Un modèle chronique auto-immune de rat à oeil sec avec augmentation de la cellule Effect Memory T dans le tissu Eyeball

L’objectif global de cette procédure est d’induire des signes cliniques de dysfonctionnement lacrymal et d’inflammation des glandes lacrymales chez le rat en utilisant l’immunisation sous-cutanée et l’injection sous-conjonctivale et intralacrymale d’extraits de glandes lacrymales pour l’évaluation des thérapies dans la sécheresse oculaire auto-immune. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la sécheresse oculaire, par exemple si les médicaments qui suppriment les lymphocytes T dans les maladies auto-immunes sont efficaces. Le principal avantage de cette technique, c’est qu’elle produit des signes de maladie oculaire similaires à la sécheresse oculaire humaine et quantifie également les lymphocytes T infiltrant la glande lacrymale et l’œil.

Les implications de ce modèle animal s’étendent à la compréhension du trafic des lymphocytes, car la rate et les ganglions lymphatiques peuvent être étudiés. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à cause du manque d’instruments appropriés pour documenter les changements dans l’œil du petit rat. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car certaines étapes sont difficiles à apprendre en raison de l’assèchement rapide de l’œil du rat et de l’absence de clignements après l’anesthésie.

Après avoir euthanasié une femelle rat Sprague Dawley selon le protocole textuel, placez l’animal à plat, une oreille contre la table et l’autre vers le haut. Avec une paire de ciseaux, faites une incision de 10 millimètres en haut-bas sous l’oreille exposée. Ensuite, retirez la glande lacrymale en la disséquant du tissu conjonctif environnant et du canal de drainage.

Ensuite, à l’aide de ciseaux, hachez le mouchoir aussi finement que possible sur de la glace. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de PBS avec un inhibiteur de protéase 1X par glande lacrymale. Avec le sonicateur réglé à 10 secondes de marche, 10 secondes d’arrêt et 30 % d’amplitude, sonifiez les échantillons sur de la glace à 20 kilohertz pendant cinq minutes.

Ensuite, centrifugez les échantillons soniqués à 13 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube. Ensuite, aliquote le surnageant dans des tubes de 1,5 millilitre et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.

Transférez l’adjuvant de Freund complet contenant cinq milligrammes par millilitre de Mycobacterium tuberculosis H37Ra ou l’adjuvant de Freund incomplet dans un tube de 50 millilitres, en veillant à ce que le volume de l’adjuvant par rapport au mélange d’antigènes soit dans un rapport de un pour un. Ajoutez le mélange d’antigènes contenant deux milligrammes par millilitre d’ovalbumine et 10 milligrammes par millilitre d’extrait de glande lacrymale goutte à goutte à la solution adjuvante tout en tourbillonnant à la vitesse la plus élevée qui n’entraîne pas de déversement. Continuez à vortex pendant cinq minutes après que tout l’antigène a été ajouté.

Transférez l’émulsion dans une seringue de cinq millilitres et utilisez un connecteur de seringue pour la relier à une autre seringue de cinq millilitres. Ensuite, poussez l’émulsion d’une seringue à l’autre pour la mélanger. Le jour zéro, distribuez 200 microlitres de l’émulsion, qui contient un milligramme d’extrait de glande lacrymale et 200 microgrammes d’ovalbumine dans l’adjuvant de Freund complet, dans des seringues Luer lock d’un millilitre, et équipez les seringues d’aiguilles de calibre 27

Sans utiliser d’anesthésie, injectez par voie sous-cutanée l’émulsion à la base des queues de rat. Puis, le 14e jour, de la même manière, injectez 200 microlitres du même antigène dans un adjuvant de Freund incomplet. Le même jour, injectez par voie intrapéritonéale 300 nanogrammes de toxine coqueluche dans 100 microlitres de PBS.

Au 48e jour, pesez la quantité requise d’ovalbumine et dissolvez-la dans du PBS. Ensuite, combinez l’ovalbumine avec l’extrait de glande lacrymale décongelé préparé plus tôt dans cette vidéo, en faisant une solution antigénique contenant un milligramme par millilitre d’ovalbumine et un milligramme par millilitre d’extrait de glande lacrymale. Après avoir anesthésié le rat, injectez cinq microlitres d’antigène dans la sous-conjonctive fornicéenne de l’œil.

