Une méthode d’analyse cellulaire pour le Condyle mandibulaire murin et morphométriques

Le but général de cette expérience est d'observer les effets d'une charge compressive sur le cartilage condylien mandibulaire de souris, à l'aide de mesures morphométriques sur des radiographies et d'une analyse histologique. Ces paramètres peuvent aider à répondre à des questions clés concernant les modifications structurelles et cellulaires au sein du condyle mandibulaire chez les rongeurs. Le principal avantage de la technique présentée ici est qu'elle peut être utilisée pour analyser d'autres petits animaux nés ou impliqués.

Pour ce protocole, préparez des mandibules de souris isolées et disséquées prêtes à être utilisées. Dans une boîte de Pétri, transférez les mandibules dans un système d'armoire à rayons X. Ensuite, effectuez des radiographies à 26 kilovolts pendant cinq secondes.

Ouvrez maintenant les images dans le logiciel d'analyse pour effectuer des mesures morphométriques. Commencez par utiliser le bouton d'unité pour configurer la barre d'échelle. Ensuite, sélectionnez six points anatomiques à l'aide du style de marqueur 2.

Tout d'abord, sélectionnez les points les plus postérieurs du condyle mandibulaire comme point un. Ensuite, sélectionnez l'apophyse incisive pour le point deux. Puis, sélectionnez le point le plus profond de l'incisure sigmoïde pour le point trois.

Ensuite, sélectionnez le point le plus profond de la concavité du rame mandibulaire, le point quatre, puis sélectionnez le point le plus antérieur de la surface articulaire condylienne, le point cinq. Maintenant, sélectionnez le point le plus postérieur de la surface articulaire condylienne comme point six, puis procédez aux mesures de longueur à l’aide de l’outil de longueur. Utilisez ensuite l’outil de ligne perpendiculaire reliant les points trois et quatre pour mesurer la longueur de la tête du condyle, correspondant à la longueur de la perpendiculaire abaissée du point un vers la droite reliant les points trois et quatre.

Ensuite, mesurez la longueur mandibulaire entre les points un et deux. Enfin, mesurez la largeur de la tête du condyle, située entre les points cinq et six. Pour enregistrer les données, copiez la liste des mesures située sur le côté droit de l'écran.

Avant l'inclusion des mandibules fixées mais non décalcifiées, les faire tremper toute une nuit dans du saccharose à 30 pour cent dans du PBS. Le lendemain, disséquer tout tissu mou excédentaire et sectionner soigneusement le condyle mandibulaire. Placer ensuite les échantillons dans des moules en plastique, avec la surface médiale du condyle contre la base du moule et l'échantillon parallèle au fond du moule.

Ensuite, les immerger dans de la résine d'inclusion et refroidir la résine à l'aide d'un morceau de glace sèche. Puis, compléter le remplissage des moules avec davantage de résine d'inclusion. Transférer les moules dans du deux méthyl butane froid, refroidi par un congélateur ou par de la glice sèche.

Une fois refroidi, conserver les échantillons à moins 20 degrés Celsius ou à moins 80 degrés Celsius pour la sectionnement. Pour quantifier l'expression de Col10a1 dans la MCC de sections sagittales des condyles, ouvrir les images histologiques dans un logiciel d'analyse d'image et sélectionner la zone d'intérêt à l'aide de l'outil lasso. Dans ce cas, la région de la MCC est sélectionnée.

Prenez note du nombre de pixels dans la zone, qui est indiqué dans la boîte d'histogramme. Ensuite, sélectionnez les pixels rouges de Col10a1 en ajustant la plage de couleurs. Utilisez l'outil pipette pour sélectionner un pixel rouge sur l'image, puis cliquez sur OK. Ensuite, enregistrez le nombre de pixels rouges dans la zone, tel qu'indiqué dans la boîte d'histogramme.

La fraction de pixels rouges dans la zone représente la quantité d'expression de Col10a1. Maintenant, en utilisant la même technique de base, quantifiez l'activité TRAP dans le MCC et l'os sous-chondral. Tout d'abord, sélectionnez le cartilage dans les régions de l'os sous-chondral comme zones à analyser et notez le nombre total de pixels.

Ensuite, sélectionnez les pixels jaunes générés par le substrat ELF97. Notez le nombre de pixels positifs et calculez la fraction des pixels positifs au TRAP. Quantifiez maintenant les cellules positives à l'EDU qui sont contre-colorées en bleu par le DEPI.

De nouveau, sélectionnez la zone d’intérêt, puis quantifiez les pixels bleus à l’intérieur. Utilisez également cette méthode pour déterminer le nombre de pixels positifs à l’EDU dans la même région. Des mesures morphométriques réalisées sur des souris soumises à une charge compressive de l’articulation temporo-mandibulaire ont montré que cette charge augmentait significativement la longueur de la mandibule et de la tête du condyle.

Néanmoins, la sollicitation n'a pas entraîné de changement significatif de la largeur du condyle. La quantification de la distribution du collagène a révélé une augmentation significative de l'expression de Col10a1 et de la MCC des condyles des animaux soumis à la charge. En revanche, l'expression de Col2a1 ne différait pas beaucoup de celle du témoin.

L'activité TRAP a augmenté dans la région sous-chondrale des condyles et des souris soumises à une charge, tout comme la prolifération sous-chondrale. La coloration EDU indique le nombre de cellules prolifératives. La distribution des protéoglycanes dans le MCC a été quantifiée en évaluant la zone colorée au bleu de toluidine et la carte de distance.

Il y a eu une augmentation significative de la cartographie des distances dans le CCC des condyles du groupe chargé. Toutefois, la zone colorée au protéoglycane ne présentait aucune différence statistiquement significative entre les groupes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser les changements cellulaires et structuraux dans le condyle mandibulaire des rongeurs.