Name: Une méthode dagrégation cellulaire efficace et flexible pour 3D Spheroid production (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Découvrez une méthode rapide et flexible pour produire des sphéroïdes cellulaires 3D par agrégation. Cette technique utilise une matrice de méthylcellulose non protéique pour faciliter l'isolation des sphéroïdes.

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Les auteurs remercient M. Gordon du Centre d’imagerie biomédicale de l’Université Queen’s pour son aide. Ces travaux ont été financés par des subventions de fonctionnement de la Société de recherche sur le cancer du Canada (19439) et des Instituts de recherche en santé du Canada (MOP-142303) (LMM), ainsi que par des bourses d’études supérieures de l’Ontario et des bourses d’études du Programme de formation en recherche transdisciplinaire sur le cancer de l’Institut de recherche Terry Fox (SMM, AEL), ainsi que par une bourse d’été Craig Jury.

<ol><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li>
<li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27chemoinvasion%27+assay%2C+25+years+and+still+going+strong%3A+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+for+tissue+engineering+and+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. (51), (2011).</li>
<li>Handschel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+of+micromass+culture+technology+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Face+Med%22%5BJournal%5D)">Prospects of micromass culture technology in tissue engineering.</a> Head Face Med. 3, 4(2007).</li>
<li>Stuckhoff, A. P., DelValle, L. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9781627036399">Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology</a>. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).</li>
<li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells%3A+How+to+go+three-dimensional%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons un procédé rapide et flexible pour la production de cellules sphéroïdes 3D pour modéliser l&#39;architecture des tissus in vivo en utilisant des réactifs peu coûteux et largement disponibles. Notre protocole exploite les propriétés non-cytotoxiques et favorisant l&#39; adhésion de MC 8, 9 de médiation agrégation cellulaire et minimiser la formation de monocouche cellulaire. A la différence des matrices à base de protéines isolées à parti...

Évaluation Biologiquement pertinente du comportement des cellules tumorales est difficile en utilisant traditionnelle en deux dimensions (2D) méthodologies de culture cellulaire, en partie parce que ceux-ci ne reflètent pas de manière adéquate le microenvironnement cellulaire trouvé in vivo. Des approches alternatives comprenant des composants de la matrice extracellulaire dans la culture (par exemple, les dosages de la chambre de Boyden) sont représentatifs de plus de vue physiologique in vivo dans l&#39; environnement tissulaire. Cependant, elles peuvent être limitées à une évaluation du comportement des cellules individuelles et ne sont pas récapituler le complexe en association in vivo des interactions cellule-matrice et cellule-cellule qui contribuent à la croissance du tissu ou de la tumeur 1, 2, 3. L&#39;utilisation des sphéroïdes multicellulaires est une approche récente qui reproduit plus fidèlement l&#39;architecture compacte de la croissance cellulaire in vivo en 1,4. Sphéroïdes peuvent être utilisées pour étudier les interactions cellule-matrice de cellules normales, mais elles peuvent également agir comme des analogues de la tumeur pour modéliser les caractéristiques de la progression tumorale, comme la croissance métastatique ou la résistance aux médicaments 4. Sphéroïdes peuvent être formés par la prolifération des cellules isolées noyées dans une matrice 5, ou plus rapidement, en favorisant l&#39;agrégation des cellules multiples pour former un groupe unique de cellules (par exemple, goutte suspendue, des procédés de centrifugation) 6, 7. Les techniques actuelles d&#39;agrégation cellulaire peuvent nécessiter des matériaux coûteux ou d&#39;équipements spécialisés. En outre, ces sphéroïdes ont un large éventail de tailles et de morphologies et peuvent être difficiles à produire en grandes quantités, ce qui rend les comparaisons entre les conditions de croissance ou traitements difficiles. Enfin, sphéroïdes générés par ces méthodes peuvent être difficiles à isoler du extracel protéiniquematrice lular dans laquelle ils sont intégrés pour une utilisation dans d&#39;autres applications. Ici, nous décrivons une méthode d&#39;agrégation cellulaire robuste et facilement modifiable pour la formation rapide de sphéroïdes de cellules de taille uniforme en utilisant des plaques disponibles dans le commerce à fond en U cellulaire hydrophobe et une matrice inerte favorisant l&#39;adhérence, la cellulose de méthyle. Une fois formés, ces sphéroïdes multicellulaires sont facilement isolées pour une utilisation dans un large éventail d&#39;applications. Le protocole est également facilement adaptée pour générer des sphéroïdes par le biais de la prolifération cellulaire, qui peuvent être utilisés pour évaluer d&#39;autres processus cellulaires. Ici, nous montrons des essais d&#39;invasion cellulaire, quantifiés par immunofluorescence, et un essai de anoikis, comme exemples d&#39;applications de ces deux protocoles de formation sphéroïde différents.

