2.15: Spectroscopie à résonance magnétique nucléaire (RMN)

1. préparation de la RMN, matière première

1. Ajouter environ 10 mg à partir de matériel dans un tube propre de NMR.
2. Dissoudre le produit de départ dans un solvant deutéré de mL ~0.7 (exemple donné CDCl₃). Une hauteur adéquate du solvant pour un bon spectre est de 4,5 à 5 cm.
3. Boucher le tube NMR soigneusement et écrire le nom de l’échantillon sur la PAC.
4. Agiter l’échantillon doucement pour s’assurer que tout le matériel avait dissous. Prendre soin d’éviter tout contact entre le solvant et la PAC, qui pourrait conduire à une contamination possible de l’échantillon.
5. Insérez le tube de NMR soigneusement dans un cône d’hélice. Le cône d’hélice tournera une fois inséré dans l’aimant pour s’assurer que l’ensemble de l’échantillon subit un champ magnétique homogène. Nettoyez l’extérieur du tube de NMR et spinner avec 2-propanol et laboratoire des tissus afin d’éliminer les traces de doigts et de la saleté.
6. Place la casserole dans une profondeur d’échantillonnage de calibre pour s’assurer que le fond du tube NMR n’est pas inséré trop profondément dans la sonde NMR comme qui peut éventuellement endommager le spectromètre. Différentes sondes ont des profondeurs différentes échantillon et l’utilisateur doit être conscient de la jauge de profondeur spécifique.
7. Placer l’échantillon dans le spectromètre RMN. Ici un spectromètre Varian 400 MHz, équipé d’un échantillonneur automatique, a été utilisé.
8. A l’issue de la mesure de NMR, traiter le spectre et assigner les pics dans le spectre.

2. préparation du NaOH 3M et Chalcone synthèse

1. Ajouter 60 mg NaOH dans une fiole jaugée de 50 mL.
2. Dissoudre le NaOH en ajoutant de l’eau déminéralisée à la moitié de la fiole. Diluer la solution plus loin en ajoutant plus d’eau jusqu'à ce que la marque est atteinte.
3. Ajouter 10 mL d’éthanol à un ballon à fond rond 50 mL équipé d’une barre d’agitation magnétique.
4. Par la suite, ajouter 680,5 mg 4-méthoxybenzaldéhyde et 5 mL de solution de NaOH préparée à l’étape 2.1 dans le même ballon.
5. Ajouter mg 671 4-méthylacétophénone ultérieurement à la solution brassée et boucher la fiole et remuer à la température ambiante.
6. Surveiller l’avancement de la réaction par ¹H RMN à intervalles de 30 min (voir étape 3) jusqu'à consommation complète des matières premières.
7. Ajouter 5 mL d’eau alors que la réaction a atteint fin (environ 3 h). Filtre le précipité qui en résulte et lavez-le avec 20 mL d’éthanol/eau de 1:2. Sécher à l’air précipitée.
8. Calculer le rendement du produit obtenu. Préparer un échantillon de NMR selon étape 1.2.2.7. Vérifier la pureté avec ¹H RMN. Si pas pur, purifier le produit par l’intermédiaire de recristallisation à l’éthanol.
9. Ajouter environ 3 gouttes du mélange réactionnel dans un tube de NMR à l’aide d’une pipette Pasteur et rincer la pipette avec solvant deutéré.
10. Répétez les étapes 1,2 – 1,8.

3. brève interprétation d’un spectre RMN

1. Processus le spectre avec un logiciel adapté (exemple MestReNova).
2. Corrélation entre les différents sommets pour les déplacements de la RMN dans le tableau 1. Les déplacements chimiques donne un soupçon de quel type d’environnement, les protons existe dans.
3. Intégrer les sommets pour obtenir le nombre d’hydrogènes correspondant à chaque pic. L’intégration de tous les pics donne un nombre relatif de protons totales.
4. Évaluer la séparation des pics-proton, qui indiquent le nombre de voisins.
5. Mesurer le raccord en J pour voir comment les protons sont reliés les uns aux autres.

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, ou RMN, est une méthode importante pour déterminer la structure moléculaire et la pureté des échantillons en chimie organique.

