Évaluation de la fonction microvasculaire tissu adipeux humain en utilisant la vidéomicroscopie

L’objectif général de cette technique de vidéomicroscopie est d’examiner les propriétés fonctionnelles de microvaisseaux isolés en réponse à des stimuli pharmacologiques et physiologiques, en donnant un aperçu de la physiopathologie et des mécanismes moléculaires qui contribuent au dysfonctionnement vasculaire chez l’homme. Cette méthode est utile pour comprendre les mécanismes moléculaires qui contribuent au dysfonctionnement de la microvascularisation locale dans la graisse, qui a été liée à des maladies systémiques. Les principaux avantages de cette technique sont que les vaisseaux sanguins restent fonctionnels après avoir été retirés du corps humain pendant un certain temps et sont facilement examinés pour leurs propriétés physiologiques.

La pertinence clinique de cette approche expérimentale est qu’elle nous permet d’identifier des voies qui sont modifiées de manière différentielle dans des conditions pathologiques et de découvrir potentiellement de nouvelles cibles thérapeutiques. Sous un microscope à dissection tissulaire, utilisez des microciseaux et des micropinces pour retirer soigneusement la graisse environnante et le tissu conjonctif des petites artères de l’échantillon adipeux. Il est essentiel de distinguer les artères des veinules.

Les artères ont généralement un diamètre plus petit, présentent un tonus plus grand et répondent plus vigoureusement que les veinules. Lorsque l’artère a été isolée, utilisez des sutures en nylon ou en soie pour attacher les branches. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres pour remplir lentement le tube avec la solution fraîche de Krebs.

Ensuite, fixez des tubes en caoutchouc aux réservoirs sous pression et aux pipettes capillaires en verre à l’intérieur de la chambre. Ensuite, déplacez l’artère disséquée vers la chambre de l’organe et canulez le récipient sur les pipettes capillaires en verre. Fixez soigneusement les deux extrémités de l’artère sur les pipettes à l’aide de sutures en nylon.

Une fois le récipient sécurisé, retirez lentement le tampon Krebs de la chambre et ajoutez deux millilitres de solution fraîche de Krebs dans la chambre. Ensuite, fixez la chambre de l’organe à la platine d’un microscope inversé équipé d’une caméra vidéo. Allumez le logiciel de détection des bords à une fréquence d’échantillonnage d’un kilohertz.

Raccordez le tube sous pression restant au deuxième réservoir de pression rempli de solution Krebs, puis connectez les réservoirs de pression au transducteur de pression. Lorsque tous les tubes ont été connectés, réglez le bloc chauffant à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez l’unité de contrôle de la pression pour augmenter progressivement la pression intraluminale à cinq millilitres de mercure toutes les cinq minutes afin d’obtenir la pression expérimentale appropriée dans la lumière du vaisseau sanguin isolé.

Laissez le vaisseau s’équilibrer pendant 20 à 30 minutes une fois que la pression atteint 60 millilitres de mercure et enregistrez le diamètre de l’artère adipeuse au repos. À la fin de la période d’équilibre, pré-resserrez le vaisseau sanguin à environ 55 % du diamètre de base au repos en ajoutant un microlitre d’endothéline 1 directement dans le bain toutes les cinq minutes jusqu’à ce que le diamètre du vaisseau ait été correctement resserré. Pour la vasodilatation endothéliale dépendante induite par l’écoulement, induire un écoulement continu dans l’espace intraluminal de l’artère dans des directions égales et opposées afin qu’une différence de pression puisse être développée à travers le récipient sans modifier la pression intraluminale moyenne de 60 millimètres de mercure.

Après trois à cinq minutes, mesurez la dilatation médiée par le flux. Augmentez chaque incrément de gradient de pression d’un changement de 10 centimètres d’eau toutes les cinq à six minutes jusqu’à un maximum de 100 centimètres d’eau. Après avoir évalué la dilatation du récipient médiée par l’écoulement, remettez les réservoirs de pression à la même hauteur pour arrêter l’induction de l’écoulement.

Ensuite, immédiatement, mais soigneusement, remplacez la solution de chambre par une solution fraîche de Krebs sans perturber l’artère en suspension et laissez le vaisseau commencer à revenir au diamètre de base pendant 20 à 30 minutes. Une fois que l’artère est revenue au diamètre de base au repos, une subtile vasodilatation dépendante de l’endothélium médiée par la choline peut être évaluée. Cela commence par la pré-constriction du vaisseau à environ 55 % de son diamètre de repos avec l’endothéline 1, comme démontré précédemment.

Une fois la pré-constriction atteinte, ajoutez deux microlitres de doses croissantes d’acétylcholine directement dans le bain. Consigner la modification du diamètre artériel cinq minutes après l’administration de chaque dose. À la fin de l’étude dose-réponse à l’acétylcholine, évaluer la vasodilatation indépendante de l’endothélium et la viabilité des vaisseaux par l’administration séquentielle de papavérine et de vasodilatateur indépendant de l’endothélium directement dans le bain.

Les réponses de vasodilatation dépendantes de l’endothélium à l’augmentation du débit et au stress pur ou à l’acétylcholine sont significativement émoussées dans les artères adipeuses viscérales par rapport aux artères adipeuses sous-cutanées dans l’obésité humaine. La vasodilatation indépendante de l’endothélium en réponse à la papavérine n’est cependant pas modifiée de manière différentielle entre les deux diposes, ce qui suggère que le dysfonctionnement vasculaire dans les domaines viscéraux est en grande partie le résultat d’un dysfonctionnement au niveau de l’endothélium, au moins dans les premiers stades de la maladie. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en trois à cinq heures, si elle est exécutée correctement.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de prendre votre temps et d’être diligent, car même des dommages mineurs aux vaisseaux sanguins peuvent fausser les résultats. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la transfection de siRNA des vaisseaux sanguins peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’impact de gènes spécifiques sur la fonction vasomotrice dans les maladies humaines. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du tissu adipeux et de la microcirculation pour explorer l’impact du microenvironnement du tissu adipeux sur la santé vasculaire locale dans l’obésité humaine.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sonder directement la physiopathologie de segments entiers intacts de vaisseaux sanguins humains, qui sont retirés de sujets vivants, un processus qui ne peut pas être reproduit par l’imagerie non invasive.