<table><tbody><tr><td><Tampons>forts</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Saline tamponnée au phosphate</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Solution de chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>Utilisé pour le tampon de lavage PBS+ ; Ne pas autoclaver le tampon de lavage PBS+ après ajout de chlorure de calcium</td></tr><tr><td>Solution de chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Utilisé pour le tampon de lavage PBS+ ; Ne pas autoclaver le tampon de lavage PBS+ après ajout de chlorure de magnésium</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>For Spheroid Formation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom Cell-Repellent Plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>Pour l’élevage de lignées cellulaires SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>Pour l’élevage d’une lignée cellulaire TT</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>Filtre avant utilisation pour éliminer les contaminants particulaires</td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>Préparer dans l’eau à 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Pour la culture de lignées cellulaires HCT-116, BxPC-3</td></tr><tr><td>TrypLE Express Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>Tampon de dissociation</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>For Invasion Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Type I Collagen</td><td>Corning Incorporated</td><td>354231</td><td>Stock 3,1 mg/mL ; Maintenir sur la glace lors de l’utilisation</td></tr><tr><td>DMEM Phenol Red Free Low Glucose&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>Moins de fluorescence de fond par rapport au milieu supplémenté en rouge de phénol</td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Chimioattractant</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Pour la microscopie d’immunofluorescence</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverglass</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72225-01</td><td>Pour le montage de sphéroïdes excisés</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Utilisé pour colorer l’actine à 1:200</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>Utilisé dans le tampon de blocage BSA</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td><td>Antifade</td></tr><tr><td>Glycérol&nbsp ;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>Utilisé dans le support de montage MOWIOL</td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td>Freeware, NIH-Utilisé</td><td></td> <td>pour l’analyse d’images&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microlames</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>Pour le montage de sphéroïdes excisés</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>Utilisé dans le milieu de montage MOWIOL</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde&nbsp ;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>Utilisé dans le tampon de fixation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>Utilisé dans le tampon de perméabilisation</td></tr></tbody></table>

une méthode d&#39;agrégation cellulaire efficace et flexible pour 3d spheroid production

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

La culture de cellules monocouches ne modélise pas adéquatement le comportement in vivo des tissus, ce qui implique des interactions cellule-cellule et cellule-matrice complexes. Trois dimensions techniques de culture (3D) des cellules sont une innovation récente développée pour remédier aux insuffisances de la culture de cellules adhérentes. Bien que plusieurs techniques pour générer des analogues de tissus in vitro ont été mis au point, ces méthodes sont souvent complexes, coûteux à mettre en place, nécessitent un équipement spécialisé, et sont généralement limités par la compatibilité avec seulement certains types de cellules. Ici, nous décrivons un protocole rapide et flexible pour l&#39;agrégation des cellules en sphéroïdes multicellulaires 3D de taille uniforme qui est compatible avec la croissance d&#39;une variété de tumeurs et de lignées cellulaires normales. Nous utilisons des concentrations variables de sérum et la méthylcellulose (MC) afin de promouvoir un ancrage indépendant de la génération sphéroïde et éviter la formation de monocouches de cellules d&#39;une manière hautement reproductible. Les conditions optimales pour individual lignées cellulaires peuvent être obtenues en ajustant les MC ou les concentrations sériques dans le milieu de formation de sphéroïde. Les sphéroïdes 3D générées peuvent être collectées pour une utilisation dans une large gamme d&#39;applications, y compris la signalisation cellulaire ou des études d&#39;expression de gènes, le criblage de médicaments candidats ou pour l&#39;étude des processus cellulaires tels que l&#39;invasion des cellules tumorales et la migration. Le protocole est également facilement adaptée pour générer des sphéroïdes clonale à partir de cellules simples, et peut être adapté pour évaluer la croissance indépendante de l&#39;ancrage et anoïkose résistance. Dans l&#39; ensemble, notre protocole fournit une méthode facilement modifiable pour produire et utiliser des sphéroïdes de cellules 3D afin de récapituler le micro - environnement 3D de tissus et de modéliser la croissance in vivo des cellules normales et tumorales.