En spectroscopie RMN, les échantillons sont exposés à un fort champ magnétique. Lors de l’exposition, certains noyaux passent ou entrent en résonance entre des niveaux d’énergie discrets. L’écart d’énergie entre ces niveaux peut être mesuré et visualisé sous forme de spectres. Ces données peuvent être utilisées pour élucider la structure chimique de l’échantillon.

Tous les noyaux n’ont pas les propriétés requises pour être actifs par RMN. Les isotopes courants étudiés sont 1H, 2H, 13C, 19F et 31P.

Cette vidéo présentera les principes de la RMN, passera en revue des exemples de préparations d’échantillons de RMN à différentes étapes d’une réaction chimique et discutera de plusieurs applications.

Dans l’instrument RMN, de l’azote liquide et de l’hélium sont utilisés pour refroidir un aimant supraconducteur. L’aimant applique un champ magnétique constant à un échantillon. À l’intérieur de l’échantillon, les noyaux atomiques avec un nombre impair de protons et/ou de neutrons s’aligneront soit avec le champ, en adoptant un état de basse énergie, soit contre lui, en adoptant un état de haute énergie.

La différence d’énergie entre les deux niveaux est la fréquence de résonance, qui dépend de l’intensité du champ appliqué et du type de noyau. Pour les aimants utilisés en RMN, la valeur est dans la gamme des radiofréquences, ou RF.

Une bobine RF excite l’échantillon avec une impulsion de radiofréquence, déplaçant les noyaux de basse énergie vers l’état supérieur, avant de revenir. La bobine détecte ces changements de magnétisation, qui sont affichés sous forme de pics.

La force de la RMN réside dans sa capacité à distinguer les noyaux, en l’occurrence l’hydrogène, par leur environnement chimique. Les électrons des atomes voisins bloquent, ou « protègent » les noyaux d’une partie du champ magnétique. Ce champ effectif modifie la fréquence de résonance des noyaux particuliers, ce qu’on appelle un décalage chimique. Dans l’éthanol, les protons de méthylène, d’hydroxyle et de méthyle ont tous des fréquences de résonance uniques. La détermination de la zone sous chaque pic permet d’élucider le nombre de chaque type de proton.

Étant donné que les instruments ayant des forces magnétiques différentes modifient les fréquences de résonance, ils sont référencés à une molécule standard ajoutée à l’échantillon, souvent le tétraméthylsilane, ou TMS. Le décalage chimique des fréquences est très faible, souvent rapporté en parties par million, ou ppm.

Lors de l’utilisation d’un aimant puissant à haute résolution, les pics se divisent parfois en sous-pics. Ceci est causé par les noyaux voisins, dont certains sont alignés avec le champ magnétique, d’autres contre ; Modification supplémentaire du champ effectif appliqué aux noyaux. Dans l’éthanol, les 2 protons de méthylène divisent deux fois le pic de méthyle en un triplet, et les 3 protons de méthylène divisent le pic de méthylène trois fois en un quatuor. La distance de la séparation, ou couplage J, est liée à la distance des noyaux, ce qui facilite la découverte qualitative.

Maintenant que vous comprenez les principes de base de la RMN, passons en revue un exemple de procédure qui utilise la RMN des protons pour surveiller la synthèse du chalcone à partir d’un aldéhyde et d’une cétone.

Commencez par utiliser une pipette Pasteur pour ajouter une petite quantité de matière première dans un bécher. Passez dans la hotte et diluez le matériau de départ avec 0,7 mL de solvant deutéré. Des solvants deutérés sont utilisés, car la fréquence de résonance du deutérium est en dehors de la plage des protons.

À l’aide d’une pipette Pasteur, ajouter 0,7 mL de matière première diluée dans un tube RMN propre de 5,5 à 5 cm, en remplissant la partie inférieure de 4,5 à 5 cm. Fermez le tube RMN et étiquetez-le. Agitez doucement le tube en prenant soin d’éviter tout contact entre l’échantillon et le bouchon. Ensuite, insérez le tube dans la toupie.

Nettoyez l’extérieur du tube et de l’essoreuse à l’aide de 2-propanol et de mouchoirs de laboratoire. Placez ensuite l’échantillon dans la jauge de profondeur et calibrez la profondeur d’insertion.

Après l’étalonnage, chargez l’ensemble d’échantillons dans le spectromètre RMN, manuellement ou à l’aide d’un échantillonneur automatique. Enfin, utilisez un poste de travail informatique pour acquérir le spectre RMN.

