Name: Une méthode d’analyse cellulaire pour le Condyle mandibulaire murin et morphométriques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Apprenez une méthode d'analyse cellulaire et morphométrique du condyle mandibulaire chez la souris. Cette technique utilise radiographie et histologie pour étudier les effets de la charge compressive sur le cartilage.

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Les auteurs tiennent à remercier m. David Rowe pour aimablement les souris transgéniques et Li Chen pour l’assistance histologique.
La recherche rapportée dans cette publication a été financée par le National Institute of Dental & Craniofacial Research de la National Institutes of Health, sous attribution numéro K08DE025914 et par l’Association américaine de Foundation orthodontique à Sumit Yadav.

<ol><li>LeResche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Temporomandibular+Disorders%3A+Implications+for+the+Investigation+of+Etiologic+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+functional+loading+causes+differential+effects+in+the+subchondral+bone+and+condylar+cartilage+in+the+temporomandibular+joint+from+young+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice.</a> Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).</li>
<li>Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+decreased+loading+on+the+metabolic+activity+of+the+mandibular+condylar+cartilage+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Orthod%22%5BJournal%5D)">Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat.</a> Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).</li>
<li>Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+temporomandibular+joint+changes+in+Twin+Block+and+Bionator+appliance+therapy%3A+a+magnetic+resonance+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Orthod%22%5BJournal%5D)">Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study.</a> Prog Orthod. 15 (57), (2014).</li>
<li>Dutra, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Matrix+Response+of+the+Mandibular+Condylar+Cartilage+to+Botulinum+Toxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin.</a> PLoS ONE. 11 (10), 0164599(2016).</li>
<li>Benjamin, M., Ralphs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+fibrocartilage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Biology of fibrocartilage cells.</a> Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).</li>
<li>Shen, G., Darendeliler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Adaptive+Remodeling+of+Condylar+Cartilage-+A+Transition+from+Chondrogenesis+to+Osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis.</a> J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Kaul, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Altered+Loading+on+Mandibular+Condylar+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage.</a> PLoS ONE. 11 (7), 0160121(2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+Multi-Image+Cryohistology+of+Mineralized+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues.</a> J Vis Exp. , e54468(2016).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
<li>Hayman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartrate-resistant+acid+phosphatase+%28TRAP%29+and+the+osteoclast%2Fimmune+cell+dichotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy.</a> Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Ce manuscrit décrit les méthodes de mesure morphométriques et analyse cellulaire des condyles mandibulaires murins et mandibules. Les mesures radiographiques morphométriques permet également d’analyser d’autres ossements de petits animaux de laboratoire. En outre, l’analyse cellulaire (quantification de la cellule et la cartographie de distance du cartilage) ne se limitent pas à du condyle mandibulaire rongeur, mais peut être utilisé pour quantifier les coupes histologiques de nombreux tissus.
<p class="jove_content"...

L’ATM est une articulation portante unique située dans la région cranio-faciale et est formé de fibrocartilage. Le CMC de l’ATM est essentiel pour la fonction articulaire, y compris le mouvement de mâchoire sans entrave tout en parlant et pétrissage, mais il est souvent affecté par des maladies dégénératives, notamment l’arthrose1. L’ATM a la capacité de s’adapter aux stimuli externes et des altérations de chargement, conduisant à des changements structurels et cellulaires aux composants du MCC2,3,4,5. Les propriétés porteuse du CMC peuvent s’expliquer par les interactions entre ses composants, y compris l’eau, le réseau de collagène et dense de protéoglycanes. Le MCC a quatre zones cellulaires distinctes qui expriment les différents types de protéines de collagène et non-collagène : 1) la zone superficielle ou articulaire ; 2) la zone proliférative, composée de cellules mésenchymateuses indifférenciées et qui répond au chargement des demandes ; 3) la zone de prehypertrophic, composé des chondrocytes matures exprimant le collagène de type 2 ; et 4) subissent une calcification et de zone, la région où les chondrocytes hypertrophiques exprimant collagène type die 10 le hypertrophique. La région non minéralisée est riche en protéoglycanes qui offrent une résistance aux forces de compression6.
Il y a la minéralisation continue à la zone hypertrophique de la MCC, où se produit la transition entre chondrogenèse ostéogenèse, garantissant la robuste structure minérale de l’os sous-chondral du condyle mandibulaire7. Changements cellulaires dans les régions non-minéralisée et minéralisées aboutir à des changements morphologiques et structurelles dans le condyle mandibulaire et de la mandibule. Maintien de l’homéostasie de toutes les régions cellulaires de la MCC et la minéralisation de la portion sous-chondral sont essentiels à la santé, capacité portante et l’intégrité de l’ATM.
Le modèle de souris transgénique de collagène multiples (comme décrit par Utreja et al.) 8 est un excellent outil à utiliser pour comprendre les changements dans l’expression de collagène car tous les transgènes sont exprimés dans le tableau. Pour une évaluation histologique approfondie, taches histologiques sont utilisés pour étudier les dépôts de matrice, minéralisation, prolifération cellulaire et l’apoptose, ainsi qu’expression de la protéine au niveau des couches cellulaires de la MCC.
Dans ce manuscrit, histologique et analyses morphométriques sont utilisés pour évaluer les changements structurels et cellulaires dans l’OS MCC et sous-chondrale du condyle mandibulaire de souris. En outre, une méthode de quantification de cellules, pour analyser des images histologiques fluorescents et de mappage des lames de microscope photonique, est décrite. L’ATM public static compression chargement méthode, ce qui provoque des modifications cellulaires et morphologiques à la MCC et sous-chondral OS9, est également illustrée pour valider nos méthodes.
Les méthodes décrites ici peuvent servir pour déterminer les caractéristiques morphométriques et histologiques dans le condyle mandibulaire et maxillaire inférieur des rongeurs ou d’analyser d’autres régions d’ossification endochondrale et la morphologie des tissus minéralisés supplémentaires.

