Un modèle de souris préclinique de l’ostéosarcome pour définir la Communication médiée par les vésicules extracellulaire entre la tumeur et les cellules souches mésenchymateuses

L’objectif global de cette procédure expérimentale est de développer un modèle murin préclinique pour étudier le rôle de la communication médiée par les vésicules extracellulaires entre la tumeur et les cellules souches mésenchymateuses. Cette méthode peut aider à répondre à plusieurs questions clés dans le domaine de la biologie du cancer, à savoir comment les cellules souches tumorales et mésenchymateuses communiquent au moyen de vésicules extracellulaires, et si cela favorise la progression du cancer. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier le rôle de l’adaptation des cellules souches mésenchymateuses par les VE cancéreuses, sur la progression et la formation des métastases in vivo.

L’implication de cette procédure s’étend à notre traitement du cancer, car nous pouvons utiliser la GSA pour interférer avec la communication EV et la signalisation des androgènes pour inhiber la progression du cancer. En plus de fournir des informations sur la communication médiée par l’EV dans l’ostéosarcome, cette méthode peut également être appliquée à de nombreux autres types de cancer. En effet, la moelle osseuse dérivée des cellules souches mésenchymateuses est facilement recrutée sur d’autres sites où elle peut se différencier en cellules de soutien au cancer.

Commencez par ensemencer huit flacons de 175 centimètres carrés avec 3 millions de cellules 143B chacun. Cultivez les cellules à l’aide d’un milieu appauvri en EV pendant 36 à 48 heures. Lorsque les cellules sont confluentes à 80 ou 90 %, prélever les surnageants dans les huit flacons pour isoler les VE.

Ensuite, utilisez la centrifugation différentielle pour éliminer toutes les cellules et les débris cellulaires du surnageant. Il s’agit de centrifugations répétées à quatre degrés Celsius, avec une accélération et une décélération maximales. Après chaque étape de centrifugation, récupérez le surnageant et laissez un millilitre de surnageant dans le tube de centrifugation.

Maintenant, chargez un surnageant pré-autorisé dans des tubes d’ultracentrifugation à 38,5 millilitres par tube. Ensuite, isolez les VE à l’aide d’une ultracentrifugeuse à 70 000 g pendant une heure, avec une pause lente et à quatre degrés Celsius. Après l’ultracentrifugation, retirez soigneusement le surnageant, en laissant environ un millilitre.

Ensuite, mettez en suspension les granulés contenant des VE dans le volume restant. Regrouper toutes les suspensions. Et lavez les suspensions regroupées avec du PBS.

Remplissez le tube à 38,5 millilitres. Ensuite, répétez le cycle d’ultracentrifugation, mais n’utilisez aucune pause. Le rotor devrait s’arrêter de tourner après environ une heure.

Ensuite, retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille et laissez 100 à 200 microlitres de solution. Enfin, remettez en suspension la pastille EV et ajustez le volume final à 200 microlitres avec PBS. Les VE peuvent ensuite être caractérisées par MET, marquées avec des colorants pour les expériences d’absorption, ou utilisées pour éduquer les cellules souches mésenchymateuses pour des expériences in vivo.

Il est crucial que les CSM primaires aient la bonne densité cellulaire avant l’exposition aux VE cancéreuses. La cellule doit être confluente à environ 70 % pour obtenir un rapport EV cellulaire optimal et pour éviter la prolifération pendant les périodes d’éducation. Cette expérience utilise des souris adultes acclimatées Athymic Nude-Foxn1nu.

Un jour avant l’intervention chirurgicale, fournissez du paracétamol via l’eau de boisson. Le jour de l’opération, préparez des cellules 143B à 200 000 par microlitre en PBS. 20 minutes avant l’opération, donnez à l’animal de la buprénorfine.

Juste avant l’anesthésie, chargez une seringue de 10 microlitres avec les cellules 143B concentrées. Après avoir confirmé la bonne anesthésie et appliqué une pommade oculaire, positionnez l’animal sur le dos avec ses pattes arrière vers l’opérateur. Ensuite, fixez un masque d’anesthésie à l’animal.

Ensuite, fléchissez le genou gauche et essuyez la peau avec trois gommages alternés d’éthanol à 70 % et de povidone iodée, puis appliquez de la lidocaïne à 2 % comme analgésique local. Maintenant, faites une petite incision dans la peau juste en dessous du genou pour exposer le tibia. Ensuite, à l’aide d’une perceuse micro-torsadée de 0,8 millimiter, faites un trou d’épingle dans le tibia, à environ 2 millimètres sous le genou.

