Nouvelles méthodes pour étudier le codage désintoxiqué

L’objectif global de ces méthodes est d’étudier le codage gustatif chez un mandi-casecsta animal simple en enregistrant l’activité de plusieurs neurones récepteurs in vivo, tout en délivrant et en surveillant des impulsions de saveurs précisément chronométrées. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés sur la gustation, telles que la façon dont les goûteurs sont codés par des populations de neurones récepteurs gustatifs. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’enregistrer in vivo plusieurs neurones gustatifs avant, pendant et après des stimuli savoureux délivrés avec précision.

Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent la trouver difficile car la procédure de dissection est complexe. Pour cette raison, nous espérons que la démonstration visuelle de la méthode vous sera utile. Ces techniques ont été développées par Sam Writer lorsqu’il était étudiant diplômé dans mon laboratoire, avec Alejandra, Kui Sun fera la démonstration de ces procédures.

Trois jours après l’éclosion, choisissez un papillon de nuit de l’un ou l’autre sexe qui a une apparence généralement saine. Les ailes doivent être complètement déployées, et le proboscis et les antennes doivent être bien formés et intacts. Dans une hotte, insérez le papillon sélectionné dans un tube de retenue jusqu’à ce que la tête soit exposée.

Ensuite, immobilisez le papillon en insérant du papier de soie dans l’autre extrémité du tube. Maintenant, à l’aide d’air sous pression délivré par une seringue, retirez les cheveux de la tête exposée. Ensuite, placez le tube sur une plate-forme d’argile dans une boîte de Pétri.

Orientez la tête dorsale vers le haut. Ensuite, protégez les antennes et le proboscis. Tout d’abord, faites des couvercles pour chaque structure à partir de pointes de pipette de 200 microlitres coupées en longueurs d’un demi-centimètre.

Pour manipuler la trompe, préparez un crochet à partir d’un morceau de fil. Étendez la trompe dans l’une des couvertures jusqu’à ce que la partie la plus proximale de la trompe soit protégée. Fixez le tube à la partie dorsale de la capsule céphalique à l’aide de cire batik ferme.

Ensuite, recouvre soigneusement les antennes et fixez les tubes avec de la cire batik. Maintenant, stabilisez le cerveau en coupant le muscle du compresseur de la boucle. Sous le microscope de dissection, utilisez des outils de microdissection pour ouvrir la capsule céphalique en faisant une petite incision juste en dessous de la trompe.

Pour confirmer que le muscle est coupé, proposez une solution de saccharose aux deux tiers distaux de la trompe et, pendant cinq minutes, assurez-vous que la trompe ne s’étend pas. Ensuite, fermez la capsule céphalique à l’aide d’une couche de cire de batik fondue. Pour perfuser le cerveau avec une solution saline, construisez une tasse de cire autour de la face ventrale de la tête.

À l’aide d’un épilateur électrique, commencez à construire une tasse de cire le long de l’avant de la tête en vous déplaçant vers l’arrière. Gardez le proboscis et les tubes antennes à l’intérieur de la cupule. Continuez à construire la tasse vers l’extérieur et vers le haut jusqu’à ce qu’elle atteigne le niveau des yeux.

À l’aide d’une pince, prenez les palpes labiales et fixez-les à la tasse de cire à l’aide de cire fondue. Ensuite, scellez toutes les ouvertures dans la tasse et les tubes de cire à l’aide d’une couche d’époxy binaire. Mélangez l’époxy à l’aide d’un cure-dent.

Tout d’abord, couvrez les surfaces extérieure et intérieure de la tasse. Deuxièmement, remplissez la partie du tube de retenue entourant le cou afin que la tête soit maintenue plus fermement. Après 20 minutes, vérifiez que la coupe ne fuit pas.

Pour commencer la chirurgie du cerveau, coupez d’abord les palpes labiaux. Pour ouvrir la face ventrale de la capsule céphalique, coupez la cuticule le long de l’arrière et de l’avant de la tête et autour des yeux. Ensuite, coupez le long de l’arrière de la tête et faites d’autres coupes le long de l’avant de la tête près de la trompe.

Ensuite, soulevez doucement le lambeau de cuticule avec une pince pour exposer le cerveau. Maintenant, effectuez l’étape la plus critique, en exposant la ZES et les nerfs maxillaires. Retirez lentement et soigneusement le tissu adipeux et la trachée.

Rincez fréquemment le cerveau avec une solution saline fraîche. Soyez très prudent, car il est très facile d’écraser les nerfs maxillaires. Lorsque la ZES et les nerfs maxillaires seront enfin visibles, ils seront recouverts d’une fine gaine.