Nous décrivons une méthode souple et efficace pour générer des sphéroïdes discrets en utilisant des plaques de cellules répulsifs et des médias de formation sphéroïde complétées par MC. Dans les conditions appropriées de MC et le sérum, les cellules individuelles se déposent et adhèrent ensemble au centre du puits pour former des sphéroïdes avec adhérence minimale au fond du puits. En utilisant ce protocole, les sphéroïdes ont été générées à partir d&#39; une variété de lignées cellulair...

Ici, nous décrivons un protocole rapide et flexible pour la formation de sphéroïdes cellulaires 3D par agrégation cellulaire. Il s’adapte facilement à plusieurs types de cellules et peut être utilisé dans une variété d’applications, notamment la migration cellulaire, l’invasion ou les tests d’anoïkis, ainsi que pour l’imagerie et la quantification des interactions cellule-matrice.

Une méthode d&#39;agrégation cellulaire efficace et flexible pour 3D Spheroid production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

NARRATEUR L'objectif général de cette méthode est de produire efficacement de grandes quantités de sphéroïdes cellulaires robustes par agrégation cellulaire, afin de les utiliser dans divers tests cellulaires. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation d'une matrice hydrosoluble non protéique pour l'agrégation cellulaire et la formation de sphéroïdes, ce qui permet une isolation facile et rapide des sphéroïdes. Cette méthode peut aider à obtenir de nouvelles connaissances en biologie cellulaire sur les effets des interactions cellule-cellule et cellule/matrice sur la croissance tissulaire dans un microenvironnement tridimensionnel.NARRATEUR Avant de préparer les agrégats, chauffer 50 millilitres d'eau ultrapure à 80 degrés Celsius et ajouter 10 grammes de poudre de méthylcellulose. Agiter la suspension jusqu'à ce que les particules soient uniformément dispersées. Puis ajouter de l'eau ultrapure froide jusqu'à un volume final de 100 millilitres, et conserver la suspension toute la nuit à 4 degrés Celsius jusqu'à ce que la solution devienne limpide et de couleur jaune paille, sans solides visibles.Filtrer la solution à travers un filtre de 0,45 micromètre pour

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Nous décrivons une méthode simple et rapide de générer des tissus 3D-like sphéroïdes et leur application potentielle de quantifier les différences dans les interactions cellule-cellule.

Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

Les sphéroïdes sont un type de modèle de culture cellulaire 3D utilisé pour représenter plus précisément l’environnement d’une cellule par rapport aux modèles monocouches de culture cellulaire 2D. Dans l’exemple de protocole, nous verrons les scientifiques générer des sphéroïdes à partir d’une lignée cellulaire de cancer colorectal et appliquer l’imagerie de cellules vivantes pour suivre la croissance des sphéroïdes.

Génération de sphéroïdes à partir de lignées cellulaires : une méthode de culture cellulaire tridimensionnelle (3D)

Nous présentons un dispositif microfluidique centrifuge à moteur qui peut cultiver des sphéroïdes cellulaires. À l'aide de cet appareil, les sphéroïdes de types de cellules simples ou multiples pourraient être facilement cocultivés dans des conditions de haute gravité.

