Name: Semi-automatisées longitudinale axée sur les Microcomputed tomographie Quantitative analyse structurale d’un modèle de Rat nu Fracture vertébrale liée à l’ostéoporose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Découvrez une méthode semi-automatisée d'analyse structurale par microtomographie chez le rat nu pour étudier les fractures vertébrales liées à l'ostéoporose. Cette approche permet d'évaluer l'efficacité des traitements de régénération osseuse.

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La recherche a été financée par une subvention de la California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (TR2-01780).

toutes les expérimentations animales ont été effectuées en vertu d’un protocole approuvé par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) du Cedars-Sinai Medical Center (protocole # 3609). L’anesthésie a été administrée pendant toutes les procédures d’imagerie et chirurgies. Tous les animaux étaient logés conformément aux protocoles approuvés de IACUC.
 Remarque : le protocole expérimental du présent protocole est illustré à la Figure 1. Acheter des rats âgés de six semaines avec leurs ovaires enlevés chirurgicalement et les nourrir un LCD composé de phosphate de calcium et 0,77 % 0,01 %. Après une période de 4 mois et d’un écran LCD, percer un défaut vertébral de taille critique dans les corps vertébraux lombaires (L4-L5) quatrième et cinquième. Après la chirurgie, l’image les rats le jour 1 et les semaines 2, 4, 8 et 12 après le défaut de mise en place. Localiser les défauts marginaux sur le scan du jour 1, réorienter vers une position standard et définir un volume cylindrique d’intérêt (VOI). Enregistrer automatiquement les scans µCT ultérieures (c'est-à-dire, pour les semaines 2, 4, 8 et 12) de chaque rat à la position standard définie pour l’analyse correspondante à jour 1. Appliquer le jour 1 prédéfinis VOI pour les scans enregistrés. Évaluer la densité osseuse du volume et la masse volumique apparente des voi.
 1. induction of Osteoporosis <ol><li>mis six semaines athymiques ovariectomisées rats sur un écran LCD composé de phosphate de calcium et 0,77 % 0,01 % de 4 mois.</li>
	<li>Commutateur de retour à un régime alimentaire normal. 
	Remarque : Ces rats seront considérées comme une &#34; des rats ostéoporotiques &#34; ci-après.</li>
</ol> 2. Modèle de défaut vertébral Remarque : le moment est de 40-50 min par animal.
<ol><li>Autoclave tout chirurgical des outils avant la chirurgie.</li>
	<li>Dans le cas de plusieurs chirurgies, stériliser tous les instruments chirurgicaux.
	<ol><li>Laver les outils et les placer dans un bain sonicateur pour 5 min. placer dans un ensemble de stérilisateur boudin chaud à 250 ° C pendant 20 s. autoriser les outils se refroidir pendant 5 min.</li>
	</ol></li> <li>Anesthésie Induce.
	<ol><li>Place le rat ostéoporotique dans la chambre de l’induction attaché à une machine d’anesthésie avec un système central de balayage. Induire l’anesthésie à l’isoflurane de 5 % à 100 % d’oxygène et de maintenir par cône de nez à l’isoflurane 2 à 3 %. La pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.</li>
		<li>S’appliquent à un stimulus d’orteil-pincée pour assurer un plan adéquat de l’anesthésie. Si aucune réponse n’est constatée, ouverture de la procédure.</li>
	</ol></li> <li>Placez le rat anesthésié en décubitus dorsal sur un coussin chauffant (37 ° C) et étendre les membres en utilisant un système de rétraction fixateur magnétique ( Figure 2 a). 
	Remarque : La température du coussin chauffant est importante pour la prévention de l’hypothermie, comme un rat anesthésié est incapable de réguler sa température corporelle.</li>
	<li>Raser la zone abdominale à l’aide d’un rasoir électrique. Il tamponner à base d’iode antiseptique et chlorhexidine gluconate de 0,5 %, suivie de l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Le rat injecter carprofène (5 mg/kg de poids corporel (BW), sous-cutanée (SQ)) avant d’entamer la procédure chirurgicale.</li>
	<li>Utiliser un scalpel stérile pour couper la peau. Commencer l’incision de 1 cm en dessous du processus xiphoïde et couper à travers la ligne médiane (~ 5-8 cm) ( Figure 2 b).</li>
	<li>Utiliser des ciseaux chirurgicaux à pratiquer une incision de l’aponévrose par le biais de la linea alba pour accéder à la cavité abdominale ( Figure 2).</li>
	<li>Exposer la cavité abdominale à l’aide d’écarteurs ( Figure 2D).</li>
	<li>Faire dévier les intestins vers la droite du rat pour exposer l’aorte abdominale et le rein gauche ( Figure 2E). Palper la colonne lombaire avant de procéder à l’exposer. Pour éviter la déshydratation, utiliser des gazes imbibés stériles avec une solution saline stérile pour envelopper les organes internes.</li>
	<li>Thermocautery d’utilisation pour les exposer dans les couches de la face antérieure des corps vertébraux lombaires L4-5 et de les isoler du tissu conjonctif et les muscles environnants ( Figure 2F -G). 
	Remarque : Thermocautery devrait servir à contrôler le saignement au cours de la dissection.</li>
