Name: Nouvelles méthodes pour étudier le codage désintoxiqué (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Découvrez des méthodes d'enregistrement in vivo des neurones gustatifs chez Manduca sexta. Cette technique par tétrode permet d'étudier le codage des saveurs avec une livraison précise des stimuli.

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Ce travail a été soutenu par une subvention intramuros du NIH-NICHD à MS. Nous remercions G. Dold et T. Talbot du NIH-NIMH Instrumentation Core Facility pour l&#39;aide à la conception du système de livraison de tastant.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les méthodes décrites ici permettent des enregistrements in vivo d&#39;un animal relativement simple, Manduca sexta , pour caractériser l&#39;activité de multiples GRN sélectionnés au hasard pendant de longues durées (pendant plus de 2 h), avant, pendant et après l&#39;administration du goût. Ces méthodes permettent également la distribution rapide et séquentielle de stimuli tastant multiple avec un contrôle temporel précis, des avantages utiles pour l&#39;étude des mécanismes neuronaux sous-jacents à la représentation gustative. Ce protocole a été utilisé pour étudier comment les réponses des GRN aux saveurs sont transformées lorsqu&#39;elles sont transmises à leurs neurones cibles post-synaptiques ( p. Ex. Dans la SEZ) en surveillant les GRN simultanément avec des interneurones connectées monosynaptiquement 10 . En outre, ces méthodes peuvent être adaptées aux besoins de l&#39;expérimentateur, permettant l&#39;exécution de paradigmes complexes pour étudier les aspects fondamentaux du codage gustatif. Quand commenceNos études, un problème technique auquel nous avons parfois eu à résoudre était l&#39;incapacité de détecter les signaux de pointe du nerf maxillaire avec les fils de tétrode. Les causes possibles de cela sont diverses, car le protocole de dissection est difficile et certaines pratiques sont nécessaires pour obtenir une bonne préparation. Tout d&#39;abord, lors de la dissection de la mite, les nerfs maxillaires sont faciles à endommager, en particulier lors de l&#39;élimination de la gaine entourant le tissu nerveux. Deuxièmement, si la gaine n&#39;est pas complètement enlevée, les fils de tétrode peuvent ne pas pouvoir accéder au nerf. Dans les deux cas, le démarrage d&#39;une nouvelle préparation est souvent le moyen le plus simple de résoudre ces problèmes. Troisièmement, il peut y avoir un problème avec les fils de tétrame. Cela peut être vérifié en mesurant l&#39;impédance des fils qui devrait être de ~ 270 kΩ à 1 kHz. Si la valeur d&#39;impédance est supérieure à ~ 300 kΩ, électrodez les fils avec de l&#39;or pour obtenir l&#39;impédance souhaitée (voir référence 30 ). Quatrièmement, un équipement peut être mal connectéOu mal à l&#39;aise. Un autre problème possible est que les signaux d&#39;attaque sont enregistrés, mais le (s) neurone (s) semblent ne pas répondre aux saveurs. Cela pourrait être dû au fait que les neurones enregistrés sont insensibles à l&#39;ensemble des dégustateurs livrés. En outre, il est important de garder à l&#39;esprit qu&#39;en plus des axones de GRN, le nerf maxillaire porte également des fibres mécanosensorielles. Ainsi, il est possible d&#39;enregistrer à partir de neurones mécanosensoriels au lieu de, ou en plus, de GRN. Cependant, le système de distribution de tampons est conçu pour fournir une entrée mécanique constante tout au long de l&#39;expérience, rendant improbable que les réponses à un goût soient confondues par des réponses au composant mécanique de sa livraison. Les neurones qui répondent à certains dégustateurs, mais pas à d&#39;autres, à des dégustateurs différents, peuvent être classés sans ambiguïté en tant que GRN. Nous recommandons d&#39;utiliser des savoureux fraîchement dilués pour éviter les variations de concentration ou de composition du goût en raison de la dégradation ou de l&#39;évaporation des composésDu solvant. Nous recommandons également de nettoyer le système régulièrement afin d&#39;éviter toute contamination et / ou obstruction des tubes. Un autre problème technique possible est un rapport signal / bruit désavantageux. Ce problème peut souvent être résolu en rechargeant ou en ajustant la position de l&#39;électrode de sol du bain. D&#39;autres solutions peuvent nécessiter un blindage et minimiser la longueur de chaque connexion électrique dans l&#39;appareil. Enfin, il est important de noter que l&#39;analyse correcte des données obtenues à l&#39;aide d&#39;enregistrements de tétrone requiert un tri précis des pointes. Nous avons constaté que les méthodes entièrement automatisées sont généralement inadéquates. Nous recommandons de se familiariser avec la littérature de tri de pointes avant d&#39;analyser les données de tétrée 10 , 29 , 31 , 32 , 33 . Alternatives à notre dissection proTocol peut être utilisé. Ici, nous avons décrit une dissection à travers la partie ventrale de la tête de mite, donnant accès aux nerfs maxillaires et SEZ, mais il est également possible d&#39;accéder à ces structures en disséquant à travers le côté dorsal. Nous avons constaté que la préparation du côté dorsal n&#39;est pas optimale pour faire des enregistrements de ces structures gustatives en raison de leur emplacement profond, mais cette préparation offre l&#39;avantage de permettre des enregistrements à partir de structures d&#39;ordre supérieur telles que le corps de champignon, une zone qui a été associée à plusieurs Intégration sensorielle, apprentissage associatif et traitement de la mémoire 34 . Nous nous sommes concentrés sur l&#39;utilisation d&#39;électrodes de tétrame pour enregistrer à partir du nerf maxillaire, mais, comme nous l&#39;avons illustré, des électrodes classiques intracellulaires peuvent également être utilisées à cette fin. En outre, les deux techniques peuvent être combinées pour effectuer des enregistrements simultanés à partir de plusieurs domaines du cerveau 10 . La littérature sur les neurosciences offre de nombreux exemples de iLes modèles nvertébrés qui se sont révélés être des outils puissants pour révéler les principes fondamentaux du traitement sensoriel, tels que le codage olfactif, qui s&#39;appliquent à la fois aux insectes et aux vertébrés 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Nous espérons que nos méthodes conduiront à de nouvelles idées fondamentales sur le codage gustatif.

