Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné In situ du tissu pulmonaire et coloration X-gal de LacZ-Tag cellules tumorales

L’objectif global de cette procédure est d’améliorer la détection des micro-métastases dans le poumon de souris ex vivo tout en préservant l’architecture des poumons gonflés. Ceci est accompli en perfusant d’abord le poumon in situ avec PBS pour éliminer le sang, qui est la principale source de fond de couleur dans ce tissu. Les étapes suivantes consistent à gonfler le poumon par injection de PFA, puis à pincer pour fixer le tissu pulmonaire sous l’effet du gonflage.

Ensuite, le poumon est retiré et fixé dans du PFA ou des lobes pulmonaires uniques sont intégrés pour la cryosection. Les dernières étapes consistent à colorer les tissus dans une solution Xal et à visualiser les cellules tumorales LA zag finalement les métastases sur des lobes pulmonaires entiers ou dans des coupes de tissu pulmonaire peuvent être détectées jusqu’au niveau d’une seule cellule avec un microscope binoculaire ou un microscope optique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le ciel debout tout seul, est que la détectabilité des micrométastases est considérablement améliorée en raison de l’élimination du bruit de fond lié au sang.

Commencez le protocole en anesthésiant une souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine, de xylazine et d’as promazine dans environ 150 microlitres de PBS. Lorsque les réflexes douloureux de la souris ne sont plus observés, fixez-le sur la table d’opération. Revenez en arrière et lissez les cheveux avec de l’éthanol à 70 %.

Ouvrez la peau de l’abdomen jusqu’au cou. Tirez la peau sur les côtés ou retirez-la. Ouvrez soigneusement le péritoine du thorax pour éviter la rupture de gros vaisseaux comme la veine jugulaire.

Cela améliorera l’efficacité de la perfusion. Coupez maintenant la veine cave cardis sous le foie à l’aide d’une seringue de 20 millilitres avec une aiguille de calibre 21 à 24. Injectez lentement 10 à 15 millilitres de PBS dans le ventricule droit du cœur battant jusqu’à ce que le poumon soit complètement blanc et que le cœur cesse de battre.

Ensuite, pincez les vaisseaux sanguins au-dessus du foie et du diaphragme avec une pince vasculaire. Chargez une seringue de 10 millilitres avec 3 % d’aldéhyde paraforme, et avec une aiguille de calibre 21 à 24, injectez dans le ventricule droit. Environ deux millilitres.

Découvrez la trachée à l’extérieur du thorax et gonflez le poumon avec une injection dans la trachée d’environ trois millilitres d’aldéhyde de l’extérieur du thorax. Ensuite, immédiatement après avoir retiré l’aiguille, pincez la trachée dorlotée à la ponction avec une pince vasculaire et attendez 10 minutes pour permettre la fixation. Ensuite, transectez les vaisseaux sanguins au-dessus de la pince vasculaire.

Retirez ensuite la pince et injectez environ deux millilitres de PBS dans le ventricule droit pour éliminer l’excès de formaldéhyde. Percez les parties inférieures de tous les lobes pulmonaires à l’aide d’une aiguille et retirez la pince vasculaire au niveau de la trachée. Injectez maintenant trois à cinq millilitres de solution d’enrobage diluée dans la trachée dorlotée à l’autre injection.

Arrêtez l’injection lorsque la peau du paraforme dans les lobes pulmonaires est remplacée par la solution. Retirez le poumon avec précaution en tirant le cœur avec une pince et en transectant les ligaments du tissu conjonctif, les vaisseaux sanguins et la trachée. Assurez-vous de garder le cœur connecté aux poumons.

Réservez un lobe pour les cryosections et utilisez le tissu pulmonaire restant pour toute la longue coloration. Placez le poumon dans un gobelet en plastique avec un couvercle à fermeture hermétique et fixez-le avec du formaldéhyde à 2 % et du PBS. Mettez un morceau de gaze sur le dessus du poumon pour le garder dans la solution et laissez-le reposer à température ambiante pendant 30 minutes.

Au bout d’une demi-heure, retirez la solution de fixation et lavez soigneusement le tissu Avec PB S3 fois, préparez fraîchement la solution xal prête à l’emploi en diluant un millilitre de solution mère Xal, un à 40 dans la solution de coloration de base et ajoutez-en au moins 10 millilitres dans la tasse. Enfoncez le poumon avec un morceau de gaze. Fixez le couvercle sans serrer pour permettre l’échange d’air et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq heures à l’abri de la lumière.