	<li>Utiliser un tampon de coton stérile imprégnée de sérum physiologique stérile pour enlever les tissus sanguins et résiduel de la vertèbre L4. Utiliser une fraise de perceuse trépan stérile (~ 2 mm de diamètre) pour percer un défaut de 5 mm de profondeur osseuse dans le centre de la face exposée antérieure du corps vertébral (Figure 2 H-I). 
	Remarque : Appliquer une pression minimale à percer seulement le cortex ventrale et l’OS trabéculaire sous-jacent ; Évitez de percer à travers le cortex dorsal. Notez que les vertèbres des rats ostéoporotiques sont très fragiles. Utilisez un coton-tige pour nettoyer le défaut et appliquez une pression pour arrêter le saignement, le cas échéant.</li>
	<li>Répéter l’étape 2.11 sur la vertèbre L5 pour créer un total de 2 défauts par rat ( Figure 2J).</li>
	<li>Retourne les intestins dans la cavité abdominale.</li>
	<li>Utiliser une suture chirurgicale résorbable synthétique de vicryl (3-0 vicryl incolores 27 &#34; cône SH) dans un motif continu pour la suture de l’aponévrose ( Figure 2 K).</li>
	<li>Fermer la peau à l’aide d’une suture non résorbable de nylon monofilament 4-0 dans un motif simple interrompu ( Figure 2 L).</li>
	<li>Appliquer 100 µL d’adhésif topique de la peau sur le dessus de la suture de la peau et entre eux pour assurer la fermeture complète de la peau.</li>
	<li>Injecter le rat sonnerie amorcez tiède (37 ° C) &#39; solution s (1CC/100 g, BW, SQ) pour prévenir l’hypothermie et déshydratation.</li>
	<li>Injecter le rat de buprénorphine (0,5 mg/kg de poids vif, SQ) avant la chirurgie et tous les 8 à 12 h pour soulager la douleur après l’opération si nécessaire.</li>
	<li>Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. En outre, de ne pas retourner un animal qui a subi une chirurgie à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce qu’il a pleinement récupéré.</li>
	<li>Après que l’animal a récupéré sur le coussin chauffant, retourner à sa cage. 
	NOTE : Maison les rats individuellement (c.-à-d., dans des cages séparées) pour prévenir les rat-de-rat mutilé les sutures et enroulés.</li>
	<li>Placer chow trempée dans l’eau dans une boîte de Pétri sur le plancher de la cage pour quelques jours post-op aider à atteindre la nourriture les rats.</li>
	<li>Administrer carprofène (5 mg/kg de poids vif, SQ) 24h après chirurgie pour soulager la douleur toutes les 24 h si nécessaire.</li>
	<li>Enlever les sutures de la peau, tandis que l’animal est inférieur à 2 % isoflurane anesthésie 10-14 jours après les opérations.</li>
</ol> 3. Balayage de la gamme Remarque : le timing est 30-40 min par animal.
<ol><li>Le lendemain de l’intervention chirurgicale, placez le rat ostéoporotique dans le compartiment d’induction attaché à une machine d’anesthésie avec un système central de balayage. Induire l’anesthésie à l’isoflurane de 5 % à 100 % d’oxygène et de maintenir par le cône de nez à 2-3 % isoflurane.</li>
	<li>Scan le rat à l’aide d’un scanner µCT in vivo. Répéter le balayage pour l’analyse longitudinale de la régénération osseuse. 
	Remarque : Assurez-vous que tous les animaux sont analysés en utilisant les mêmes paramètres (p. ex., l’énergie des rayons x, numérisation de moyenne intensité, voxel taille et résolution d’image) et dans un similaorientation de la r. Par exemple : l’énergie des rayons x, kVP 55 ; courant, µA 145 ; taille de voxel, 35 µm ; incréments, 115 µm ; et temps d’intégration, 200 ms ; avec les échantillons dans du PBS. Se référer à Bouxtein et al. 34 pour plus d’explications et de considérations impliqués dans rongeurs µCT numérisation pour une évaluation de la microstructure de l’OS. Idéalement, la plus haute résolution de numérisation disponible serait utilisée pour tous les scans ; Cependant, scans haute résolution nécessitent des temps d’acquisition, génèrent de grands ensembles de données et exposent les animaux à plus des rayonnements ionisants. Ce dernier peut introduire des effets indésirables, y compris la guérison des fractures une diminution. Par conséquent, le compromis entre des données supplémentaires et de temps d’acquisition doivent être examiné attentivement.</li>
</ol> 4. Séparation vertébrale Remarque : le moment est de 20-30 min par exemple.
<ol><li>Contour de la vertèbre d’intérêt, comme illustré dans la Figure 3 a-I. n’oubliez pas d’inclure toutes les parties de la vertèbre tout en excluant les pièces qui appartiennent aux vertèbres adjacentes.
	<ol><li>Cliquez sur &#34; programme d’évaluation µCT &#34; et sélectionnez l’exemple dans le menu.</li>
		<li>Contour de chaque tranche à l’aide de la souris.</li>
		<li>Utilisation du &#34; Z &#34; bar pour aller à la tranche suivante.</li>
	</ol></li> <li>Sauver la vertèbre profilée dans un fichier séparé ( Figure 3J -K) en cliquant sur &#34; File &#34; &#8594; &#34; GOBJ Save &#34; tous les deux tranches.</li></ol>
 5. définition de la VOI pour une évaluation Quantitative longitudinale Remarque : les étapes suivantes dépendent si l’analyse est de 1 jour après la chirurgie (vertèbre de référence) ou de la date ultérieure points ( cibler les vertèbres).
<ol><li>Vertèbre référence. 
	Remarque : Le moment est de 20-30 min par échantillon.