Les systèmes gustatifs et olfactifs génèrent des représentations internes des produits chimiques dans l&#39;environnement, ce qui donne lieu à des perceptions des goûts et des odeurs, respectivement. Ces sens chimiques sont essentiels pour susciter de nombreux comportements critiques pour la survie de l&#39;organisme, allant de trouver des compagnons et des repas afin d&#39;éviter les prédateurs et les toxines. Le processus commence lorsque des produits chimiques environnementaux interagissent avec des récepteurs situés dans les membranes plasmatiques des cellules réceptrices sensorielles; Ces cellules, directement ou par des interactions avec des neurones, transforment l&#39;information sur l&#39;identité et la concentration de produits chimiques en signaux électriques. Ces signaux sont ensuite transmis aux neurones d&#39;ordre supérieur et à d&#39;autres structures cérébrales. À mesure que ces étapes progressent, le signal original subit toujours des changements qui favorisent la capacité de l&#39;organisme à détecter, discriminer, classer, comparer et stocker l&#39;information sensorielle et sélectionner une action appropriée. Comprendre comment le soutien-gorgeTransforme l&#39;information sur les produits chimiques environnementaux pour accomplir le mieux possible une variété de tâches est une question fondamentale en neurosciences. On a pensé que le codage de la désintoxication était relativement simple: une vue largement répandue pose que chaque molécule chimique qui provoque un goût (un «goût») appartient naturellement à l&#39;une des environ cinq propriétés typiques du goût (c.-à-d. Sucré, amer, aigre , Salée et umami) 1 . Dans cette vue «goût de base», le travail du système gustatif est de déterminer lequel de ces goûts de base est présent. En outre, les mécanismes neuronaux sous-jacents à la représentation de goutte de base dans le système nerveux ne sont pas clairs et sont censés être gouvernés par une &quot;ligne marquée&quot; 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ou un &quot;modèle de fibres&quot; 7 </suP&gt; , 8 code. Dans un code de ligne marqué, chaque cellule sensorielle et chacune de ses adeptes neuronales répond à une qualité de goût unique, formant ensemble un canal direct et indépendant à des centres de traitement plus élevés dans le système nerveux central dédié à ce goût. En revanche, dans un code de type fibre optique, chaque cellule sensorielle peut répondre à des qualités de goût multiples de sorte que l&#39;information sur le goût est représentée par la réponse globale de la population des neurones sensoriels. Si l&#39;information gustative est représentée par les goûts basiques, à travers des lignes marquées, ou par un autre mécanisme, n&#39;est pas clair et fait l&#39;objet de l&#39;étude récente 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Nos travaux récents suggèrent que le système gustatif utilise un code de population spatiotemporel pour générerReprésentations de dégustateurs individuels plutôt que de catégories de goût basiques 10 . Nous proposons ici 3 nouveaux outils pour faciliter l&#39;étude du codage gustatif. Tout d&#39;abord, nous suggérons l&#39;utilisation du hawkmoth Manduca sexta comme un organisme modèle relativement simple susceptible d&#39;être étudié par électrophysiologie du goût et décrire une procédure de dissection. Deuxièmement, nous suggérons l&#39;utilisation de «tétrones» extracellulaires pour enregistrer l&#39;activité des GRN individuels. Et troisièmement, nous proposons un nouvel appareil pour la délivrance et le suivi précis des impulsions chronométrées de l&#39;animal. Ces outils ont été adaptés des techniques de notre laboratoire et d&#39;autres ont utilisé pour étudier le système olfactif. Des insectes tels que la mouche des fruits Drosophila melanogaster , la crique Schistocerca americana , ainsi que la mite Manduca sexta, ont depuis des décennies des ressources puissantes pour comprendre les principes de base sur le nerVous, y compris le codage sensoriel ( p. Ex. Olfaction 13 ). Chez les mammifères, les récepteurs du goût sont des cellules spécialisées qui communiquent avec les neurones à travers des voies complexes du second messager 1 , 14 . Il est plus simple chez les insectes: leurs récepteurs gustatifs sont des neurones. En outre, les voies de goût des mammifères près de la périphérie sont relativement complexes, présentant de multiples voies parallèles parallèles, et des composants importants sont difficiles à accéder, contenus dans de petites structures osseuses 15 . Les voies de goût des insectes semblent être plus simples. Dans les insectes, les GRN sont contenus dans des structures spécialisées connues sous le nom de sensilla, situées dans l&#39;antenne, les embouchures, les ailes et les jambes 16 , 17 . Les GRN se projettent directement dans la zone sous-oesophagienne (SEZ), une structure dont le rôle a été jugé principalement gustatif 17 et qui contient du second ordreNeurones gustatifs 10 . De là, l&#39;information se déplace vers le corps pour conduire des réflexes et vers des zones supérieures du cerveau pour être intégrées, stockées et, en fin de compte, pour conduire des choix comportementaux 16 . Il est nécessaire de caractériser les réponses du goût périphérique pour comprendre comment l&#39;information gustative se propage et se transforme de point en point dans tout le système nerveux. La méthode la plus couramment utilisée pour surveiller directement l&#39;activité neurale des GRN dans les insectes est la technique d&#39;enregistrement des pointes 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Cela implique de placer une électrode directement sur un sensillum, dont beaucoup sont relativement faciles d&#39;accès. Le tastant est inclus dans l&#39;électrode, permettant d&#39;activer et d&#39;extMesurer de manière racélular les réponses neuronales des GRN dans le sensillum. Mais, étant donné que le flotteur est contenu dans l&#39;électrode, il n&#39;est pas possible de mesurer l&#39;activité GRN avant que le dégustateur ne soit délivré ou après qu&#39;il soit enlevé, ou pour échanger des savons sans remplacer l&#39;électrode 20 . Une autre méthode, la technique d&#39;enregistrement &quot;side-wall&quot;, a également été utilisée pour enregistrer l&#39;activité GRN. Ici, une électrode d&#39;enregistrement est insérée dans la base d&#39;un sens sensum 24 , et les dégustateurs sont délivrés par un capillaire en verre séparé sur la pointe du sensillum. Les deux techniques limitent l&#39;enregistrement des GRN à un sensillum particulier. Ici, nous suggérons une nouvelle technique: l&#39;enregistrement à partir d&#39;axones GRN sélectionnés au hasard de différentes sensillas, tout en délivrant séparément des séquences de dégustateurs aux proboscis. Les enregistrements Axon sont obtenus en plaçant soit des électrodes de verre pointues, soit des faisceaux d&#39;électrode extracellulaire (tetrodes) dans le nerf qui porte les axones deGRN dans la proboscis à la SEZ 10 . Dans Manduca , ces axones traversent le nerf maxillaire, qui est connu pour être purement afférent, permettant l&#39;enregistrement sans ambiguïté des réponses sensorielles 25 . Cette méthode d&#39;enregistrement à partir d&#39;axones permet, pendant plus de deux heures, une mesure stable des réponses GRN avant, pendant et après une série de présentations gustatives. Ici, nous décrivons une procédure de dissection pour exposer les nerfs maxillaires avec la SEZ, ce qui peut permettre d&#39;enregistrer simultanément les réponses de plusieurs GRN et des neurones dans le SEZ 10 . Nous décrivons également l&#39;utilisation d&#39;enregistrements extracellulaires de GRN à l&#39;aide d&#39;un tétractone en fil torsadé à 4 canaux sur mesure qui, lorsqu&#39;il est combiné avec une méthode de tri de pointe, permet d&#39;analyser simultanément plusieurs GRN (entre nos mains, jusqu&#39;à six). Nous comparons davantage les enregistrements réalisés avec les tétrones aux enregistrements réalisés avec des cellules intracellulairesÉlectrodes. Enfin, nous décrivons un nouvel appareil pour délivrer des stimuli gustatifs. Adapté de l&#39;équipement utilisé depuis longtemps par de nombreux chercheurs pour fournir des odeurs dans les études d&#39;olfaction, notre nouvel appareil offre des avantages pour l&#39;étude de la gustation: l&#39;amélioration par rapport au système de distribution multicanaux précédent, tels que ceux développés par Stürckow et ses collègues (voir références 26 , 27 ). Contrôler la synchronisation de la livraison du flotteur tout en fournissant une lecture de la tension de cette synchronisation; Et il permet la distribution rapide et séquentielle de plusieurs stimuli tastant 10 . L&#39;appareil baigne les proboscis dans un flux constant d&#39;eau propre dans lequel des impulsions contrôlées de dégustateur peuvent être livrées. Chaque impulsion gustative passe au-dessus du proboscis et est ensuite lavée. Les teintures contiennent une petite quantité de colorants alimentaires insipides, permettant à un capteur de couleur de surveiller, avec un chronométrage précis, le passage du tastant ovLa proboscis.