<table><tbody><tr><td>Système de radiographie MX20</td><td>Faxitron X-Ray LLC&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Digimizer Image&nbsp ;</td><td>MedCalc Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryomatrix résine d’encastrement</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Microscope manuel Axio Imager Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>208562</td><td></td></tr><tr><td>filtre à protéines fluorescent jaune&nbsp ; - EYFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>filtre à protéines fluorescent cyan - ECFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>filtre à protéines fluorescent rouge - Cy5</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>acétate de sodium anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>L-tartrate de sodium dibasique dihydraté&nbsp ;</td><td>Nitrite de sodium Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>substrat ELF97</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E6600</td><td></td></tr><tr><td>ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit</td><td>Life Technologies</td><td>C10339&nbsp ;</td><td>comprend de l’EdU (5-éthynyl-2'-désoxyuridine)&nbsp ;</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate)</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Bleu Toluidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop&nbsp ;</td><td>Adobe Systems Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comprimés de solution saline tamponnés au phosphate (PBS)</td><td>Research Products International</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>CNA Beta III Archwire</td><td>Ortho Organizers, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisme&nbsp ;</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode d’analyse cellulaire pour le condyle mandibulaire murin et morphométriques

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

L’articulation temporo-mandibulaire (ATM) a la capacité de s’adapter aux stimuli externes et chargement des changements peut affecter la position des condyles, ainsi que les composants structurels et cellulaires du cartilage condylien mandibulaire (MCC). Ce manuscrit décrit des méthodes pour l’analyse de ces changements et un procédé pour modifier le chargement de l’ATM chez la souris (c.-à-d., compression ATM statique de chargement). L’évaluation structurale illustrée ici est une approche morphométrique simple qui utilise le logiciel Digimizer et est réalisée dans les radiographies de petits os. En outre, l’analyse de systèmes cellulaires change conduisant à des altérations dans l’expression du collagène, remodelage osseux, la division cellulaire, et distribution de protéoglycanes dans le MCC est décrite. La quantification de ces changements dans les coupes histologiques - en comptant les pixels fluorescents positives à l’aide d’image logiciel et la cartographie de la distance de mesure et colorées de zone avec Digimizer - est également démontrée. Les méthodes indiquées ici ne se limitent pas à l’ATM murine, mais pourraient être utilisés sur les autres OS de petits animaux de laboratoire et dans d’autres régions de l’ossification endochondrale.

Statistiques descriptives ont été effectuées pour examiner la distribution des mesures morphométriques (longueur mandibulaire, longueur condylienne, largeur condylienne) et des analyses histologiques. Résultats ont été comparés entre le groupe chargé (c.-à-d., souris soumises à une charge de compression avec le ressort en titane bêta) et le groupe témoin (c.-à-d., correspondant à des souris témoins n’ayant pas reçu de toute procédure). Des différences statistiquement sig...

Ce manuscrit présente des méthodes d’analyse morphométrique et changements cellulaires dans le condyle mandibulaire des rongeurs.

Une méthode d’analyse cellulaire pour le Condyle mandibulaire murin et morphométriques