	<ol><li>Z-rotation, mesurer l’angle des marges à l’aide d’une XY-tranche du centre du défaut ( Figure 4 a -B).
		<ol><li>Sur le plan Z, allez à la zone de la vertèbre où le défaut est plus clair et écran capture la vertèbre.</li>
			<li>Dans un logiciel de présentation, préparer un objet en forme de rectangle qui rentrera dans le vice.</li>
			<li>Faire pivoter l’image de la vertèbre, telle que le défaut fait face vers le haut et les défauts marginaux est parallèles aux côtés du rectangle.</li>
			<li>Mesure de l’angle de rotation (faites un clic droit sur l’image &#8594; &#34; Format photo &#34; &#8594; &#34; taille &#34;).</li>
			<li>Utiliser l’angle mesuré pour faire pivoter la vertèbre ( Figure 4).
			<ol><li>Ouvrir une nouvelle fenêtre de DECterm (&#34; Gestionnaire de Session &#34; &#8594; &#34; Applications &#34; &#8594; &#34; DECterm &#34;).</li>
				<li>Run &#34; ipl &#34; :</li>
				<li>Ipl &#62; turn3d</li>
				<li>-entrée [en] &#62;</li>
				<li>-sortie [out] &#62;</li>
				<li>-turnaxis_angles [0,000 90,000 90.000] &#62; 90 90 0</li>
				<li>-turnangle [0,000] &#62; angle mesuré</li>
				<li>-img_interpol_option [1] &#62;</li></ol>
			</li></ol></li> <li>X-rotation, mesurer l’angle des marges à l’aide une YZ-tranche du centre du défaut ( Figure 4 -E). Utilisez l’angle mesuré pour faire pivoter la vertèbre ( Figure 4F).
		<ol><li>Cliquez sur &#34; YZ &#34; dans &#34; uCT programme d’évaluation &#34; et répétez les étapes 5.1.1.1-5.1.1.5.2.</li>
			<li>Ipl &#62; isq</li>
			<li>-aim_name [en] &#62;</li>
			<li>-isq_filename [default_file_name] &#62; insérer le répertoire du fichier ISQ (p. ex., &#34; DK0 : [MICROCT. DONNÉES. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ &#34;)</li> <li>-pos [0 0 0] &#62;</li> <li>-dim [-1-1 -1] &#62;</li></ol></li> <li>Flip la vertèbre pivotée en changeant le plan XY au plan ZX.
		<ol><li>Ouvrir une nouvelle fenêtre de DECterm (&#34; Gestionnaire de Session &#34; &#8594; &#34; Applications &#34; &#8594; &#34; DECterm &#34;).</li>
			<li>Run &#34; ipl &#34; :</li>
			<li>Ipl &#62; flip</li>
			<li>-entrée [en] &#62; à</li>
			<li>-entrée [out] &#62; out2</li>
			<li>-new_xydir [yz] &#62; zx</li></ol>
		</li> <li>Définir la VOI.
		<ol><li>Tirage au sort une circulaire contour du défaut à l’aide d’une tranche du centre du défaut en sélectionnant l’icône contour circulaire en &#34; programme d’évaluation uCT &#34; ( Figure 6 a). Copie que le contour et le coller sur toutes les tranches dans le défaut ( Figure 6 b). 
			Remarque : Étant donné que tous les défauts ont été créés en utilisant la même procédure, analyser le même nombre de tranches et, par la suite, le volume total (TV) pour tous les échantillons.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Vertèbre cible. 
	Remarque : Le moment est de 10-20 min par échantillon.
	<ol><li>Charge le DICOM files de la cible et les vertèbres de la référence à la fenêtre principale du logiciel d’analyse image. 
		Remarque : Pour éviter les changements de valeur de niveaux de gris, définissez la même sortie type de données que les fichiers DICOM originales dans le menu de chargement.</li>
		<li>Registre à la référence de la vertèbre.
		<ol><li>Lancement la &#34; 3D Voxel enregistrement &#34; module et la vertèbre de référence comme l’entrée le &#34; Volume de Base &#34; et la vertèbre de cible comme le &#34; Match Volume. &#34; cliquez sur &#34; Registre &#34; pour enregistrer les vertèbres ( Figure 5).</li>
		</ol></li> <li>Enregistrer les fichiers enregistrés en utilisant les mêmes données de type et l’importer dans un environnement µCT.</li>
		<li>Appliquer le VOI.
		<ol><li>Appliquer le VOI défini pour la vertèbre de référence à la vertèbre cible enregistré en cliquant sur &#34; programme d’évaluation uCT &#34; &#8594; &#34; File &#34; &#8594; &#34; GOBJ charge &#34; et en sélectionnant le GOBJ créé précédemment. Vérifier que la VOI et les défauts sont concentriques.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 6. MicroCT analyse Remarque : la synchronisation est 10-20 min par exemple.
<ol><li>Envoyer la VOI pour évaluation à l’aide d’un programme d’évaluation de µCT ( Figure 6). 
	NOTE : Assurez-vous d’utiliser les mêmes paramètres lors de l’analyse toutes les VOIs. Veillez à ce que le seuil est fixé suffisamment élevé pour omettre le bruit de fond avec une perte minimale de l’OS. Si l'on utilise un biomatériau radio-opaque, un certain nombre de stratégies pourrait être utilisé pour analyser la formation osseuse. S’il y a une différence de densité entre le tissu de biomatériaux et d’os, ce biomatériau peut être segmenté sur 35 , 36. Dans le cas contraire, les enquêteurs pourraient évaluer qualitativement les différences dans la formation osseuse entre les groupes expérimentaux.</li>
</ol> 7. L’euthanasie <ol><li>PPlace ostéoporotique rat dans la chambre de l’induction attaché à une machine d’anesthésie. Induire l’anesthésie à l’isoflurane de 5 % à 100 % d’oxygène.</li>
	<li>Entretien anesthésie par l’intermédiaire de coiffe et effectuer l’euthanasie par incision de la cavité thoracique pour produire un pneumothorax bilatéral 37.</li>
</ol>