<table><tbody><tr><td>Dissection et préparation de l’échantillon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube en polypropylène, 15 mL Aiguille Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>, biseau court, 19 G x 1 - 1/2"&nbsp ;</td><td>&nbsp ; MONOJET</td><td>888200144</td><td>Pour appliquer de l’air pour enlever les poils de la mite.</td></tr><tr><td>Pâte à modeler-Van Aken Plastalina&nbsp ;</td><td>DickBlick</td><td>33268</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri -100 x 15 mm&nbsp ;</td><td>VWR International</td><td>89000-304</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de pipette (1 - 200 & micro ; L)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Techni Edge</td><td>TE05-071</td><td></td></tr><tr><td>Fil de raccordement standard 22 AWG</td><td>AlphaWire</td><td>1551</td><td>Pour insérer la trompe dans la pointe du pippete.</td></tr><tr><td>Cire Batik</td><td>Jacquard</td><td>7946000</td><td></td></tr><tr><td>Cire électrique</td><td>Almore International</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Myscroscope stéréo</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #1 pince (grossière)&nbsp ;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500335</td><td>Pour l’élimination de la graisse et des tissus non nerveux.</td></tr><tr><td>Pince en titane Dumont #5 (fine)&nbsp ;</td><td>World Precision Instruments</td><td>14096</td><td>Pour l’élimination de la graisse et des tissus non nerveux.</td></tr><tr><td>Pince Dumont #5SF (super-fine)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500085</td><td>Pour dégainer le tissu nerveux.</td></tr><tr><td>Ciseaux Vannas (fins)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td>Pour enlever la cuticule.</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td></td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Système de perfusion saline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extension avec régulateur de débit</td><td> B Braun Medical Inc.</td><td>V5200</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’administration IV avec site d’injection en Y</td><td>&nbsp ; B Braun Medical Inc.</td><td>V1402</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tastant Delivery System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White Translucide Nylon Tubing OD 1/4 », ID 1/8"</td><td>Small Parts Inc.</td><td>B001JJT4SA</td><td>Tube rigide qui relie les quatre éléments principaux du système.</td></tr><tr><td>Fer à souder</td><td>Circuit Specialists</td><td>ZD200BK</td><td></td></tr><tr><td>Outil rotatif-Dremel</td><td>Dremel</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>Maille en polypropylène, taille du trou (taille du trou 0,1 x 0,13 cm)&nbsp ;</td><td>Filet industriel</td><td>XN5170</td><td>Pour s’assurer que les trompes de différents animaux sont placées au même endroit.</td></tr><tr><td>Système de perfusion pressurisé à 16 canaux&nbsp ;</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-16H</td><td>Pour une livraison savoureuse. Ce système comprend des vannes à manchon, des tubes, un collecteur, des cylindres de solution, un contrôleur de vanne et des accessoires de montage.</td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène, ID 0.034 », ID 0.050"</td><td>Becton, Dickinson & Co</td><td>427421</td><td>Tube de sortie du système de perfusion.</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>Pour la commande du canal de sortie du système de perfusion.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Système logiciel d’acquisition de données, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 Carte DAQ</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>Pour contrôler la pompe pico pour une distribution savoureuse et pour enregistrer les signaux du capteur de couleur.</td></tr><tr><td>Compulab 3 Manostat Pompe péristaltique</td><td>Sigma</td><td>P1366</td><td>Pour le pompage de l’eau.</td></tr><tr><td>Tube en silicone, ID 1/16 » OD 1/8"</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-95802-02</td><td>Pour connecter la source d’eau au tube de la pompe péristaltique et le tube de sortie de la pompe au tube rigide du système de livraison.</td></tr><tr><td>Capteur couleur-capteur numérique à fibre optique</td><td>Keyence</td><td>&nbsp ; FS-V31M</td><td>Pour le suivi de la livraison de tastant.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Unité de fibre réfléchissante pour capteur de couleur</td><td>Keyence</td><td>FU35-FZ</td><td>Pour connecter le capteur de couleur.</td></tr><tr><td>Cire dentaire</td><td>périphérique Henry-Schein Dental</td><td>6652151</td><td>Pour fixer la trompe dans le tube rigide.</td></tr><tr><td>Deux bidons</td><td></td><td></td> de 3,7 L <td>Pour alimenter le système en eau et récupérer les eaux usées.</td></tr><tr><td>Vert rapide FCF&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pansement 25,5 cm</td><td>WPI</td><td>500364</td><td>Pour introduire le proboscis dans le trou du proboscis dans le tube rigide.</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Équipement d’électrophysiologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.C. amplificateur</td><td>Brown-Lee</td><td>440</td><td></td></tr><tr><td>Lampe</td><td>Schott</td><td>Schott Fostec Source lumineuse DCR 2</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur manuel</td><td>Micromanipulateur</td><td>Leica</td><td>Pour insérer précisément les tétrodes dans le cerveau de l’animal. Le manipulateur doit permettre des mouvements fins et grossiers dans les axes x, y et z.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Table d’isolation des vibrations (table de laboratoire MICRO-g)</td><td>TMC</td><td>63-541</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&nbsp ;</td><td></td><td></td>TDS2014</tr><tr><td>préamplificateur et amplificateur 16 canaux</td><td>Système d’amplification MA-800 16 canaux&nbsp ;</td><td>B.E.S 2013</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td>Dell</td><td>optiplex 780</td><td>Voici la configuration minimale recommandée. Mémoire vive : 3,32 GHz, 3 Go. Processeur : Intel Core&nbsp ; 2 Duo. Carte graphique : Intel GMA X4500 intégrée.</td></tr><tr><td>Système logiciel d’acquisition de données, carte DAQ LabVIEW PCI-MIO-16E-4</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>Pour contrôler la pompe pico pour une distribution savoureuse et pour enregistrer les signaux du capteur de couleur et de l’électrode.</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Tastants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5708</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr></tbody></table>

