Nouvelles méthodes pour étudier le codage désintoxiqué

L'objectif général de ces méthodes est d'étudier le codage du goût chez un animal simple, Mandi-casecsta, en enregistrant l'activité de plusieurs neurones récepteurs in vivo, tout en délivrant et en surveillant des impulsions de substances gustatives précisément synchronisées. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés concernant la gustation, telles que la manière dont les substances gustatives sont codées par des populations de neurones récepteurs gustatifs. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre des enregistrements in vivo de plusieurs neurones gustatifs avant, pendant et après des stimuli de substances gustatives délivrés avec précision.

Les personnes novices dans cette méthode pourraient la trouver difficile, car la procédure de dissection est complexe. C'est pourquoi nous espérons que la démonstration visuelle de la méthode sera utile. Ces techniques ont été mises au point par Sam Writer lorsqu'il était étudiant diplômé dans mon laboratoire, aux côtés d'Alejandra, et seront démontrées par Kui Sun.

Trois jours après l’éclosion, choisissez un papillon de n’importe quel sexe ayant un aspect généralement sain. Les ailes doivent être complètement déployées, et le rostre ainsi que les antennes doivent être bien formés et intacts. Dans une hotte, insérez le papillon sélectionné dans un tube de contention jusqu’à ce que la tête soit exposée.

Ensuite, immobilisez le papillon en insérant du papier essuie-tout dans l'autre extrémité du tube. Maintenant, à l'aide d'air comprimé délivré par une seringue, retirez les poils de la tête exposée. Puis, placez le tube sur une plateforme en argile dans une boîte de Pétri.

Placer la tête avec le côté dorsal vers le haut. Ensuite, protéger les antennes et le rostre. Commencez par fabriquer des couvercles pour chaque structure à l’aide de pointes de pipette de 200 microlitres coupées en morceaux d’un demi-centimètre de longueur.

Pour manipuler le proboscis, préparez un crochet à partir d'un morceau de fil métallique. Étendez le proboscis dans l'un des couvercles jusqu'à ce que la partie la plus proximale du proboscis soit protégée. Fixez le tube à la partie dorsale de la capsule céphalique à l'aide d'une cire à batik ferme.

Ensuite, écartez soigneusement les antennes et fixez les tubes avec de la cire à cacheter. Stabilisez maintenant le cerveau en sectionnant le muscle compresseur du bouclier. Sous le microscope de dissection, utilisez des outils de microdissection pour ouvrir la capsule céphalique en pratiquant une petite incision juste en dessous du rostre.

Pour confirmer que le muscle est sectionné, offrir une solution de saccharose au tiers distal de la proboscis et s'assurer pendant cinq minutes que la proboscis ne s'étend pas. Ensuite, refermer la capsule céphalique à l'aide d'une couche de cire à cacheter fondue. Pour perfuser le cerveau avec du sérum physiologique, construire un godet en cire autour de la face ventrale de la tête.

À l’aide d’un cireur électrique, commencez à former une coupelle en cire le long de la partie avant de la tête en vous déplaçant vers l’arrière. Maintenez les tubes du rostre et des antennes à l’intérieur de la coupelle. Poursuivez la construction de la coupelle vers l’extérieur et vers le haut jusqu’à ce qu’elle atteigne le niveau des yeux.

À l’aide de pinces, prenez les palpes labiaux et fixez-les sur le godet de cire en utilisant de la cire fondue. Ensuite, scellez toutes les ouvertures du godet et des tubes à l’aide d’une fine couche d’époxy binaire. Mélangez l’époxy à l’aide d’un cure-dent.

Commencez par recouvrir les surfaces extérieure et intérieure du gobelet. Ensuite, remplissez la partie du tube de contention entourant le cou afin que la tête soit maintenue plus fermement. Après 20 minutes, vérifiez le gobelet pour détecter d'éventuelles fuites.

Pour commencer la chirurgie cérébrale, retirez d'abord les palpes labiaux. Pour ouvrir la face ventrale de la capsule céphalique, incisez la cuticule le long de l'arrière et de l'avant de la tête, ainsi qu'autour des yeux. Ensuite, effectuez une incision le long de l'arrière de la tête et réalisez d'autres incisions à l'avant de la tête, près du proboscis.

Ensuite, soulevez délicatement le lambeau de cuticule avec une pince pour exposer le cerveau. Effectuez maintenant l'étape la plus critique : l'exposition de la zone embryogène sous-œsophagienne (SEZ) et des nerfs maxillaires. Retirez lentement et soigneusement le tissu adipeux et la trachée.

Rincez fréquemment le cerveau avec du sérum physiologique frais. Soyez très prudent, car il est très facile d'écraser les nerfs maxillaires. Lorsque la zone épendymaire subventriculaire (SEZ) et les nerfs maxillaires sont enfin visibles, ils sont recouverts par une fine gaine.