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</ol>

Cette recherche a été financée par une subvention de la California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (TR2-01780).

L’ostéoporose est la cause la plus répandue des fractures vertébrales causées par une augmentation de la charge sur la colonne vertébrale et qui aboutissent à l’effondrement du corps vertébral. Toutefois, il est pratiquement impossible de générer une blessure à un rongeur qui réplique authentiquement une semblable tassements vertébraux. Au lieu de cela, chercheurs en créant un vide cylindrique dans le centre du corps vertébral pour imiter OVCFs16,17,<s...

Plus de 200 millions de personnes dans le monde souffrent d’ostéoporose1. Pathologique sous-jacent diminution de la densité minérale osseuse (DMO) et microarchitecture osseuse altérée augmenter la fragilité osseuse et, par conséquent, le risque relatif de fracture2. L’ostéoporose est tellement répandue et nuisible à la santé que l’OMS a défini un problème majeur de santé publique. En outre, comme la population mondiale est prévue pour l’âge, l’ostéoporose devrait devenir encore plus fréquente.
Fractures vertébrales ostéoporotiques sont les fractures de fragilité plus courants, estimées à plus de 750 000 par an aux Etats-Unis. Ils sont associés à une morbidité significative et aussi bien comme une mortalité plus élevée de neuf fois taux3. Dans les essais cliniques, actuellement disponibles interventions chirurgicales, telles que la vertébroplastie et en kyphoplastie, se sont avérées pour être pas plus efficace qu’une imposture traitement4,5, laissant seulement gestion de la douleur disponible pour ces patients. Les traitements actuels de FOCR étant limitées, il est impératif de développer un modèle animal qui peut répliquer le trouble6,7,8. Ces modèles animaux pourraient faciliter tant l’enquête sur les méthodes actuelles de traitement et le développement de nouvelles thérapies qui se traduira en pratique clinique. L’ostéoporose a été induite et maintenue chez les animaux de modèle par le biais de l’administration d’un régime faible en calcium (LCD) en combinaison avec une ovariectomie1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. pour davantage de modéliser la perte osseuse associée à OVCFs, défauts osseux vertébral ont été établis dans des rats immunocompétents ostéoporotiques 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. Dans ce travail, un modèle de défaut vertébral de rats immunodéprimés atteints d’ostéoporose modélisé est présenté. Ce nouveau modèle peut servir à évaluer les thérapies à base cellulaire impliquant des cellules souches provenant de diverses sources et espèces pour la réparation des fractures difficiles, tels que OVCFs.
L’imagerie osseuse est une partie cruciale de l’évaluation des maladies osseuses et des fractures. Les méthodes d’imagerie avancées ont été développés pour l’évaluation précise de la modification de la structure osseuse et de stratégies de régénération25. Parmi eux, l’imagerie µCT a émergé comme une méthode non invasive, facile à utiliser et peu coûteuse qui fournit des images 3D à haute résolution. L’imagerie µCT a plusieurs avantages par rapport aux autres modalités dans l’évaluation des patients atteints d’ostéoporose, qui offre une haute résolution 3D bone microarchitecture26 qui peuvent ensuite être quantitativement analysés. Ce dernier peut alors servir à comparer les effets thérapeutiques des traitements proposés. En effet, l’imagerie in vivo µCT est un étalon-or pour la régénération de défaut vertébral suivi1,16,27. Cependant, quelques publications28,29,30,31 ont utilisé des outils d’enregistrement automatisé pour réduire la dépendance par rapport à l’utilisateur, interpolation, précision erreur et µCT analyse axée sur l’imagerie. Récemment, nous avons été les premiers à utiliser une procédure d’enregistrement pour améliorer l’analyse de la régénération osseuse dans un OS Standard Sub, comme expliqué dans ce protocole32 .