nouvelles méthodes pour étudier le codage désintoxiqué

New Methods to Study Gustatory Coding 

Le sens du goût permet aux animaux de détecter les produits chimiques dans l&#39;environnement, donnant lieu à des comportements critiques pour la survie. Lorsque les neurones des récepteurs de déshydratation (GRN) détectent les molécules gustatives, ils encodent des informations sur l&#39;identité et la concentration du gustateur en tant que modèles d&#39;activité électrique qui se propagent ensuite aux neurones suiveurs du cerveau. Ces modèles constituent des représentations internes du goût, ce qui permet à l&#39;animal de sélectionner des actions et de former des mémoires. L&#39;utilisation de modèles animaux relativement simples a été un outil puissant pour étudier les principes fondamentaux du codage sensoriel. Ici, nous proposons trois nouvelles méthodes pour étudier le codage gustatif en utilisant la mite Manduca sexta . Tout d&#39;abord, nous présentons une procédure de dissection pour exposer les nerfs maxillaires et la zone sous-oesophagienne (SEZ), permettant d&#39;enregistrer l&#39;activité des GRN à partir de leurs axones. Deuxièmement, nous décrivons l&#39;utilisation d&#39;électrodes extracellulaires pour enregistrer l&#39;activité de plusieurs GRN en plaçant leTrode les fils directement dans le nerf maxillaire. Troisièmement, nous présentons un nouveau système pour la livraison et le suivi, avec une précision temporelle élevée, des impulsions de différents saveurs. Ces méthodes permettent la caractérisation des réponses neuronales in vivo directement à partir des GRN avant, pendant et après la délivrance des saveurs. Nous fournissons des exemples de traces de tension enregistrées à partir de GRN multiples et nous présentons un exemple de la façon dont une technique de tri de pointe peut être appliquée aux données pour identifier les réponses des neurones individuels. Enfin, pour valider notre approche d&#39;enregistrement, nous comparons les enregistrements extracellulaires obtenus à partir de GRN avec des tétrones à des enregistrements intracellulaires obtenus avec des électrodes de verre pointues.

L&#39;activité des GRN peut être enregistrée à l&#39;aide d&#39;une électrode de tétractone extracellulaire avant, pendant et après la distribution du goût ( Figure 6A et 6C ). La figure 6A (panneaux moyens et inférieurs) montre des traces de tension filtrées (300 à 6 000 Hz) enregistrées par chacun des quatre fils placés dans le nerf maxillaire, où des signaux de différentes amplitudes reflétant des potentiels d&#39;action (flèches) peuvent être observés. Une impulsion de tastant de 1 s (saccharose 1 M) a été délivrée 2 s après le début de l&#39;expérience; L&#39;apparition et le décalage de la stimulation ont été surveillés par le capteur de couleur ( Figure 6A , panneau supérieur). Les pointes induites par le gustatif peuvent être observées dans chacun des quatre canaux ( figure 6A , panneau central). Les GRN peuvent être identifiés et distingués des mécanosensors (aucun montré ici) quand ils répondent à des dégustateurs et pas à d&#39;autres Pour identifier et isoler les réponses des neurones individuels à partir des enregistrements de tetrode, nous avons effectué un triage hors ligne en utilisant un ensemble de fonctions personnalisées basées sur les 32 , 33 méthodes de Pouzat et Kleinfeld (ces méthodes sont décrites dans ces citations: 10 , 29 ). La figure 6B montre un exemple de tri des pointes appliqué aux données représentées sur la figure 6A , dans lesquelles trois unités bien isolées ont été trouvées. Les tracés de la Figure 6C représentent les réponses des trois unités isolées de la Figure 6B à six dégustateurs différents (1 M de saccharose, maltose et NaCl, 100 mM de caféine et 10 mM de berbérine et lobeline) livrés en séquence (4 essaisS / tastant sont affichés). Comme le montre la figure 6C , les GRN enregistrés ont différents niveaux d&#39;activité de base, allant du silencieux (GRN 1) à faible ou modéré (GRN 2 et 3). Après l&#39;apparition des tastants, les GRN présentent divers modèles d&#39;activité et affichent une sélectivité différente des dégustateurs. Par exemple, le GRN 1 a répondu uniquement au saccharose, alors que le GRN 2 a répondu au maltose et à la NaCl avec un éclat de pointes et à la lobeline avec un pictement uniquement au début du stimulus. En outre, certaines réponses sont verrouillées au moment du stimulus ( p. Ex. Réponse au GRN 1 au saccharose), tandis que d&#39;autres réponses dépassent la durée du stimulus ( p. Ex. Réponse au GRN 3 à la berbérine) ou contiennent à la fois des composants excitateurs et inhibiteurs ( p . Ex. Figure 7 Les réponses du GRN 2 au NaCl et