Évitez de percer à travers les deux cortex tibial. Procédez en injectant lentement un microlitre de cellules dans le trou pendant environ cinq secondes. Ensuite, fermez le trou avec une gouttelette de colle à tissu pour éviter le reflux de la suspension.

Terminez la chirurgie en fermant la peau avec des sutures et une goutte de colle tissulaire. Laissez l’animal récupérer en chauffant et traitez-le avec du paracétamol pendant 24 heures. Deux jours plus tard, utilisez une seringue à insuline de 0,5 millimètre pour injecter les CSM dans la veine de la queue.

L’administration correcte lors d’une injection dans la veine caudale peut être confirmée visuellement. Si une zone blanche apparaît, ou si vous rencontrez une résistance, veuillez injecter à nouveau dans une zone au-dessus du site d’injection précédent. Ensuite, deux fois par semaine, suivez la croissance tumorale en utilisant la bioluminescence.

Injectez aux souris de la D-luciférine à l’aide d’une seringue à insuline et, 10 minutes plus tard, mesurez le flux de photons généré par les cellules tumorales à l’aide d’un système d’imagerie. Lorsque le diamètre de la tumeur d’un animal devient supérieur à 15 millimètres, ou que sa perte de poids dépasse 15 %, euthanasiez l’animal et collectez tous les tissus pertinents. 10 minutes avant l’euthanasie, injectez de la D-luciférine, comme cela a été fait avant l’imagerie.

Après l’euthanasie, prélevez les poumons, le foie, la rate et les reins à l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler stérilisés. Lavez le sang des organes à l’aide de PBS et disposez-les sur une boîte de Pétri pour l’imagerie. À l’aide d’un système d’imagerie par bioluminescence, documentez les deux côtés des organes.

Une fois les images prises, fixez immédiatement les organes pour une analyse histologique future. Pour traiter les documents photo, il suffit d’appliquer un seuillage manuel et de compter le nombre de nodules sur chaque photo. Assurez-vous d’utiliser le même seuil pour chaque photo et de documenter les tissus de toutes les directions, en particulier les poumons.

Après avoir décalcifié le tibia de la souris, procédez à la déshydratation et à l’incorporation de paraffine. Ensuite, utilisez un microtome pour préparer des sections de paraffine de six microns et collectez les sections sur des lames de verre. Une fois les lames sèches, conservez-les toute la nuit à température ambiante.

Le lendemain, effectuez un prélèvement d’antigène médié par la chaleur, à l’aide d’un tampon de citrate. Ensuite, colorez les tissus avec un anticorps anti-GFP à un à 900, puis avec une contre-coloration DAPI. Enfin, documentez les coupes de tissus colorés à l’aide de la microscopie à fluorescence.

La pureté des VE isolés a été confirmée par microscopie électronique. Les préparations contenaient des vésicules de 40 à 100 nanomètres de diamètre. Pour évaluer si les VE cancéreuses interagissent avec les CSM, les VE ont été marquées avec un colorant de liaison lipophile fluorescent vert et incubées pendant la nuit avec des CSM.

L’adoption efficace des VE par les MSC a ainsi été confirmée. Une propriété immunomodulatrice des VE sur les CSM a été confirmée à l’aide d’un dosage immunologique multiplex des cytokines B. Les VE tumorales ont provoqué une augmentation de la production d’IL-8 et d’IL-6 dans les CSM, par rapport aux VE de contrôle des fibroblastes humains.

Ensuite, dans un modèle murin de xénogreffe orthotopique d’ostéosarcome, il a été démontré que les souris traitées avec des CSM éduquées à l’EV avaient une croissance tumorale accélérée. Quatre jours après l’injection systémique de CSM exprimant la GFP, des cellules exprimant la GFP ont été détectées dans la moelle osseuse et dans le tissu tumoral, démontrant la localisation des CSM vers le site tumoral. L’imagerie ex vivo de divers organes a mis en évidence la formation de nodules pulmonaires.

En fin de compte, les souris recevant des CSM éduquées à l’EV avaient plus de métastases pulmonaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’éduquer les cellules stromales avec des VE cancéreuses ex vivo, et d’étudier les effets des cellules stromales éduquées in vivo à l’aide de modèles murins précliniques. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée dans les quatre semaines, à condition qu’il y ait suffisamment de VE anticancéreuses disponibles.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de planifier à l’avance et d’obtenir une purification reproductible des vésicules extracellulaires cancéreuses, ainsi que d’utiliser des cellules souches mésenchymateuses proliférantes à faible passage.