La méthode décrite ici peut être utilisé pour étudier l’effet des thérapies cellulaires roman pour OVCFs, sans être gêné par le hôte réponses de cellules T qui pourraient rejeter xénogéniques ou allogéniques de cellules. L’ostéoporose est induite chez de jeunes rats par ovariectomie (OVX) et un écran LCD de 4 mois. Le jeune âge des rats OVX, combinée avec l’écran LCD, nous permis d’atteindre une masse osseuse basse pointe, imitant l’ostéoporose postménopausique par menant à la perte osseuse irréversible. Cela peut s’expliquer en partie par le fait que, au cours de l’écran LCD et à environ 3 mois d’âge, la transition de rats de l’os de modélisation de remodelage de phase à la vertèbre lombaire33, ce qui augmente la probabilité de maintenir l’ostéoporose au cours temps. À l’aide de jeunes animaux rend ce modèle plus économique, car ils coûtent moins cher. Néanmoins, il est limité par intrinsèquement sans compter les changements biologiques chez l’animal de vieillissement.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>MWI Santé animale, Pasadena, Californie</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>BetadineSolution</td><td>MWI Santé animale, Pasadena, Californie</td><td>4677</td><td></td></tr><tr><td>Gluconate de chlorhexidine 2 % gommage</td><td>MWI Santé animale, Pasadena, Californie</td><td>510083</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique 70 % pinte</td><td>MWI Santé animale, Pasadena, Californie</td><td>501044</td><td></td></tr><tr><td>Carprofène</td><td>MWI Santé animale, Pasadena, CA</td><td>26357</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine 0,3 mg/mL</td><td>MWI Santé animale, Pasadena, CA</td><td>56163</td><td></td></tr><tr><td>Rats nus athymiques ovariectomisés</td><td>Harlan Laboratories, Indianapolis, IN</td><td>Hsd :RH-Foxn1 rnu</td><td></td></tr><tr><td>Aliments à faible teneur en calcium</td><td>Newco Distributors, Inc., CA</td><td>1814948 (5AV8 AIN-93M avec faible teneur en calcium)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies Corporation</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>Dermabond</td><td>J AND J ETHICON</td><td>DHVM12</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’anesthésie</td><td>Patterson Scientific</td><td>TEC 3EX</td><td></td></tr><tr><td>Chambres d’induction à dessus coulissant</td><td>Patterson Scientific</td><td>78917833</td><td></td></tr><tr><td>ProStation Poste de travail chauffant</td><td>Patterson Scientific</td><td>78914731</td><td></td></tr><tr><td>Champ chirurgical</td><td>HALYARD HEALTH INC</td><td>89101</td><td></td></tr><tr><td>Système de rétraction de fixateur magnétique</td><td>Fine Science Tools, Inc., CA</td><td>18200-50</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection, 10 cm, courbé, SS</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris, 11,5 cm, 45 &deg ; Angle, Dentelé, Sharp/Sharp</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>503225</td><td></td></tr><tr><td>Pinces, n° 5</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>555048FT</td><td></td></tr><tr><td>Micro Mosquito Forceps Hemostatic</td><td>Precision Instruments, FL</td><td>503360</td><td></td></tr><tr><td>Gaze de coton stérile</td><td>Medtronic, MINNEAPOLIS, MN</td><td>9024</td><td></td></tr><tr><td>Lances à absorption - Montées/stériles</td><td>Fine Science Outils, CA</td><td>18105-01</td><td></td></tr><tr><td>Seringue, 1 mL</td><td>TERUMO TERUMO MED</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille, calibre 25</td><td>BD MED SYS INJECTION SYS</td><td></td><td></td></tr> 305127 <tr><td>Hotte à flux laminaire</td><td>Baker</td><td>SterilGARD e3-Class II Type A2 Armoire</td><td></td>de</tr><tr><td>biosécurité Unité de cautérisation thermique</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>501292</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Drill OmniDrill115/230V</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Tréphines pour micro-foret, 2 mm de diamètre</td><td>Outils de science fine, CA</td><td>18004-20</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicryl non teint 27" SH conique</td><td>J ET J</td><td>ETHICON 1663G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Ethilon noir 18" PC3 coupe conventionnelle</td><td>J AND J</td><td>ETHICON 1954G</td><td></td></tr><tr><td>Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40)</td><td>Scanco Medical</td><td>vivaCT 40</td><td></td></tr><tr><td>Suite logicielle des systèmes microCT Scanco Medical</td><td></td><td>vivaCT 40</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse</td><td>Imagerie biomédicale, Mayo Clinic, Rochester, MN</td><td>Analyze 12</td><td>Logiciel d’analyse d’images</td></tr><tr><td>Pommade</td> <td>oculaire vétérinaire</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