au saccharose). Pour plus d&#39;informations sur les diverses sensibilités et les profils d&#39;activité des GRN, voir la référence 10 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Pour valider l&#39;utilisation des techniques de tetrode et de tri de pointe pour enregistrer les GRN du nerf maxillaire, nous avons effectué des enregistrements intracellulaires à partir d&#39;axones GRN dans d&#39;autres animaux en utilisant des électrodes de verre pointu classiques (résistance de 80-120 MΩ). Nous avons constaté que les modèles d&#39;activité obtenus en utilisant des enregistrements intracellulaires étaient semblables aux réponses observées en utilisant la technique de la tétrade ( figure 7 ). Les traces de tension dans la boîte verte dans le panneau A ont été enregistrées intracellulairement à partir de GRN 1 au cours de 5 essais consécutifs de présentation de saccharose, et les mêmes réponses sont présentées sous forme de diagrammes raster dans le panneau B. (Notez que ce type de réponse correspond à celui obtenu avec les tétrones et Montré à la figure 6C .) Le GRN 2, enregistré avec des électrodes intracellulaires pointues, présente un modèle de réponse plus large. <img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; Figure 6: Résultats représentatifs des enregistrements du nerf maxillaire avec des tétractones extracellulaires. ( A ) Les traces de tension filtrées (300 à 6 000 Hz) enregistrées par chacun des quatre fils au niveau du nerf maxillaire sont indiquées (panneau central). Une impulsion de tastère de 1 s a été appliquée pendant la période indiquée par l&#39;ombrage rouge dans le panneau central. L&#39;apparition et le décalage de la stimulation ont été surveillés par le capteur de couleur comme indiqué par la trace de tension rouge sur le panneau supérieur, et est indiqué sur le panneau central par la zone ombrée rouge. Les lignes horizontales pointillées représentent +50 (haut), 0 (milieu) et -50 (en bas) μV. Un élargissement des traces de tension brut correspondant à la zone à l&#39;intérieur des lignes pointillées verticales est affiché (panneau inférieur). Des exemples de pointes sont indiqués par les flèches. ( B ) Un exemple de tri des pointes appliqué aux données présentées dans le panneau A. Les formes d&#39;onde enregistrées à chacun des quatre fils extracellulaires (1-4) sontE identifié avec trois GRN différents (unités 1-3) contribuant aux signaux enregistrés. Les événements individuels (lignes fines colorées) et la moyenne (ligne noire épaisse) sont représentés pour les trois unités. Un certain nombre de critères statistiques doivent être considérés pour identifier de manière fiable les unités indépendantes à l&#39;aide de la méthode de tri des pointes (voir les références 10 , 29 ). ( C ) Les parcelles raster représentant les réponses des trois unités isolées à une séquence de six dégustateurs différents (4 essais / dégustateur sont présentés). La période de livraison du flotteur (1 s) est indiquée par la zone ombrée rouge. Les concentrations de flotteurs étaient soit 1 M (saccharose, maltose, NaCl), 100 mM (caféine) et 10 mM (berbérine et lobeline). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 7" c<html> Lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; Figure 7 : Enregistrements intracellulaires des axones du GRN. ( A , panneau de la boîte verte) Les traces de tension enregistrées à partir d&#39;un GRN avec des électrodes intracellulaires à verre pointu (résistance de 80 à 120 MΩ) placées dans le nerf maxillaire, provoquées par 5 stimulations consécutives avec 1 M de saccharose (Suc). ( B ) Les tracés des réponses de deux GRN, y compris les réponses présentées dans le panneau A (panneau de la boîte verte), à ​​deux dégustateurs différents livrés en séquence (couleur de police grise 100 mM, 1 couleur de police noir) enregistrée avec des électrodes intracellulaires à verre pointu Placé dans le nerf maxillaire (7 essais / dégustateur et 3 essais / eau sont présentés). Le temps de livraison du tastant est indiqué par des zones ombrées rouges dans les deux panneaux. L&#39;apparition et le décalage de la stimulation ont été surveillés par le capteur de couleur, comme indiqué par les traces de tension rouge au bas de chaque panneau.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Nous présentons trois nouvelles méthodes pour étudier le codage gustatif . En utilisant un animal simple, la mite Manduca sexta ( Manduca ) , nous décrivons un protocole de dissection, l&#39;utilisation de tétrones extracellulaires pour enregistrer l&#39;activité de plusieurs neurones récepteurs gustatifs et un système pour délivrer et surveiller précisément des impulsions chronométrées.