Après l’incubation, retirez la solution xal. Rincez les poumons une fois avec du PBS pour éliminer la solution résiduelle de xal et ajoutez au moins 10 millilitres d’aldéhyde paraforme à 4 % dans le PBS. Le tissu est maintenant prêt pour l’histologie et peut être stocké pendant longtemps dans le PFA à 4 % à quatre degrés Celsius.

Commencez par remplir un tiers d’un moule d’enrobage avec un support d’enrobage poly forze non dilué. Ensuite, chargez le lobe pulmonaire dans le moule et continuez à ajouter du milieu jusqu’à ce que le lobe soit complètement couvert. Évitez soigneusement de faire des bulles d’air, incubez maintenant le lobe incrusté à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, préparez les poumons incrustés pour la section en les congelant lentement dans un mélange de glace sèche et d’isop pentane. Si nécessaire, ils peuvent maintenant être transférés dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pour être stockés sur un cryostat coupé de sept à 10 microns Sections cryogéniques du lobe Montez les sections sur des lames prêtes à l’emploi Une fois montées, incubez immédiatement les sections dans une solution de coloration xal à 37 degrés Celsius pendant 24 heures dans une chambre humidifiée. Le lendemain, rincez les lames dans PBS deux fois pendant cinq minutes par rinçage.

Poursuivez avec un bref rinçage à l’eau distillée. Maintenant, contre-colorez les lames avec du rouge nucléaire pendant 10 secondes pour obtenir une contre-coloration faible qui rend le xal plus dominant et rincez immédiatement la contre-tache à l’eau distillée. Pour une tache de comptoir plus foncée, prolongez le temps jusqu’à 30 secondes ou plus.

Montez les lames avec un support immunitaire. La formation de métastases dans les modèles de SG de souris LM huit a été réétudiée. En utilisant les images représentatives décrites ici de poumons perfusés et non irfusés de souris injectées simultanément avec des cellules contrôlées contrôlées transduites et non transduites.

Les métastases macroscopiques et microscopiques sont restées indétectables dans les poumons non perfusés et perfusés. Mais il est intéressant de noter que chez les souris injectées avec des cellules LA Z dun, la coloration xgl a révélé des foyers micrométastatiques bleus de cellules uniques ou de petits amas de cellules à la surface des poumons non perfusés. La perfusion in situ et la fixation des poumons améliorent encore la détectabilité des micrométastases de Dun la z, cependant, l’excroissance vers des foyers macroscopiques n’a pas été observée chez les souris injectées avec des cellules LM témoins huit cellules translucides, Des foyers macrométastatiques à peine détectables de plus de 0,1 millimètre de diamètre ont été reconnus dans les poumons non perfusés. La perfusion du poumon n’a pas amélioré la détection des foyers.

Cependant, chez des souris injectées avec des cellules LAC Z ates, plusieurs macro-métastases bleues ont été détectées à la surface d’organes non perfusés. Des micrométastases ont également été détectées à la surface d’organes non perfusés. De plus, la perfusion des poumons a encore amélioré la détectabilité des macro et micrométastases.

Par conséquent, les micro et macrométastases sont devenues visibles à une densité plus élevée et en plus grand nombre, principalement en raison de la translucidité du tissu perfusé, dans lequel des foyers sous la surface de l’organe sont également devenus visibles. Une analyse histologique supplémentaire utilisant des cryocoupes de tissu pulmonaire a confirmé l’amélioration de la détectabilité des métastases pulmonaires chez les souris injectées avec des cellules LAX Z transduites et des cellules LM huit chez les souris avec des tumeurs primaires dérivées des cellules Dun LAX Z. Des micrométastases ou même des foyers unicellulaires ont été reconnus dans des coupes pulmonaires.

Cela n’a pas été observé chez les souris présentant des tumeurs primaires des cellules de contrôle respectives. De plus, les macrométastases étaient également plus clairement visibles chez les souris auxquelles on avait injecté des cellules LM huit LA C que chez les animaux avec les cellules témoins LM huit. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la perfusion et la fixation pulmonaires dans ZI deux et la coloration excisée ultérieure des métastases dans les poumons excisés.

Cette technique est un critère d’évaluation très sensible pour la distribution des métastases dans le poumon dans tout type d’étude sur le cancer, et peut également servir de référence pour l’amélioration des techniques d’imagerie in vivo actuelles telles que la micro CT, la TEP et l’IRM utilisées pour la détection précoce des lésions métastatiques.