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

Le but général de cette expérience est d'observer les effets d'une charge compressive sur le cartilage condylien mandibulaire de souris, à l'aide de mesures morphométriques sur des radiographies et d'une analyse histologique. Ces paramètres peuvent aider à répondre à des questions clés concernant les modifications structurelles et cellulaires au sein du condyle mandibulaire chez les rongeurs. Le principal avantage de la technique présentée ici est qu'elle peut être utilisée pour analyser d'autres petits animaux nés ou impliqués.Pour ce protocole, préparez des mandibules de souris isolées et disséquées prêtes à être utilisées. Dans une boîte de Pétri, transférez les mandibules dans un système d'armoire à rayons X. Ensuite, effectuez des radiographies à 26 kilovolts pendant cinq secondes.Ouvrez maintenant les images dans le logiciel d'analyse pour effectuer des mesures morphométriques. Commencez par utiliser le bouton d'unité pour configurer la barre d'échelle. Ensuite, sélectionnez six points anatomiques à l'aide du style de marqueur 2.Tout d'abord, sélectionnez les points les plus postérieurs du condyle mandibulaire comme point un. Ensuite, sélectionnez l'apophyse incisive pour le point deux. Puis, sélectionnez le point le plus profond de l'incisure sigmoïde pour le point trois.Ensuite, sélectionnez le point le plus profond de la concavité du rame mandibulaire, le point quatre, puis sélectionnez le point le plus antérieur de la surface articulaire condylienne, le point cinq. Maintenant, sélectionnez le point le plus postérieur de la surface articulaire condylienne comme point six, puis procédez aux mesures de longueur à l’aide de l’outil de longueur. Utilisez ensuite l’outil de ligne perpendiculaire reliant les points trois et quatre pour mesurer la longueur de la tête du condyle, correspondant à la longueur de la perpendiculaire abaissée du point un vers la droite reliant les points trois et quatre.Ensuite, mesurez la longueur mandibulaire entre les points un et deux. Enfin, mesurez la largeur de la tête du condyle, située entre les points cinq et six. Pour enregistrer les données, copiez la liste des mesures située sur le côté droit de l'écran.Avant l'inclusion des mandibules fixées mais non décalcifiées, les faire tremper toute une nuit dans du saccharose à 30 pour cent dans du PBS. Le lendemain, disséquer tout tissu mou excédentaire et sectionner soigneusement le condyle mandibulaire. Placer ensuite les échantillons dans des moules en plastique, avec la surface médiale du condyle contre la base du moule et l'échantillon parallèle au fond du moule.Ensuite, les immerger dans de la résine d'inclusion et refroidir la résine à l'aide d'un morceau de glace sèche. Puis, compléter le remplissage des moules avec davantage de résine d'inclusion. Transférer les moules dans du deux méthyl butane froid, refroidi par un congélateur ou par de la glice sèche.Une fois refroidi, conserver les échantillons à moins 20 degrés Celsius ou à moins 80 degrés Celsius pour la sectionnement. Pour quantifier l'expression de Col10a1 dans la MCC de sections sagittales des condyles, ouvrir les images histologiques dans un logiciel d'analyse d'image et sélectionner la zone d'intérêt à l'aide de l'outil lasso. Dans ce cas, la région de la MCC est sélectionnée.Prenez note du nombre de pixels dans la zone, qui est indiqué dans la boîte d'histogramme. Ensuite, sélectionnez les pixels rouges de Col10a1 en ajustant la plage de couleurs. Utilisez l'outil pipette pour sélectionner un pixel rouge sur l'image, puis cliquez sur OK. Ensuite, enregistrez le nombre de pixels rouges dans la zone, tel qu'indiqué dans la boîte d'histogramme.La fraction de pixels rouges dans la zone représente la quantité d'expression de Col10a1. Maintenant, en utilisant la même technique de base, quantifiez l'activité TRAP dans le MCC et l'os sous-chondral. Tout d'abord, sélectionnez le cartilage dans les régions de l'os sous-chondral comme zones à analyser et notez le nombre total de pixels.Ensuite, sélectionnez les pixels jaunes générés par le substrat ELF97. Notez le nombre de pixels positifs et calculez la fraction des pixels positifs au TRAP. Quantifiez maintenant les cellules positives à l'EDU qui sont contre-colorées en bleu par le DEPI.De nouveau, sélectionnez la zone d’intérêt, puis quantifiez les pixels bleus à l’intérieur. Utilisez également cette méthode pour déterminer le nombre de pixels positifs à l’EDU dans la même région. Des mesures morphométriques réalisées sur des souris soumises à une charge compressive de l’articulation temporo-mandibulaire ont montré que cette charge augmentait significativement la longueur de la mandibule et de la tête du condyle.Néanmoins, la sollicitation n'a pas entraîné de changement significatif de la largeur du condyle. La quantification de la distribution du collagène a révélé une augmentation significative de l'expression de Col10a1 et de la MCC des condyles des animaux soumis à la charge. En revanche, l'expression de Col2a1 ne différait pas beaucoup de celle du témoin.L'activité TRAP a augmenté dans la région sous-chondrale des condyles et des souris soumises à une charge, tout comme la prolifération sous-chondrale. La coloration EDU indique le nombre de cellules prolifératives. La distribution des protéoglycanes dans le MCC a été quantifiée en évaluant la zone colorée au bleu de toluidine et la carte de distance.Il y a eu une augmentation significative de la cartographie des distances dans le CCC des condyles du groupe chargé. Toutefois, la zone colorée au protéoglycane ne présentait aucune différence statistiquement significative entre les groupes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser les changements cellulaires et structuraux dans le condyle mandibulaire des rongeurs.

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