semi-automatisées longitudinale axée sur les microcomputed tomographie quantitative analyse structurale d’un modèle de rat nu fracture vertébrale liée à l’ostéoporose

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Fractures vertébrales liées à l’ostéoporose (OVCFs) sont un besoin commun et cliniquement non satisfait avec l’augmentation de la prévalence dans le vieillissement de la population mondiale. Des modèles animaux de FOCR sont essentiels pour le développement préclinique de stratégies ingénierie tissulaire translationnelle. Alors qu’un certain nombre de modèles existe actuellement, ce protocole décrit une méthode optimisée pour induire de multiples défauts vertébraux hautement reproductibles dans un seul rat nu. Une tomographie de roman microcomputed semi-automatique longitudinale (µCT)-base d’une analyse structurelle quantitative des anomalies vertébrales est aussi détaillée. Brièvement, des rats ont été projetés à plusieurs points de temps post-op. L’analyse du jour 1 a été réorientée vers une position standard, et un volume standard d’intérêt a été défini. Scans µCT ultérieures de chaque rat ont été enregistrées automatiquement à l’analyse de la journée 1 donc le même volume d’intérêt a été ensuite analysé pour évaluer d’une néo-formation osseuse. Cette approche versatile adaptable à une variété d’autres modèles où analyse longitudinale axée sur l’imagerie pourrait profiter d’un alignement semi-automatique 3D précis. Globalement, ce protocole décrit un système facilement quantifiable et facilement reproductible pour la recherche sur l’ostéoporose et l’OS. Le protocole suggéré prend 4 mois pour induire l’ostéoporose dans nues ovariectomisées et entre 2,7 et 4 h à générer, d’images et d’analyser les deux défauts vertébraux, selon la taille du tissu et du matériel.

Utilisant ce protocole, on peut l’image et de quantifier la régénération de n = 8 modélisés anomalies vertébrales ostéoporotiques à travers différents moments. La correspondance anatomique obtenue par la procédure d’enregistrement permet l’analyse de la VOI même à tous les points dans le temps. Il en résulte une analyse histomorphométrique 3D longitudinales très précises, même lorsque les marges de la malformation originale ne sont plus reconnaissables. Nous avons utilisé cinq points dans...

Le but du présent protocole est de générer un modèle de fractures vertébrales liées à l’ostéoporose rat nu qui peut être évalués longitudinalement en vivo à l’aide d’une microcomputed semi-automatique axée sur la tomographie quantitative analyse structurale.

Semi-automatisées longitudinale axée sur les Microcomputed tomographie Quantitative analyse structurale d’un modèle de Rat nu Fracture vertébrale liée à l’ostéoporose

