Name: Étude de la diaphonie entre les cellules endothéliales adipeuses adipeuses et les adipocytes dans le tissu adipeux sous-cutané humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Découvrez l'isolation et la culture de cellules endothéliales microvasculaires du tissu adipeux sous-cutané humain pour étudier leur diaphonie avec les adipocytes. Cette méthode permet d'explorer les mécanismes des maladies cardiométaboliques.

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<meta charset="utf8"></head><body>SATMVECs humains : études d’isolement et de diaphonie adipocytaire

<ol><li>Bierhansl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+metabolism+in+endothelial+cell+function+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Central role of metabolism in endothelial cell function and vascular disease.</a> Physiology. 32 (2), 126-140 (2017).</li>
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<li>Luk, C., Haywood, N. J., Bridge, K. I., Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+role+of+the+endothelium+in+metabolic+homeostasis+in+health+and+nutrient+excess%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Paracrine role of the endothelium in metabolic homeostasis in health and nutrient excess.</a> Front Cardiovasc Med. 26 (9), 882923(2022).</li>
<li>Click-iT EdU Imaging Kits. , Available from: 
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</ol>

<table><tbody><tr><td>170L CO2</td><td>Incubateur GS Biotech</td><td>170G-014</td><td></td></tr><tr><td>2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose)</td><td>Invitrogen</td><td>N13195</td><td></td></tr><tr><td>4 % PARAFIX fixateur histologique tamponné</td><td>VWR Chemicals</td><td>PRC/R/38/1</td><td></td></tr><tr><td>Akt (tAkt) Rabbit&nbsp ; 1:1000</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>9272</td><td></td></tr><tr><td>BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, Orange, 50/pqt</td><td>Medisave</td><td>393230</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’albumine sérique bovine, 7,5 %</td><td>Merck</td><td>A8412-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CD144&nbsp ;( VE-Cadhérine) Anticorps anti-humain, PE, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-495</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Anticorps anti-humain, PerCP-Vio 700, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-811</td><td></td></tr><tr><td>CD31 MicroBead Kit, humain, 1 kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Anticorps anti-humain, FITC, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-769</td><td></td></tr><tr><td>Extraction cellulaire Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>FNN0011</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5805000060</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Kit de prolifération cellulaire pour l’imagerie, Alexa Fluor 488 colorant</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>Kit d’imagerie de prolifération cellulaire</td></tr><tr><td>Collagénase/Dispase, 500 mg</td><td>Roche/Merck</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit (GFR)</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>354230</td><td>Membrane basale</td></tr><tr><td>Matrix Corning 100 mm TC Boîte de culture</td><td>Corning&nbsp ;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Costar Plaques à 24 puits transparentes traitées TC, emballées individuellement,</td><td>Corning stériles&nbsp ;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Costar Plaques à 6 puits transparentes traitées TC, emballées individuellement,</td><td>Corning stériles&nbsp ;</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX S &ndash ; 4 Cytomètre à flux laser</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit d’élimination des cellules mortes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime ; s Saline tamponnée au phosphate</td><td>Merck</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>EASYstrainer Tamis cellulaire pour tubes de 50 mL, 70 & micro ; m mesh, Bleu, stérile, 50/pqt</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Endothélial Cell Growth Medium MV</td><td>PromoCell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock microtubes à essai</td><td>Merck</td><td>EP0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Merck</td><td>E8008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 Well TC-Treated Cell Polystyrène Perméable Companion Plate, avec couvercle, Stérile, 1/paquet, 50/caisse</td><td>Appleton Woods</td><td>CF537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Support perméable pour plaque à 24 puits avec 0,4 & micro ; m Membrane PET transparente, stérile, 1/paquet, 48/caisse</td><td>Appleton Woods</td><td>CF521</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de congélation Cryo-SFM</td><td>PromoCell</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>Solution de gélatine, 2 % dans l’eau</td><td>Merck</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotique-antimycosique (100x), 100mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11570486</td><td></td></tr><tr><td>Gibco TrypLE Select Enzyme (1x), sans rouge de phénol</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>12563029</tr><tr><td>Hanks&prime ; Solution saline équilibrée</td><td>Merck</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cellules préadipocytaires sous-cutanées humaines</td><td>Lonza</td><td>PT-5020</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td>Système d’analyse de cellules vivantes</td></tr><tr><td>Solution d’insuline humaine</td><td>Merck</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>LS Colonnes, 25/pqt</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS Solution de stockage de tissus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de tube MACSmix</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>Rotateur</td></tr><tr><td>de tube MS Colonnes, 25/pqt</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4&ndash ; 12 % Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Séparateur</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>PGM-2 Croissance des préadipocytes Medium-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-8002</td><td></td></tr><tr><td>Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9570</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Akt (Ser473) Rabbit&nbsp ; 1:1000</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>4060</td><td></td></tr><tr><td>Filtres de pré-séparation 30 & micro ; m, 50/pqt</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Solution de coloration à l’iodure de propidium (PI)/RNase</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>4087</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel jetable stérile 10</td><td>VWRI</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>Tube à bouchon à vis, 15 ml, (Lx&Oslash ;) : 120 x 17 mm, PP, avec impression</td><td>Sarstetd</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon à vis, 50 ml, (Lx&Oslash ;) : 114 x 28 mm, PP, avec impression</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Tube à vis, 50 ml, (Lx&Oslash ;) : 114 x 28 mm, PP, avec impression</td><td>Sarstetd</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Total eNOS Souris 1:1000</td><td>BD Biosciences</td><td>610297</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, BioUltra, pour la biologie moléculaire</td><td>Merck</td><td>93443-500ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Actine (C4) Souris 1:5000</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>&nbsp ; Réf. Sc-47778</td><td></td></tr></tbody></table>