Pour retirer cette gaine, drainer tout excès de sérum physiologique, puis ramollir la gaine en appliquant une solution de collagénase dispase à 10 %. Après une immersion de cinq minutes, rincer plusieurs fois la solution avec du sérum physiologique. Ensuite, après plusieurs rinçages avec du sérum physiologique, retirer délicatement la gaine à l’aide de pinces de microdissection ultrafines.

Enfin, fixez une ligne de perfusion saline dans la coupelle de perfusion. Cette section décrit comment construire et utiliser un système de délivrance de substances gustatives. Le système est composé d'un tube d'essai comportant plusieurs orifices.

Les ouvertures permettent l'entrée du proboscis de l'animal, du collecteur de substances gustatives, d'un capteur de couleur, et elles autorisent la circulation de l'eau. Pour construire ce système, préparez d'abord un tube d'essai destiné au proboscis. Réalisez un trou de la taille du proboscis à l'aide d'un fer à souder.

Ensuite, construire une section tamisée à l'intérieur du tube afin de maintenir le proboscis en place. Couper cinq millimètres au-dessus du trou, placer la maille à cet endroit avec de la cire, puis reconnecter les tubes à l'aide de cire et d'époxy. Utiliser un système de perfusion pressurisé pour administrer les substances gustatives.

Reliez autant de tubes de stimulus gustatif que nécessaire à un collecteur. Pour raccorder le tube de sortie du stimulus gustatif, percez un trou à environ un centimètre au-dessus du maillage, puis fixez fermement le tube de sortie à l’aide d’une résine époxy. Dans chaque stimulus gustatif, ajoutez un colorant artificiel pouvant être détecté par un capteur de couleur.

Fixez un capteur de couleur à l'appareil sur un trou situé à environ un demi-centimètre au-dessus du maillage, et fixez-le en place à l'aide d'une résine époxy. Utilisez une pompe péristaltique pour acheminer de l'eau distillée dans le système à l'aide d'un tube en silicone. Recueillez l'eau usée dans un récipient de grande taille.

Utilisez une pompe pneumatique pour délivrer les substances gustatives à l'aide de jets d'air. Commencez maintenant à pomper de l'eau propre à travers le tube et délivrez des impulsions de substance gustative pour tester le capteur de couleur. Introduisez maintenant les deux tiers distaux du proboscis du papillon dans le tube de test.

À l’aide de pinces, étendre la proboscide et la pousser délicatement dans le trou. Ensuite, fixer la proboscide en place à l’aide d’une cire dentaire douce et d’une couche d’époxy. Relier maintenant la ligne de perfusion saline et régler le débit de perfusion.

Ensuite, immergez l'électrode de terre de la tétrade en fil torsadé dans le bain salin. Puis, à l'aide d'un micromanipulateur, positionnez la tétrade à côté du nerf maxillaire et avancez-la lentement dans le nerf. Après la détection de signaux de potentiels d'action, laissez le montage se stabiliser pendant au moins 10 minutes avant d'effectuer les enregistrements.

Des enregistrements ont été effectués à partir de neurones récepteurs du goût avant, pendant et après l'administration du tastant en utilisant le protocole décrit. Le début et la fin d'une impulsion d'une seconde de chaque tastant ont été surveillés par le capteur de couleur. Les tastants ont provoqué des potentiels d'action qui ont été détectés par chacun des quatre canaux.

Dans les trains d'impulsions, des potentiels d'action individuels pouvaient être observés. Un logiciel de tri des pics a été utilisé pour attribuer ces pics à des neurones uniques. La réponse de trois neurones récepteurs gustatifs différents à six substances sapides administrées en séquence révèle des niveaux différents d'activité de base et de sélectivité vis-à-vis des substances sapides.

En outre, les réponses présentaient des durées différentes. Certaines étaient synchronisées avec la durée du stimulus, tandis que d'autres persistaient au-delà du stimulus. Des enregistrements intracellulaires pouvaient également être réalisés à partir des axones des récepteurs du goût à l'aide d'électrodes en verre pointues conventionnelles.

Les enregistrements intracellulaires étaient très similaires aux réponses observées à l’aide de la technique de tétrade décrite, mais les enregistrements par tétrade étaient plus faciles à réaliser, plus durables et plus robustes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d’exposer les nerfs maxillaires et la zone sous-œsophagienne chez le mandi-casecsta, et de construire un système de délivrance de substances gustatives avec un contrôle temporel précis. Lors de l’exécution de ce protocole, portez des gants de sécurité de laboratoire et un masque facial, car la fine poudre provenant des écailles jetées par le mandi-casecsta peut être allergisante.

Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en trois heures et demie. En suivant cette procédure, des enregistrements simultanés provenant de plusieurs régions cérébrales peuvent également être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : comment les réponses des neurones récepteurs gustatifs aux substances sapides sont-elles transformées lorsqu'elles sont transmises aux neurones cibles postsynaptiques ?