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

L'objectif général de ce modèle chirurgical et de cette méthode d'analyse d'image est d'observer l'effet de votre traitement sur un modèle préclinique de fracture vertébrale compressive liée à l'ostéoporose. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative gliale, telles que : quel traitement pourrait être efficace contre les fractures vertébrales compressives liées à l'ostéoporose, et de quelle manière un tel traitement favoriserait-il la régénération osseuse ? Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation de rats nus, ce qui permet de tester de nouveaux traitements in vivo sans risque de rejet immunitaire.En outre, la régénération osseuse qui sous-tend cette méthode présentée ici est semi-automatisée, ce qui la rend plus précise et moins dépendante de l'utilisateur que les méthodes publiées précédemment. Le Dr Wafa Tawackoli, chercheuse scientifique de notre laboratoire, démontrera la procédure. Induisez d'abord l'anesthésie chez un rat ostéoporotique à l'aide de 5 % d'isoflurane dans 100 % d'oxygène, puis transférez-le vers un embout nasal avec 2 à 3 % d'isoflurane pour le maintien de l'anesthésie.Rasez la zone abdominale à l’aide d’un rasoir électrique. Passez un antiseptique à base d’iode dans du gluconate de chlorhexidine à 0,5 %, suivi d’éthanol à 70 %. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie.Appliquer une stimulation par pincement des orteils pour s'assurer d'un niveau adéquat d'anesthésie. Si aucune réponse n'est observée, commencer la procédure. Placer le rat anesthésié en décubitus dorsal sur un tapis chauffant réglé à 37 degrés Celsius et étirer les membres à l'aide d'un système de rétraction à fixateur magnétique.Injecter le rat par voie sous-cutanée avec du carprofène avant de commencer la procédure chirurgicale. Après avoir pratiqué une incision de cinq à huit centimètres dans la peau, en partant d'un centimètre sous le processus xiphoïde et passant par la ligne médiane, utiliser des ciseaux chirurgicaux pour inciser l'aponévrose en traversant la ligne blanche afin d'accéder à la cavité abdominale. Exposer la cavité abdominale à l'aide de rétracteurs.Déplacez les intestins vers la droite du rat afin d'exposer l'aorte abdominale et le rein gauche. Pour éviter la déshydratation, utilisez des compresses stériles humidifiées pour envelopper les organes internes. Utilisez des rétracteurs supplémentaires si nécessaire afin d'exposer l'aorte.Palper la colonne lombaire, puis procéder à son exposition. Utiliser la cautérisation thermique pour exposer la face antérieure des corps vertébraux lombaires L4 à L5 et les isoler du tissu conjonctif et des muscles environnants. Utiliser un coton-tige pour retirer le sang et les tissus résiduels de la vertèbre L4.Ensuite, utilisez un foret stérile de deux centimètres de diamètre pour percer un défaut osseux profond de cinq millimètres au centre de la face antérieure exposée du corps vertébral. Appliquez une pression minimale afin de traverser uniquement la corticale ventrale et l'os trabéculaire sous-jacent. Évitez de percer la corticale dorsale.Ensuite, percer les cinq vertèbres L de la même manière afin de créer deux défauts par rat. Une fois le perçage terminé, remettre les intestins dans la cavité abdominale et retirer les rétracteurs. Puis utiliser un fil chirurgical synthétique résorbable vicryl en point continu pour suturer l'aponévrose.Fermer la peau à l’aide d’un point de suture simple non résorbable en nylon monofilament 4-0. Appliquer ensuite 100 microlitres d’adhésif topique pour peau par-dessus et entre les points de suture cutanés afin d’assurer une fermeture complète de la peau. Après avoir injecté au rat une solution de Ringer lactatée à 37 degrés Celsius pour prévenir l’hypothermie et la déshydratation, ainsi que de la buprénorphine pour le soulagement de la douleur postopératoire, laisser l’animal se réveiller de l’anesthésie sur un tapis chauffant.Le jour suivant l'intervention chirurgicale, induire l'anesthésie avec de l'isoflurane comme précédemment. Scanner le rat à l'aide d'un micro-scanneur CT in vivo. Après le balayage et le réveil de l'anesthésie, remettre le rat dans sa cage d'origine.Pour séparer les données des vertèbres aux fins d'analyse, cliquez sur le programme d'évaluation micro-TDM et sélectionnez l'échantillon dans le menu. Ensuite, utilisez la souris pour délimiter les vertèbres individuelles sur une coupe. Utilisez la barre Z pour passer à la coupe suivante et délimitez les vertèbres individuelles de la même manière.Enregistrez la vertèbre délimitée comme fichier séparé en cliquant sur Fichier, Enregistrer GOBJ toutes les quelques coupes. Ensuite, après avoir défini la vertèbre de référence, importez-la dans un environnement de micro-TDM. Appliquez le VOR défini pour la vertèbre de référence à la vertèbre cible enregistrée en cliquant sur le programme d'évaluation micro-TDM, Fichier, Charger GOBJ, puis en sélectionnant le fichier GOBJ précédemment créé.Enfin, envoyer le VOS à évaluer à l'aide d'un programme d'évaluation micro-CT. Cette image 3D frontale montre une image représentative d'un défaut vertébral un jour après la création du défaut. La formation osseuse dans l'espace vide est indiquée en rouge.Il s'agit d'une image 2D sagittale de la même zone, puis finalement d'une image 2D axiale. Comme on le voit ici, la formation osseuse se produit au fil du temps et est détectée par imagerie longitudinale. La densité du volume osseux et la densité apparente ont été calculées et comparées à l'aide d'une analyse de variance bidirectionnelle à mesures répétées avec correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples.Comme on le voit ici, la densité du volume osseux et la densité apparente augmentent significativement à partir de deux semaines après la création du défaut vertébral. Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'histologie et l'immunohistochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que les cellules présentes et les protéines exprimées dans le défaut. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de créer plusieurs défauts vertébraux chez des rats nus et d'analyser la régénération osseuse au fil du temps dans ces défauts.

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Un examen longitudinal de la perte osseuse dans les fémurs et les tibias des souris adultes a été réalisée suite à une blessure de la moelle épinière en utilisant séquentielle faible dose de rayons X scanne. La perte osseuse du tibia a été détecté pendant l'étude, tandis que la perte osseuse dans le fémur n'a pas été détecté jusqu'à 40 jours après la lésion.