Étude de la diaphonie entre les cellules endothéliales adipeuses adipeuses et les adipocytes dans le tissu adipeux sous-cutané humain

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Pureté et phénotype hSATMVEC Les hSATMVEC isolés chez les patients témoins (c’est-à-dire les personnes sans antécédents de maladie cardiométabolique) étaient à 99,5 % CD31 + CD144 + CD45- sur la cytométrie en flux (Figure 2). Les hSATMVEC isolés avaient une morphologie semblable à celle d’un pavé typique des CE (Figure 3A). Les hSATMVECs ont eu un temps moyen de doublement de la population de 56,6 h ± 8,1 h (moyenne ± SEM, n = 10) (Figure 3B), et la réplication active de l’ADN dans les hSATMVECs a été confirmée à l’aide d’un kit d’imagerie de prolifération cellulaire (Figure 3C).
hSATMVEC s’est comporté comme des MVEC fonctionnels et a formé des tubes dans Matrigel (Figure 3D). L’expression relative des protéines clés impliquées dans la voie de signalisation de l’insuline Akt-eNOS est illustrée à la figure 3E. Les eNO et Akt ont tous deux montré une augmentation de la phosphorylation induite par l’insuline, représentée par le rapport entre les protéines phosphorylées et les protéines totales normalisées en ß-actine (figure 3E).
Co-culture hSATMVEC-adipocytes Un modèle illustratif de la co-culture hSATMVEC-adipocytes peut être vu dans la figure 4A. Au fur et à mesure que les préadipocytes blancs sous-cutanés humains se différencient, on remarquera le développement de vacuoles lipidiques (Figure 4B), qui peuvent être quantifiées par coloration au Rouge O Huile (Figure 4B).
La figure 4C montre l’imagerie illustrative par contraste de phase et fluorescence (excitation 440-480 nm/émission 504-544 nm) d’adipocytes différenciés après 30 min d’incubation avec 20 μM de glucose 2-NBD. L’absorption de glucose peut être quantifiée en mesurant la surface verte en pourcentage de la surface totale des cellules.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig01v2.jpg"> Figure 1 : Schéma illustrant la récolte et le traitement des hSATMVECs <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig02.jpg"> Figure 2 : Résultat typique de l’analyse par cytométrie en flux des hSATMVECs en culture. (A) Nuage de points de la zone de diffusion latérale (SSC-A) et de la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) montrant le déclenchement (boîte rouge) des hSATMVECs en culture autour d’une densité de population cellulaire spécifique. (B) Nuage de points de la largeur de diffusion vers l’avant (FSC-Width) et FSC-A montrant le déclenchement (boîte rouge) des hSATMVECs cultivés autour d’une densité de population cellulaire spécifique. (C) Histogramme montrant la fluorescence des cellules fermées à CD45-FITC. (D) Nuage de points de l’intensité de fluorescence de CD144-PE (axe x) et CD31-PerCP (axe y). (E) Histogramme montrant la fluorescence des cellules fermées à CD144-PE. (F) Histogramme montrant la fluorescence des cellules fermées à