Générer des spectres RMN à l’aide de cette procédure pour chacun des matériaux de départ de la réaction. Pour la synthèse de la chalcone, des spectres doivent être générés à la fois pour le méthoxybenzaldéhyde et la méthylacétophénone.

Ensuite, effectuez la synthèse de l’échantillon en combinant les matériaux de départ et les réactifs dans un flacon pour commencer la réaction.

À intervalles de 30 minutes, prélever une petite partie aliquote du mélange réactionnel à l’aide d’une pipette Pasteur et ajouter 3 gouttes dans un tube RMN propre.

Diluer ce produit de réaction brut avec un solvant deutéré et se préparer à la RMN en utilisant la procédure décrite précédemment.

Au fur et à mesure que la réaction progresse, un précipité jaune se forme. Lorsque la réaction est terminée, laver et filtrer le précipité et générer des spectres RMN pour le produit de réaction purifié.

Maintenant que nous avons généré des spectres RMN à chaque étape de la réaction chimique, analysons-les.

Les pics des spectres RMN pour chacun des matériaux de départ sont attribués à différents groupes de protons au sein de la molécule en fonction de leurs décalages chimiques et du nombre de protons contribuant à chaque pic. Ici, nous attribuons les 4 principaux groupes de protons pour la méthylacétophénone et le méthoxybenzaldéhyde, en notant le pic d’aldéhyde entre 9,5 et 10,5 ppm. En comparant les spectres RMN des produits de réaction bruts à différents points temporels, l’évolution de la réaction chimique qui synthétise le chalcone est élucidée. Par exemple, le pic d’aldéhyde du matériau de départ, le méthoxybenzaldéhyde, est toujours présent après 30 minutes de réaction, mais a complètement disparu après 3 heures, ce qui signifie que la réaction est terminée.

En examinant le spectre du produit purifié, nous pouvons attribuer chaque pic à un groupe de protons dans la structure de la chalcone. Par exemple, en examinant les pics 3 et 4, nous voyons que leurs intégrales sont toutes deux un, ce qui correspond à des groupes contenant un seul proton.

Les pics 3 et 4 sont appelés doublets indiquant un proton voisin. Les deux ont des constantes de couplage J de 16 Hz, ce qui suggère que les protons sont situés sur une double liaison E. En attribuant tous les pics RMN du produit réactionnel purifié, nous confirmons la synthèse d’une chalcone pure.

La spectroscopie RMN a un large éventail d’applications et est utilisée dans de nombreux domaines scientifiques et médicaux.

Dans cette application, la RMN des protons est utilisée pour vérifier la synthèse et la structure du diamidocarbène et de la mononoamidocarbine, dont les spectres RMN ont des modèles de division des pics différents. Ces carbènes ont également généré des produits de réaction apparemment différents lorsqu’ils étaient combinés avec du phosphore blanc ; DAC1 a généré un produit de réaction rouge vif, tandis que MAAC2 a produit un produit orange vif. Ces différences dans les produits de réaction ont été confirmées à l’aide d’une deuxième application de RMN, 31P ? La RMN, qui génère des spectres basés sur les différences de fréquence de résonance des noyaux de phosphore.

Ici, l’imagerie par résonance magnétique nucléaire, ou IRM, a été utilisée pour générer une carte anatomique du cerveau et pour sélectionner les régions cérébrales d’intérêt. Ensuite, la spectroscopie RMN a été utilisée pour générer des spectres des métabolites clés. Enfin, à l’aide de l’IRM, les changements dans le métabolisme cérébral dans différentes conditions expérimentales ont été évalués.

Dans cette application, la RMN a été utilisée pour analyser les propriétés de liaison et proposer une structure 3D d’un peptide de liaison au cuivre. Tout d’abord, les spectres RMN ont été comparés pour les états non liés et liés au cuivre du peptide. Ensuite, à l’aide de techniques RMN bidimensionnelles plus avancées, différentes conformations potentielles de la structure du peptide ont été évaluées. Enfin, ces contraintes structurelles dérivées de la RMN ont été utilisées pour développer une structure tridimensionnelle proposée pour le peptide non lié.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’analyse RMN. Vous devriez maintenant comprendre les principes sous-jacents à la génération et à l’analyse des spectres RMN, ainsi qu’une procédure de préparation d’échantillons RMN.

Merci d’avoir regardé !