Évaluation longitudinale des souris Limb perte osseuse Hind après un traumatisme médullaire utilisant Novel, In vivo Méthodologie

Cet article indique au utilisateurs de scanners de micro-la tomodensitométrie (µCT) in vivo comment anesthésier, correctement positionner et immobiliser le membre postérieur d’un rat pour mouvement minimal au cours de l’imagerie à haute résolution du tibia. Il en résulte des images de haute qualité qui peuvent être traitées afin de quantifier précisément la microarchitecture osseuse.

Le positionnement et la retenue d’une patte de Rat pour l’imagerie ciblée haute résolution des os à l’aide de la micro-architecture In Vivo Micro-computed Tomography

Nous présentons un workflow pour segmenter et quantifier l’OS trabéculaires des images 2D et 3D basés sur la limite extérieure de l’OS en utilisant un plugin ImageJ. Cette approche est plus efficace et plus précise que l’approche actuelle de main-contournement manuel et fournit des analyses quantitatives de couche par couche, qui ne sont pas disponibles dans les logiciels commerciaux actuels.

Limite extérieure assistée par Segmentation et Quantification de l’OS trabéculaire par un Imagej Plugin

La micro-tomodensitométrie (μCT) est un outil d’imagerie non destructif qui joue un rôle déterminant dans l’évaluation de la structure osseuse dans les études précliniques, mais il n’y a pas de consensus sur les procédures de μCT pour analyser le cal de cicatrisation osseuse. Cette étude fournit un protocole de μCT étape par étape qui permet de surveiller la cicatrisation des fractures.

Évaluation de la cicatrisation des fractures osseuses à l’aide de la microtomodensitométrie

Ce protocole présente une méthode économique et efficace pour l’évaluation quantitative de la microarchitecture osseuse dans un modèle murin d’ostéoporose en combinant la coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) et les techniques de micro-tomodensitométrie (Micro-CT).

Évaluation de la microarchitecture de l’os trabéculaire dans un modèle murin d’ostéoporose

Le protocole montre la construction d’un modèle d’entraînement simple et rentable pour l’ostéonécrose de la tête fémorale induite par les stéroïdes à l’aide d’un ruban thérapeutique élastique.

Modèle de mise en charge sans tension de l’ostéonécrose de la tête fémorale induite par les stéroïdes chez le rat

Ce protocole utilise la micro-tomodensitométrie pour permettre la quantification rentable de la masse maigre, y compris les muscles squelettiques et les tissus viscéraux, le tissu adipeux et le tissu squelettique chez les petits animaux. Il distingue le tissu maigre du tissu adipeux, ce qui offre des avantages significatifs pour la recherche biomédicale, notamment dans la recherche translationnelle chez les petits animaux.

Quantification non invasive des muscles squelettiques chez les petits animaux à l’aide de la micro-tomodensitométrie

Nous présentons une méthode d’analyse d’une région d’intérêt (ROI) définie par l’utilisateur dans un modèle longitudinal in vivo de défaut radial de rat. Cette méthode permet une analyse comparative entre différents échafaudages auparavant limités par les variations du champ de vision de la tomodensitométrie (μCT), de l’orientation de l’échantillon et de la présence de l’échafaudage de base.

Analyse d’images longitudinales par micro-tomodensitométrie pour la région d’intérêt définie par l’utilisateur dans les défauts osseux de taille critique

Nous proposons un protocole pour évaluer la régénération osseuse à différents niveaux hiérarchiques. Cette approche multimodale permet une analyse structurelle sur différentes échelles de longueur, répondant efficacement aux défis de la préparation de l’échantillon. Il offre également un flux de travail fiable pour évaluer l’efficacité des biomatériaux dans la promotion de la régénération osseuse.

Approche multimodale pour évaluer la régénération osseuse et la performance de l’échafaudage

Micropatterns adhésif qui normalisent l'architecture cellulaire peut être utilisé pour augmenter la sensibilité dans la détection des effets des médicaments, améliorer la reproductibilité et de simplifier l'acquisition automatique d'images et d'analyse. Une telle technologie bénéficieront tests de dépistage de drogue / siARN, réalisée sur conventionnelles soutient la culture cellulaire et par conséquent souffrent d'excès de cellule à cellule variabilité.

Amélioration de la visualisation et l&#39;analyse quantitative des effets des drogues utilisant des cellules Micropatterned

Découvrez une méthode semi-automatisée d'analyse structurale par microtomographie chez le rat nu pour étudier les fractures vertébrales liées à l'ostéoporose. Cette approche permet d'évaluer l'efficacité des traitements de régénération osseuse.

Semi-automatisées longitudinale axée sur les Microcomputed tomographie Quantitative analyse structurale d’un modèle de Rat nu Fracture vertébrale liée à l’ostéoporose (Vidéo) | JoVE Journal

Semi-automatisées longitudinale axée sur les Microcomputed tomographie Quantitative analyse structurale d’un modèle de Rat nu Fracture vertébrale liée à l’ostéoporose

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