Pour retirer cette gaine, égouttez l’excédent de solution saline puis fragilisez la gaine en appliquant une solution de dispase de collagénase à 10 %. Après avoir trempé pendant cinq minutes, rincez la solution plusieurs fois avec une solution saline. Ensuite, après plusieurs rinçages avec une solution saline, retirez délicatement la gaine à l’aide d’une pince à microdissection ultrafine.

Enfin, fixez une goutte à goutte saline dans la coupelle de perfusion. Cette section décrit comment créer et utiliser un système de distribution de dégustations. Le système se compose d’un tube à essai avec plusieurs ouvertures.

Les ouvertures fournissent l’entrée pour la trompe de l’animal, le collecteur de saveurs, un capteur de couleur, et elles permettent à la fleur de passer à travers l’eau. Pour construire ce système, préparez d’abord un tube d’essai pour la trompe. Faites un trou de la taille d’une trompe à l’aide d’un fer à souder.

Ensuite, construisez une section grillagée à l’intérieur du tube pour maintenir la trompe en place. Coupez cinq millimètres au-dessus du trou, placez-y le treillis avec de la cire et reconnectez les tubes à l’aide de cire et d’époxy. Utilisez un système de perfusion sous pression pour administrer les saveurs.

Joignez autant de tubes savoureux que nécessaire à un collecteur. Pour connecter le tube de sortie savoureux, faites un trou à environ un centimètre au-dessus du treillis, puis fixez-y le tube de sortie avec de l’époxy. Dans chaque goût, incluez un colorant artificiel à détecter par un capteur de couleur.

Fixez un capteur de couleur à l’appareil à un trou d’un demi-centimètre autour du treillis et fixez-le à cet endroit à l’aide d’époxy. Utilisez une pompe péristaltique pour fournir de l’eau distillée dans le système via un tube en silicone. Récupérez les eaux usées à l’aide d’un grand récipient.

Utilisez une pompe pneumatique pour délivrer les saveurs avec des bouffées d’air. Maintenant, commencez à pomper de l’eau propre à travers le tube et délivrez des impulsions de goût pour tester le capteur de couleur. Maintenant, chargez les deux tiers de la trompe de mite dans le tube à essai.

À l’aide d’une pince, étendez la trompe et enfoncez-la doucement dans le trou. Ensuite, scellez la trompe en place avec de la cire dentaire molle et une couche d’époxy. Maintenant, connectez la ligne de perfusion saline et réglez le débit de perfusion.

Ensuite, plongez l’électrode de terre de la tétrode de fil torsadé dans le bain salin. Ensuite, à l’aide d’un micromanipulateur, positionnez la tétrode à côté du nerf maxillaire et faites-la avancer lentement dans le nerf. Après avoir détecté les signaux de pointe, laissez la préparation se stabiliser pendant au moins 10 minutes avant de prendre les enregistrements.

Des enregistrements ont été effectués à partir de neurones récepteurs gustatifs avant, pendant et après l’accouchement savoureux en utilisant le protocole décrit. Le début et le décalage d’une impulsion d’une seconde de chaque savourateur ont été surveillés par le capteur de couleur. Les dégustations ont provoqué des pics qui ont été détectés par chacun des quatre canaux.

À l’intérieur des trains de pointes, des potentiels d’action individuels ont pu être observés. Un logiciel de tri des pointes a été utilisé pour attribuer ces pointes à des neurones uniques. La réponse de trois neurones récepteurs gustatifs différents à six dégustations délivrées en séquence révèle différents niveaux d’activité de base et de sélectivité pour les dégustations.

De plus, les réponses avaient un calendrier différent. Certains sont verrouillés sur la durée du stimulus, tandis que d’autres durent plus longtemps que le stimulus. Des enregistrements intracellulaires pourraient également être effectués à partir d’axones de récepteurs gustatifs à l’aide d’électrodes en verre pointues conventionnelles.

Les enregistrements intracellulaires étaient très similaires aux réponses observées à l’aide de la technique de tétrode décrite, mais les enregistrements de tétrode étaient plus faciles à faire, plus durables et plus robustes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’exposer les nerfs maxillaires et la zone sous-œsophagienne dans le mandi-casecsta, et d’être en mesure de construire un système d’administration savoureux avec un contrôle temporal précis. Lors de l’exécution de ce protocole, portez des gants de sécurité de laboratoire et un masque facial, car la fine goutte de tartre poudreuse de mandi-casecsta peut être allergène.

Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en trois heures et demie. À la suite de cette procédure, des enregistrements simultanés de plusieurs zones du cerveau peuvent également être effectués pour répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont les réponses des neurones récepteurs gustatifs aux dégustations sont transformées lorsqu’elles sont transmises aux neurones cibles postsynaptiques.