Évaluation de la fonction microvasculaire tissu adipeux humain en utilisant la vidéomicroscopie

L'objectif général de cette technique de vidéomicroscopie est d'examiner les propriétés fonctionnelles de microvaisseaux isolés en réponse à des stimuli pharmacologiques et physiologiques, offrant ainsi un aperçu des mécanismes physiopathologiques et moléculaires contribuant au dysfonctionnement vasculaire chez l'humain. Cette méthode est utile pour comprendre les mécanismes moléculaires qui contribuent au dysfonctionnement de la microvasculature locale au sein du tissu adipeux, un phénomène associé à des maladies systémiques. Les principaux avantages de cette technique sont que les vaisseaux sanguins restent fonctionnels pendant une certaine période après leur prélèvement sur le corps humain et qu'il est facile d'en étudier les propriétés physiologiques.

La pertinence clinique de cette approche expérimentale réside dans sa capacité à identifier les voies modifiées de manière différentielle dans les conditions pathologiques et à permettre éventuellement la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Sous un microscope de dissection tissulaire, utilisez des microciseaux et des microforceps pour retirer soigneusement la graisse et le tissu conjonctif environnants des petites artérioles présentes dans l'échantillon adipeux. Il est essentiel de distinguer les artérioles des veinules.

Les artérioles ont généralement un diamètre plus petit, présentent un tonus plus marqué et répondent de manière plus robuste que les veinules. Une fois l'artériole isolée, utilisez des sutures en nylon ou en soie pour ligaturer toutes les branches. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres pour remplir lentement le tube avec une solution fraîche de Krebs.

Ensuite, fixez des tubes en caoutchouc aux réservoirs de pression et aux pipettes capillaires en verre situés dans la chambre. Puis, transférez l'artère disséquée dans la chambre d'organe et canulez le vaisseau sur les pipettes capillaires en verre. Fixez soigneusement les deux extrémités de l'artère aux pipettes à l'aide de fils de suture en nylon.

Une fois le récipient fixé, retirez lentement le tampon de Krebs de la chambre et ajoutez deux millilitres de solution fraîche de Krebs dans la chambre. Ensuite, fixez la chambre d'organe sur la platine d'un microscope inversé équipé d'une caméra vidéo. Activez le logiciel de détection de bord à une fréquence d'échantillonnage de un kilohertz.

Connecter le tube sous pression restant au deuxième réservoir de pression rempli de solution de Krebs, puis relier les réservoirs de pression au transducteur de pression. Une fois tous les tubes connectés, régler le bloc chauffant à 37 degrés Celsius. Ensuite, utiliser l'unité de contrôle de pression pour augmenter progressivement la pression intraluminale de cinq millimètres de mercure toutes les cinq minutes afin d'atteindre la pression expérimentale appropriée à l'intérieur de la lumière du vaisseau sanguin isolé.

Laisser le vaisseau s'équilibrer pendant 20 à 30 minutes une fois que la pression atteint 60 millimètres de mercure et noter le diamètre de l'artère adipeuse au repos. À la fin de la période d'équilibration, pré-contraindre le vaisseau sanguin à environ 55 % du diamètre de base au repos en ajoutant un microlitre d'endothéline 1 directement dans le bain toutes les cinq minutes jusqu'à ce que le diamètre du vaisseau soit convenablement rétréci. Pour la vasodilatation dépendante de l'endothélium induite par le débit, induire un flux continu dans l'espace intraluminal de l'artère dans des directions égales et opposées afin qu'une différence de pression puisse se développer à travers le vaisseau sans modifier la pression intraluminale moyenne de 60 millimètres de mercure.

Après trois à cinq minutes, mesurez la dilatation endothéliale induite par le flux. Augmentez chaque palier de gradient de pression de 10 centimètres de colonne d'eau toutes les cinq à six minutes, jusqu'à un maximum de 100 centimètres de colonne d'eau. Après avoir évalué la dilatation vasculaire induite par le flux, ramenez les réservoirs de pression à la même hauteur afin d'arrêter l'induction du flux.

Ensuite, remplacez immédiatement, mais soigneusement, la solution de la chambre par une solution de Krebs fraîche sans perturber l'artère suspendue et laissez le vaisseau commencer à retrouver son diamètre de base pendant 20 à 30 minutes. Une fois que l'artère est revenue à son diamètre de repos de base, une vasodilatation endothéliale dépendante de la choline, subtile, peut être évaluée. Cela commence par une pré-contraction du vaisseau à environ 55 % de son diamètre de repos à l'aide d'endothéline 1, comme démontré précédemment.

Une fois la pré-contraction obtenue, ajoutez deux microlitres de doses croissantes d'acétylcholine directement dans le bain. Enregistrez la variation du diamètre artériel cinq minutes après l'administration de chaque dose. À l'issue de la réponse dose-effet à l'acétylcholine, évaluez la vasodilatation indépendante de l'endothélium et la viabilité du vaisseau par l'administration séquentielle de papavérine, un vasodilatateur indépendant de l'endothélium, directement dans le bain.

Les réponses de vasodilatation dépendante de l'endothélium aux augmentations du débit et du stress de cisaillement, ou à l'acétylcholine, sont nettement atténuées dans les artérioles adipeuses viscérales par rapport aux artérioles sous-cutanées chez les personnes obèses. En revanche, la vasodilatation indépendante de l'endothélium en réponse à la papavérine n'est pas modifiée différemment entre les deux types de tissu adipeux, ce qui suggère que la dysfonction vasculaire dans les régions viscérales résulte principalement d'un dysfonctionnement au niveau de l'endothélium, du moins aux premiers stades de la maladie. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à cinq heures, si elle est correctement exécutée.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre son temps et d'agir avec rigueur, car même de légers dommages aux vaisseaux sanguins peuvent fausser les résultats. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la transfection par ARNsi des vaisseaux sanguins, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur l'impact de gènes spécifiques sur la fonction vasomotrice dans les maladies humaines. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du tissu adipeux et de la microcirculation pour explorer l'impact du microenvironnement du tissu adipeux sur la santé vasculaire locale dans l'obésité humaine.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment sonder directement la physiopathologie de segments entiers et intacts de vaisseaux sanguins humains, prélevés sur des sujets vivants, un processus qui ne peut être reproduit par l'imagerie non invasive.