Nouvelles méthodes pour étudier le codage désintoxiqué

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

L'objectif général de ces méthodes est d'étudier le codage du goût chez un animal simple, Mandi-casecsta, en enregistrant l'activité de plusieurs neurones récepteurs in vivo, tout en délivrant et en surveillant des impulsions de substances gustatives précisément synchronisées. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés concernant la gustation, telles que la manière dont les substances gustatives sont codées par des populations de neurones récepteurs gustatifs. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre des enregistrements in vivo de plusieurs neurones gustatifs avant, pendant et après des stimuli de substances gustatives délivrés avec précision.Les personnes novices dans cette méthode pourraient la trouver difficile, car la procédure de dissection est complexe. C'est pourquoi nous espérons que la démonstration visuelle de la méthode sera utile. Ces techniques ont été mises au point par Sam Writer lorsqu'il était étudiant diplômé dans mon laboratoire, aux côtés d'Alejandra, et seront démontrées par Kui Sun.Trois jours après l’éclosion, choisissez un papillon de n’importe quel sexe ayant un aspect généralement sain. Les ailes doivent être complètement déployées, et le rostre ainsi que les antennes doivent être bien formés et intacts. Dans une hotte, insérez le papillon sélectionné dans un tube de contention jusqu’à ce que la tête soit exposée.Ensuite, immobilisez le papillon en insérant du papier essuie-tout dans l'autre extrémité du tube. Maintenant, à l'aide d'air comprimé délivré par une seringue, retirez les poils de la tête exposée. Puis, placez le tube sur une plateforme en argile dans une boîte de Pétri.Placer la tête avec le côté dorsal vers le haut. Ensuite, protéger les antennes et le rostre. Commencez par fabriquer des couvercles pour chaque structure à l’aide de pointes de pipette de 200 microlitres coupées en morceaux d’un demi-centimètre de longueur.Pour manipuler le proboscis, préparez un crochet à partir d'un morceau de fil métallique. Étendez le proboscis dans l'un des couvercles jusqu'à ce que la partie la plus proximale du proboscis soit protégée. Fixez le tube à la partie dorsale de la capsule céphalique à l'aide d'une cire à batik ferme.Ensuite, écartez soigneusement les antennes et fixez les tubes avec de la cire à cacheter. Stabilisez maintenant le cerveau en sectionnant le muscle compresseur du bouclier. Sous le microscope de dissection, utilisez des outils de microdissection pour ouvrir la capsule céphalique en pratiquant une petite incision juste en dessous du rostre.Pour confirmer que le muscle est sectionné, offrir une solution de saccharose au tiers distal de la proboscis et s'assurer pendant cinq minutes que la proboscis ne s'étend pas. Ensuite, refermer la capsule céphalique à l'aide d'une couche de cire à cacheter fondue. Pour perfuser le cerveau avec du sérum physiologique, construire un godet en cire autour de la face ventrale de la tête.À l’aide d’un cireur électrique, commencez à former une coupelle en cire le long de la partie avant de la tête en vous déplaçant vers l’arrière. Maintenez les tubes du rostre et des antennes à l’intérieur de la coupelle. Poursuivez la construction de la coupelle vers l’extérieur et vers le haut jusqu’à ce qu’elle atteigne le niveau des yeux.À l’aide de pinces, prenez les palpes labiaux et fixez-les sur le godet de cire en utilisant de la cire fondue. Ensuite, scellez toutes les ouvertures du godet et des tubes à l’aide d’une fine couche d’époxy binaire. Mélangez l’époxy à l’aide d’un cure-dent.Commencez par recouvrir les surfaces extérieure et intérieure du gobelet. Ensuite, remplissez la partie du tube de contention entourant le cou afin que la tête soit maintenue plus fermement. Après 20 minutes, vérifiez le gobelet pour détecter d'éventuelles fuites.Pour commencer la chirurgie cérébrale, retirez d'abord les palpes labiaux. Pour ouvrir la face ventrale de la capsule céphalique, incisez la cuticule le long de l'arrière et de l'avant de la tête, ainsi qu'autour des yeux. Ensuite, effectuez une incision le long de l'arrière de la tête et réalisez d'autres incisions à l'avant de la tête, près du proboscis.Ensuite, soulevez délicatement le lambeau de cuticule avec une pince pour exposer le cerveau. Effectuez maintenant l'étape la plus critique : l'exposition de la zone embryogène sous-œsophagienne (SEZ) et des nerfs maxillaires. Retirez lentement et soigneusement le tissu adipeux et la trachée.Rincez fréquemment le cerveau avec du sérum physiologique frais. Soyez très prudent, car il est très facile d'écraser les nerfs maxillaires. Lorsque la zone épendymaire subventriculaire (SEZ) et les nerfs maxillaires sont enfin visibles, ils sont recouverts par une fine gaine.Pour retirer cette gaine, drainer tout excès de sérum physiologique, puis ramollir la gaine en appliquant une solution de collagénase dispase à 10 %. Après une