afin de recouvrir uniformément le fond de chaque puits d'une lame à chambres de culture tissulaire à huit puits avec au minimum 50 microlitres de collagène neutralisé par puits.

Lorsque tous les puits ont été recouverts, placer la lame à chambre dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres remplie d'eau ultrapure et placée dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres, puis incuber la boîte de culture tissulaire de 10 centimètres à 37 degrés Celsius pendant environ une heure. Une fois le collagène polymérisé, utiliser une pointe filtrante P1000 pour transférer délicatement les sphéroïdes préformés dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre. Il est essentiel d'incuber les couches de base de collagène jusqu'à ce qu'elles soient complètement polymérisées afin d'éviter de perturber le collagène lors de l'ajout des sphéroïdes ou du milieu.

Narrateur : Collectez les sphéroïdes récoltés dans une microcentrifugeuse de table et utilisez une pipette P200 pour éliminer les surnageants, en absorbant tout excès de surnageant par retournement du tube sur une serviette en papier propre si nécessaire. À l’aide d’une pointe de pipette P200 à grand orifice, resuspendez immédiatement les sphéroïdes dans 50 microlitres de collagène neutralisé et transférez délicatement les mélanges de sphéroïdes et de collagène dans chaque puits de la lame à chambre de culture tissulaire à huit puits. Replacez la lame dans l’incubateur jusqu’à polymérisation du collagène.

Après environ une heure, ajoutez lentement au moins 100 microlitres de milieu de culture réchauffé contenant le traitement approprié d'intérêt à chaque puits pour une autre période d'incubation. Ensuite, utilisez un microscope à fluorescence pour acquérir des sections d'imagerie optique à travers les sphéroïdes envahissants. Grâce à ce protocole, des sphéroïdes peuvent être générés à partir d'une variété de lignées cellulaires.

Dans des conditions appropriées de méthylcellulose et de traitement au sérum, les cellules individuelles se déposent et adhèrent ensemble au centre du puits pour former des sphéroïdes avec une adhérence minimale au fond du puits. Certaines lignées cellulaires sont capables d'adhérer à des plaques répulsives pour les cellules en l'absence ou à de faibles concentrations de méthylcellulose, ce qui entraîne la formation d'un sphéroïde entouré d'une monocouche cellulaire. En général, des concentrations plus élevées de méthylcellulose empêchent les cellules d'adhérer au puits.

Mais une concentration trop élevée de méthylcellulose réduit l'adhésion entre les cellules et empêche celles-ci de se déposer au fond du puits, ce qui entraîne la formation d'agrégats lâches et de nombreux sphéroïdes satellites. Les sphéroïdes inclus dans le collagène peuvent être traités avec un chémoattractant afin d'induire l'invasion de cellules individuelles à partir du sphéroïde vers la matrice environnante. Les sphéroïdes inclus dans le collagène, une fois fixés, peuvent être observés en microscopie à champ clair pour quantifier la distance et le nombre de cellules envahissantes, ou en microscopie en immunofluorescence afin de visualiser les structures invasives formées par les cellules migratrices.

Il est important de laisser suffisamment de temps aux cellules pour qu'elles s'agrègent en sphéroïdes structurellement solides, suffisamment robustes pour être manipulés sans se fragmenter, et pouvant être facilement collectés pour être utilisés dans des tests ultérieurs. Notre protocole de croissance cellulaire peut être davantage adapté à de multiples tests en biologie cellulaire. Par exemple, la mise en place des cellules dans des milieux supplémentés avec des concentrations élevées de méthylcellulose peut être utilisée pour évaluer la résistance cellanoïque.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment générer des sphéroïdes cellulaires tridimensionnels par agrégation, une méthode qui constituera un outil précieux pour de nombreuses applications en biologie cellulaire.