CD31-PerCP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig03.jpg"> Figure 3 : phénotype de hSATMVEC. (A) Image de microscopie optique de hSATMVEC près de la confluence montrant un aspect de pavé. (B) Temps de doublement de hSATMVEC - Microscopie optique d’HATEC prise à 24 h d’intervalle, démontrant l’étendue de la prolifération cellulaire. (C) Prolifération de hSATMVEC. Microscopie à fluorescence de hSATMVEC avec iodure de propidium et EdU/Alexa-fluor 488 chez des sujets témoins. (D) Formation du tube hSATMVEC à partir de sujets témoins (images prises à un grossissement de 4x). (E) Stimulation de l’insuline des HATEC - montrant l’expression relative de l’Akt phosphorylé (sérine 473) à l’Akt total (panneau de gauche) de l’eNOS phosphorylé (sérine 1177) à l’eNOS total (panneau de droite) à des concentrations croissantes d’insuline avec des transferts Western illustratifs inférieurs à l’actine B. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB. La taille des échantillons se trouve sous chaque panneau. Abréviations : 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), cellules endothéliales microvasculaires du tissu adipeux sous-cutané humain (hSATMVEC), erreur type de la moyenne (MEB). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig04.jpg"> Figure 4 : Co-culture hSATMVEC-adipocytes. (A) Image schématique de la co-culture hSATMVEC-adipocytes. (B) Différenciation des adipocytes. Le panneau de gauche montre les préadipocytes au jour 0 et le panneau de droite montre les adipocytes différenciés au jour 10 après l’ajout de PDM. La figure du bas montre la quantité de lipides stockée dans les adipocytes et les préadipocytes colorés au rouge d’huile. Le panneau de gauche montre l’imagerie de phase des adipocytes après co-culture et incubation avec 20 μM de glucose 2-NBD pendant 30 min. Le panneau de droite montre une imagerie verte à partir de laquelle l’absorption de glucose (en % vert de la surface totale) peut être quantifiée. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Abréviations : Jour 10 (J10), tissu adipeux sous-cutané humain, cellules endothéliales microvasculaires (hSATMVEC), milieu de différenciation des préadipocytes (PDM) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Cocktail de coloration pour la cytométrie en flux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. ...

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Découvrez l'isolation et la culture de cellules endothéliales microvasculaires du tissu adipeux sous-cutané humain pour étudier leur diaphonie avec les adipocytes. Cette méthode permet d'explorer les mécanismes des maladies cardiométaboliques.

Étude de la diaphonie entre les cellules endothéliales adipeuses adipeuses et les adipocytes dans le tissu adipeux sous-cutané humain (Vidéo) | JoVE Journal

Étude de la diaphonie entre les cellules endothéliales adipeuses adipeuses et les adipocytes dans le tissu adipeux sous-cutané humain

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