immersion de cinq minutes, rincer plusieurs fois la solution avec du sérum physiologique. Ensuite, après plusieurs rinçages avec du sérum physiologique, retirer délicatement la gaine à l’aide de pinces de microdissection ultrafines.Enfin, fixez une ligne de perfusion saline dans la coupelle de perfusion. Cette section décrit comment construire et utiliser un système de délivrance de substances gustatives. Le système est composé d'un tube d'essai comportant plusieurs orifices.Les ouvertures permettent l'entrée du proboscis de l'animal, du collecteur de substances gustatives, d'un capteur de couleur, et elles autorisent la circulation de l'eau. Pour construire ce système, préparez d'abord un tube d'essai destiné au proboscis. Réalisez un trou de la taille du proboscis à l'aide d'un fer à souder.Ensuite, construire une section tamisée à l'intérieur du tube afin de maintenir le proboscis en place. Couper cinq millimètres au-dessus du trou, placer la maille à cet endroit avec de la cire, puis reconnecter les tubes à l'aide de cire et d'époxy. Utiliser un système de perfusion pressurisé pour administrer les substances gustatives.Reliez autant de tubes de stimulus gustatif que nécessaire à un collecteur. Pour raccorder le tube de sortie du stimulus gustatif, percez un trou à environ un centimètre au-dessus du maillage, puis fixez fermement le tube de sortie à l’aide d’une résine époxy. Dans chaque stimulus gustatif, ajoutez un colorant artificiel pouvant être détecté par un capteur de couleur.Fixez un capteur de couleur à l'appareil sur un trou situé à environ un demi-centimètre au-dessus du maillage, et fixez-le en place à l'aide d'une résine époxy. Utilisez une pompe péristaltique pour acheminer de l'eau distillée dans le système à l'aide d'un tube en silicone. Recueillez l'eau usée dans un récipient de grande taille.Utilisez une pompe pneumatique pour délivrer les substances gustatives à l'aide de jets d'air. Commencez maintenant à pomper de l'eau propre à travers le tube et délivrez des impulsions de substance gustative pour tester le capteur de couleur. Introduisez maintenant les deux tiers distaux du proboscis du papillon dans le tube de test.À l’aide de pinces, étendre la proboscide et la pousser délicatement dans le trou. Ensuite, fixer la proboscide en place à l’aide d’une cire dentaire douce et d’une couche d’époxy. Relier maintenant la ligne de perfusion saline et régler le débit de perfusion.Ensuite, immergez l'électrode de terre de la tétrade en fil torsadé dans le bain salin. Puis, à l'aide d'un micromanipulateur, positionnez la tétrade à côté du nerf maxillaire et avancez-la lentement dans le nerf. Après la détection de signaux de potentiels d'action, laissez le montage se stabiliser pendant au moins 10 minutes avant d'effectuer les enregistrements.Des enregistrements ont été effectués à partir de neurones récepteurs du goût avant, pendant et après l'administration du tastant en utilisant le protocole décrit. Le début et la fin d'une impulsion d'une seconde de chaque tastant ont été surveillés par le capteur de couleur. Les tastants ont provoqué des potentiels d'action qui ont été détectés par chacun des quatre canaux.Dans les trains d'impulsions, des potentiels d'action individuels pouvaient être observés. Un logiciel de tri des pics a été utilisé pour attribuer ces pics à des neurones uniques. La réponse de trois neurones récepteurs gustatifs différents à six substances sapides administrées en séquence révèle des niveaux différents d'activité de base et de sélectivité vis-à-vis des substances sapides.En outre, les réponses présentaient des durées différentes. Certaines étaient synchronisées avec la durée du stimulus, tandis que d'autres persistaient au-delà du stimulus. Des enregistrements intracellulaires pouvaient également être réalisés à partir des axones des récepteurs du goût à l'aide d'électrodes en verre pointues conventionnelles.Les enregistrements intracellulaires étaient très similaires aux réponses observées à l’aide de la technique de tétrade décrite, mais les enregistrements par tétrade étaient plus faciles à réaliser, plus durables et plus robustes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d’exposer les nerfs maxillaires et la zone sous-œsophagienne chez le mandi-casecsta, et de construire un système de délivrance de substances gustatives avec un contrôle temporel précis. Lors de l’exécution de ce protocole, portez des gants de sécurité de laboratoire et un masque facial, car la fine poudre provenant des écailles jetées par le mandi-casecsta peut être allergisante.Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en trois heures et demie. En suivant cette procédure, des enregistrements simultanés provenant de plusieurs régions cérébrales peuvent également être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : comment les réponses des neurones récepteurs gustatifs aux substances sapides sont-elles transformées lorsqu'elles sont transmises aux neurones cibles postsynaptiques ?