Plateforme Lab-on-a-CD pour générer des sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels

Ici, nous décrivons la production à grande échelle de sphéroïdes stromaux / cellules souches (ASC) dérivés des adipeux à l’aide d’un système de pipetage automatisé pour ensemencer la suspension cellulaire, assurant ainsi l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes. Ces sphéroïdes ASC peuvent être utilisés comme blocs de construction pour les approches de bio-impression 3D.

Production automatisée à grande échelle de sphéroïdes de cellules souches dérivées de cellules adipeuses pour la bioimpression 3D

Ce protocole détaille une méthode pour la production de trois types différents de sphéroïdes d’une manière qui les rend adaptés au criblage et à l’analyse à grande échelle à haute teneur. En outre, des exemples sont présentés montrant comment ils peuvent être analysés au niveau des sphéroïdes et des cellules individuelles.

Une méthode robuste pour la production à grande échelle de sphéroïdes pour les applications de criblage et d’analyse à haute teneur

Le protocole actuel décrit une technique permettant de produire des sphéroïdes tissulaires à grande échelle de manière rentable à l’aide d’un dispositif imprimé en 3D semblable à un tampon.

Génération de sphéroïdes tissulaires à l’aide d’un dispositif imprimé en 3D semblable à un tampon

Nous présentons un protocole de culture de sphéroïdes hautement reproductibles et leur caractérisation phénotypique par capture d’images et protéomique.

Analyse phénotypique semi-automatisée de cultures fonctionnelles de cellules sphéroïdes 3D

Nous présentons ici un protocole qui permet une fabrication rapide, robuste et peu coûteuse de sphéroïdes tumoraux, suivie d’une encapsulation d’hydrogel. Il est largement applicable car il ne nécessite pas d’équipement spécialisé. Il serait particulièrement utile pour explorer les interactions sphéroïde-matrice et construire des modèles de physiologie tissulaire ou de pathologie in vitro .

Fabrication et encapsulation de sphéroïdes tumoraux dans des hydrogels de polyéthylène glycol pour étudier les interactions sphéroïde-matrice

Les sphéroïdes cellulaires ont été considérés comme un modèle potentiel dans le domaine des applications biologiques. Cet article décrit les protocoles permettant de générer de manière évolutive des sphéroïdes cellulaires à l’aide d’un dispositif d’assemblage acoustique 3D, qui fournit une méthode efficace pour la fabrication robuste et rapide de sphéroïdes cellulaires uniformes.

Dispositif d’assemblage acoustique tridimensionnel pour la fabrication en série de sphéroïdes cellulaires

Ici, nous décrivons différentes méthodes de formation de sphéroïdes multicellulaires pour effectuer une microscopie multiparamètre de suivi sur cellules vivantes. À l’aide de la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM), de l’autofluorescence cellulaire, des colorants de coloration et des nanoparticules, l’approche d’analyse du métabolisme cellulaire, de l’hypoxie et de la mort cellulaire dans le cancer tridimensionnel vivant (3D) et les sphéroïdes dérivés de cellules souches est...

Production et microscopie imageuse à vie multiparamètre en fluorescence de cellules vivantes (FLIM) de sphéroïdes multicellulaires

Cette étude présente une méthodologie rentable et efficace pour générer des structures cellulaires 3D à l’aide d’un système basé sur des tampons pour créer des micropuits dans des moules d’agarose. Le système favorise la formation de sphéroïdes/organoïdes uniformes, améliorant ainsi les interactions cellulaires. Cette approche réduit la variabilité expérimentale et soutient les applications dans les tests de médicaments et l’ingénierie tissulaire.

Génération de sphéroïdes/organoïdes tridimensionnels à partir de cultures cellulaires bidimensionnelles à l’aide d’un nouveau dispositif de tamponnage

Découvrez une méthode rapide et flexible pour produire des sphéroïdes cellulaires 3D par agrégation. Cette technique utilise une matrice de méthylcellulose non protéique pour faciliter l'isolation des sphéroïdes.

Une méthode d'agrégation cellulaire efficace et flexible pour 3D Spheroid production

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