Ensuite, injectez 20 microlitres d’antigène dans la glande lacrymale. Tout en tenant un rat anesthésié selon le protocole de texte, pour mesurer le volume lacrymal avec du fil rouge phénol, utilisez une paire de pinces pour tenir le fil et une autre pour tirer la paupière inférieure du rat. Placez le fil à l’angle proximal du fornix inférieur pendant une minute, puis retirez le fil.

Ensuite, placez le fil à côté d’une règle avec des marques millimétriques et prenez une image de la longueur de la partie mouillée du fil. Pour mesurer la douceur de la larme de la cornée, placez le rat sous un stéréomicroscope équipé d’un illuminateur annulaire et d’une caméra. Ensuite, appliquez cinq microlitres de solution saline sur la cornée du rat.

Avec les doigts gantés, clignez passivement des yeux en bougeant les paupières supérieures et inférieures environ cinq fois pour étaler la solution saline. Sous un grossissement de 1,6 fois, focalisez l’illuminateur annulaire sur le milieu de la surface de la cornée. Ensuite, après 10 secondes, acquérez des images photographiques.

Utilisez la scintigraphie à la fluorescéine pour mesurer les lésions cornéennes en ajoutant deux microlitres de fluorescéine à 0,2 % à la cornée du rat. Avec un doigt ganté, ouvrez et fermez passivement les paupières du rat trois fois pour étaler le colorant fluorescéine à la surface de l’œil. Après une minute, utilisez une seringue de trois millilitres pour prélever un millilitre de solution saline.

Ensuite, positionnez la seringue à environ deux à trois millimètres en avant de la cornée et appliquez doucement une solution saline sur l’œil. Avec la lumière de fond éteinte, acquérez des images sous le filtre bleu cobalt d’un microscope d’imagerie oculaire. Après avoir euthanasié le rat selon le protocole textuel, utilisez des ciseaux pour enlever les paupières supérieures et inférieures.

Libérez le globe en sectionnant les muscles extraoculaires, le nerf optique et la conjonctive fornicéenne. Faites une incision pour ouvrir le globe oculaire. Retirez le cristallin du vitré.

Ensuite, mettez les globes oculaires disséqués dans des tubes de 1,5 millilitre sur de la glace. Enfin, récupérez les glandes lacrymales comme décrit plus tôt dans cette vidéo. Cette figure montre des images représentatives des fils rouges de phénol du rat témoin et du rat DED.

La longueur des fils rouges de phénol dans le groupe DED est plus courte que celle du groupe témoin, ce qui indique un volume de déchirure moindre. La fluorescéine se lie à l’épithélium cornéen endommagé et est donc utilisée pour mesurer l’étendue des dommages. Dans cette expérience, les taches de fluorescéine sur la surface cornéenne de rats DED ont été classées de zéro à deux et comparées à des rats témoins.

Les rats atteints de DED ont plus de coloration à la fluorescéine que les rats témoins, ce qui suggère des lésions cornéennes. Comme on le voit ici, si la surface cornéenne est lisse avec une grande stabilité à la déchirure, l’image de l’anneau lumineux sur la surface oculaire est ronde et parfaite. La distorsion de l’image indique une réduction de la douceur cornéenne et un film lacrymal instable, comme cela a été observé à un degré de distorsion plus élevé dans le groupe DED.

Cette analyse par cytométrie en flux montre que le sous-ensemble prédominant de lymphocytes T dans les tissus normaux du globe oculaire du rat sont les lymphocytes T à mémoire effectrice. Dans les globes oculaires des rats DED, environ 70 % des lymphocytes T CD3 positifs sont des lymphocytes T à mémoire effecteur, tandis que chez les rats témoins, ce nombre est d’environ 50 %. À la suite de cette procédure, la coloration d’autres types de cellules immunitaires peut être effectuée pour répondre à des questions supplémentaires.

Par exemple, vous pouvez colorer les cellules immunitaires innées ou les lymphocytes B. Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour comprendre l’immunologie de la surface oculaire et, plus loin, pour étudier la sécheresse oculaire chez l’homme et le syndrome de Sjögren. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire une sécheresse oculaire auto-immune chez les rats et d’effectuer une documentation solide des résultats.