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La connaissance des mécanismes moléculaires sous-jacents de transduction gustative a récemment connu des avancées significatives, en grande partie due à l'utilisation de modèles animaux. Cependant, la grande diversité de la sensibilité gustative et la spécificité des études de mammifères justifie dans les tissus humains. Nous décrivons une technique de biopsie pour collecter les cellules gustatives de vie des papilles sur la langue humaine.

Technique pour collecter des fongiformes (goût) Papilles de la langue de l&#39;homme

Ce protocole décrit l'enregistrement extracellulaire des réponses potentielles d'action tirés par les neurones gustatifs labellar chez la drosophile.

Enregistrement électrophysiologique De<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Goût Sensilles

Les pattes antérieures et la trompe de la drosophile contiennent un riche répertoire de neurones sensoriels gustatifs. Ici, nous présentons une méthode utilisant l’imagerie calcique pour mesurer les réponses physiologiques des neurones sensoriels de la patte antérieure et du proboscis de mouches vivantes lors de l’application exogène d’une phéromone gustative.

Mesurer les réponses physiologiques de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones sensoriels à Lipid Phéromones Utilisation en direct d&#39;imagerie de calcium

Le goût est un processus sensoriel important qui facilite l’attraction vers les substances bénéfiques et l’évitement des substances toxiques.  Ce protocole décrit un essai d’ingestion simple permettant de déterminer la préférence gustative de la drosophile pour un composé chimique donné.

Goût préférence Essai pour adultes<em&gt; Drosophila</em

Ce protocole réponses humains du goût et comprend une brève évaluation anatomique, un test de goût court et une méthode de validation à l’aide de déclarés génotype de récepteur de sensation et le goût du sujet.

: Goût un brève et validé Test examen

Cet article décrit des méthodes de préparation des tissus, de coloration et d’analyse des papilles gustatives fongiformes, circonvallates et palatines entières qui produisent systématiquement des papilles gustatives entières et intactes (y compris les fibres nerveuses qui les innervent) et maintiennent les relations entre les structures des papilles gustatives et de la papille environnante.

Coloration, visualisation et analyse en monture entière des papilles gustatives fongiformes, circonvallates et palatines

Nous présentons ici comment exposer le ganglion géniculé d’une souris de laboratoire vivante et anesthésiée et comment utiliser l’imagerie calcique pour mesurer les réponses d’ensembles de ces neurones aux stimuli gustatifs, permettant ainsi de multiples essais avec différents stimulants. Cela permet des comparaisons approfondies de quels neurones répondent à quels tastants.

Imagerie calcique in vivo des réponses des neurones ganglionnaires géniculés de souris aux stimuli gustatifs

L’article présente le dispositif μTongue (microfluidique sur langue) pour l’imagerie fonctionnelle des cellules gustatives in vivo en intégrant la microfluidique dans une fenêtre d’imagerie intravitale sur la langue.

μTongue : une plateforme d’imagerie fonctionnelle basée sur la microfluidique pour la langue in vivo

Une méthode d’enregistrement électrophysiologique rarement utilisée, l’enregistrement de base, permet d’analyser des caractéristiques du codage du goût qui ne peuvent pas être examinées par les méthodes d’enregistrement conventionnelles. L’enregistrement de base permet également d’analyser les réponses gustatives à des stimuli hydrophobes qui ne peuvent pas être étudiés à l’aide des méthodes électrophysiologiques traditionnelles.

Enregistrement de base : une technique d’analyse des réponses des neurones gustatifs chez la drosophile

Une approche d’imagerie calcique permet d’enregistrer les réponses induites par le goût dans le cerveau des mouches éveillées pendant qu’une solution est appliquée sur le labelle. Les réponses gustatives primaires chez Drosophila melanogaster sont utilisées à titre d’exemple, mais ce protocole peut être adapté pour étudier les neurones en aval ou d’autres espèces.

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Découvrez des méthodes d'enregistrement in vivo des neurones gustatifs chez Manduca sexta. Cette technique par tétrode permet d'étudier le codage des saveurs avec une livraison précise des stimuli.

Nouvelles méthodes pour étudier le codage désintoxiqué

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