Name: Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné In situ du tissu pulmonaire et coloration X-gal de LacZ-Tag cellules tumorales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Découvrez une méthode de détection des métastases pulmonaires à résolution cellulaire unique chez la souris. Ce protocole combine la perfusion in situ du poumon et la coloration X-Gal des cellules tumorales lacZ-marquées.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Lubor Borsig (Institut de Physiologie de l&#39;Université de Zurich) pour ses conseils sur la technique de la perfusion du poumon. Ce travail a été soutenu par des subventions du Krebsliga du canton de Zurich, le L. Walter et Johanna Wolf Foundation, Zurich, le Lydia Hochstrasser Foundation, Zurich, le Fonds national suisse, le FNS, la Suisse, le Schweizerischer Verein Balgrist, et l&#39;Université de Zurich.

1. Perfusion pulmonaire in situ et de fixation <ol><li> Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de ~ 150 ul solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 112,5 mg / kg (poids corporel) kétamine, 16,5 mg / kg de xylazine et 15 mg / kg acépromazine (ou par un autre anesthésie contenant des analgésiques appropriés). </li><li> Lorsque les réflexes de la souris ne sont plus respectées, le fixer sur la table d&#39;opération en arrière vers le bas et mouiller le pelage avec de l&#39;éthanol à 70% lisses les cheveux vers le bas. </li><li> Ouvrir la peau de l&#39;abdomen jusqu&#39;au cou et tirez-le vers les côtés ou le supprimer. </li><li> Ouvrez le péritoine et le thorax à une taille suffisante. Prévenir les ruptures de vaisseaux de grande taille (par exemple, la veine jugulaire) afin d&#39;éviter une perte d&#39;efficacité de la perfusion ultérieure. </li><li> Couper la veine cave caudale sous le foie. </li><li> Utilisez une seringue de 20 ml équipé d&#39;un 21G - 24G aiguille pour injecter le produit lentement 10-15 ml de PBS dans le ventricule droit du cœur battant jusqu&#39;à ce que le poumon est complètement blanc etle cœur cesse de battre (asystolie). </li><li> Pincer les vaisseaux sanguins au-dessus du foie et le diaphragme avec une pince vasculaire. </li><li> Utiliser une seringue de 10 ml équipé d&#39;un 21G - 24G aiguille pour injecter ~ 2 ml de paraformaldéhyde à 3% (PFA) dans le PBS dans le ventricule droit. </li><li> Découvrir la trachée à l&#39;extérieur de la cage thoracique. Utilisez la même seringue pour injecter ~ 3 ml de PFA 3% dans du PBS crânienne (à l&#39;extérieur du thorax) dans la trachée jusqu&#39;à ce que le poumon est gonflé. Immédiatement après le retrait de l&#39;aiguille, pincer la trachée caudale de la perforation avec une pince vasculaire et d&#39;attendre 10 minutes pour permettre la fixation. </li><li> Transect les vaisseaux sanguins au-dessus du clamp vasculaire, enlever le collier et injecter ~ 2 ml de PBS dans le ventricule droit pour enlever l&#39;excès PFA. </li><li> Percer les parties inférieures de l&#39;ensemble des lobes de poumon avec une aiguille, retirer la pince vasculaire à la trachée et injecter 3-5 ml d&#39;une solution d&#39;enrobage moyen PolyFreeze / PBS 1:1 dans la trachée caudale de la première perforation jusqu&#39;à ce que le PFA dans l&#39; poumonlobes est remplacé par la solution. </li><li> Retirez soigneusement le poumon en tirant sur le cœur avec une pince et en sectionnant les ligaments du tissu conjonctif, des vaisseaux sanguins et la trachée. Gardez le coeur relié aux poumons. </li><li> Selon la façon de procéder à l&#39;analyse des tissus du poumon continuent avec les protocoles décrits dans les sections 2 ou 3. Si vous voulez faire les deux analyses, enlever un lobe du poumon et procédez comme décrit au point 3. Traiter les lobes restants liés au cœur, comme décrit au point 2. </li></ol> 2. Visualisation de lacZ-taggés cellules tumorales métastatiques dans les lobes pulmonaires entières <ol><li> Placer le poumon dans un gobelet en plastique avec couvercle à fermeture étanche et le fixer avec du formaldéhyde à 2% dans du PBS à température ambiante pendant 30-60 min. </li><li> Retirer la solution de fixation et de bien se laver 3 fois avec du PBS. </li><li> Ajouter au moins 10 ml fraîchement préparée 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal) solution de coloration (solution mère de X-Gal [40 mg / ml dansDiméthylformamide] 1:40 diluée dans une solution de coloration de base, pH 7,1 (tableau 1); abri de la lumière). </li><li> Placer un morceau de gaze sur le dessus du poumon natation de le garder complètement dans la solution et placez le couvercle que faiblement sur le pot pour permettre un échange d&#39;air. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 3-5 h abri de la lumière. </li><li> Retirer X-Gal solution, rincer une fois avec du PBS pour éliminer les résidus X-Gal solution (en option) et ajouter 4% de PFA. </li></ol> 3. Visualisation de lacZ-taggés cellules tumorales métastatiques pulmonaires dans cryosections <ol><li> Prefill un moule d&#39;enrobage étiqueté à 1/3 avec support intégration PolyFreeze non dilué. Mettre le lobe pulmonaire sur le dessus et remplir avec incorporation moyen jusqu&#39;à ce que le lobe est entièrement recouvert. Essayez d&#39;éviter les bulles. </li><li> Incuber les poumons incorporés à 4 ° C pendant 20 min. </li><li> Puis geler les poumons embarqués lentement dans un mélange de glace sèche et l&#39;isopentane et conserver à -80 ° C. </li><li> Couper um 10.07 cryosections sur un cryostat et les monter sur des lames de microscope SuperFrostPlus. </li><li> Incuber les sections immédiatement avec une solution de coloration X-Gal à 37 ° C pendant 24 heures dans une chambre humide. </li><li> Rincer les lames dans du PBS 2 fois pendant 5 min, puis brièvement dans de l&#39;eau distillée. </li><li> Contre-coloration avec le rouge rapide nucléaire pendant 10-30 secondes, rincer à l&#39;eau distillée et monter les lames avec Immu-Mount. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Asai et al. Rapporté dans l&#39;article d&#39;origine sur le modèle de Dunn dérivé LM8 souris OS que les tumeurs sc primaires dérivées des cellules parentales Dunn, différents de ceux issus de la grande lignée de cellules métastatique LM8 sous, ne forment spontanément des métastases pulmonaires détectables dans syngéniques C3H 14. Avec les techniques rapportées ici, nous avons une nouvelle enquête de la formation de métastases dans les modèles Dunn/LM8 OS souris. Nous avons profité de lacZ stable transduites par Dunn et LM8 cellules et d&#39;un protocole pour la perfusion du poumon in situ et de la fixation sur des souris. Des images représentatives des poumons perfusés et non perfusée de souris injectées avec lacZ sous-cutanée transduites et non transduites contrôle Dunn et LM8 cellules sont représentées sur la figure 1. Chez les souris injectées avec des cellules de contrôle Dunn, métastases macroscopiques et microscopiques restée indétectable dans les poumons perfusés et non perfusés (figure 1A, i-iv). Mais, curieusement, chez des souris injectées avec des cellules Dunn-lacZ, coloration X-gal a révélé bleu micrométastatique foyers de cellules simples ou amas de cellules de petite taille (&lt;0,1 mm) sur la surface de la non-perfusés poumons (figure 1A, vi). In- perfusion in situ et la fixation des poumons encore amélioré la détectabilité de Dunn-lacZ micrométastases (figure 1A, viii). Cependant, excroissance au macroscopique des foyers n&#39;a pas été observé (figure 1A, v, vii). &lt;/ P&gt; Chez les souris injectées avec des cellules de contrôle LM8, translucides, à peine détectable macrométastatique foyers supérieure à 0,1 mm de diamètre ont été reconnus dans les poumons non perfusés (figure 1B, i). Perfusion du poumon (figure 1B, iii) n&#39;améliore pas la détection des foyers. Cependant, chez les souris injectées avec LM8-lacZ plusieurs cellules X-Gal teinté bleu macro-(figure 1B, v) et micrométastases (figure 1B, vi) ont été détectés à la surface de la non-perfusés organes. En outre, la perfusion des poumons en outre amélioré la détectabilité des macro-et micro-métastases (figure 1B, vii - viii). Par conséquent, les micro-et macrométastases est devenu visible à une densité plus élevée et un plus grand nombre, principalement en raison de la translucidité du tissu perfusé dans lequel foyers sous la surface de l&#39;organe est devenu aussi visible. Une h supplémentaireanalyse istological utilisant cryosections de tissu pulmonaire confirmé l&#39;amélioration de la détectabilité des métastases pulmonaires chez des souris injectées avec lacZ transduites par Dunn et LM8 cellules. Chez les souris ayant des tumeurs primaires dérivées de Dunn-lacZ ou LM8-lacZ cellules, contrairement aux souris atteintes de tumeurs primaires des cellules témoins respectifs, des micrométastases ou de cellules, même seul foyers ont été constatés dans les sections du poumon (figure 2). En outre, macrométastases étaient également plus clairement visible dans les souris injectées avec des cellules LM8-lacZ que chez les animaux injectés avec le contrôle LM8 cellules (figure 2C, D). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Figure 1. Détection de métastases spontanées de non transduites (i-iv) et lacZ-transduction (v-viii) Dunn (A) et LM8 (B) dans les cellules non perfusé (i, ii, v, vi) et perfusé (iii, iv, vii, viii) les poumons chez les souris C3H. Métastases représentant X-Gal-staINED poumons entiers (v, vii en A et B) et correspondant en gros plan (vi, viii A et B) apparaissent en bleu. Macrométastatique foyers (&gt; 0,1 mm) dans les organes de souris injectées avec des cellules marqués LM8 (i-iv en B) sont indiqués par des astérisques. Zones indiquées dans les gros plans sont représentatifs de poumons entiers. Barres d&#39;échelle indiquent 1 mm dans les images de poumons entiers et 0,1 mm en gros plan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Figure 2. Détection de Dunn et LM8 micrométastases dans cryosections pulmonaires. Des coupes de tissu pulmonaire octobre embarqué ont été incubés dans X-Gal solution de coloration à 37 ° C pendant 24 heures dans une chambre humide et ensuite contre le nucléaire rapide rouge. Les flèches indiquent micrométastatique foyers reconnus dans les sections de poumons de souris injectées avec Dunn-lacZ (B) ou LM8-lacZ cellules (D). Micrometastases restée indétectable dans les sections de poumon de souris injectées avec des non-transduites Dunn (A) ou LM8 cellules (C). Barres d&#39;échelle indiquent 0,1 mm.

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<li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+and+cancer+revisited%3A+mechanistic+connections+involving+platelets%2C+P-selectin%2C+carcinoma+mucins%2C+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn%2FLM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li>
<li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+%28LM8%29+with+high+metastatic+potential+to+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li>
<li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les résultats présentés ici dans le modèle de souris Dunn/LM8 OS démontrer la puissance de la méthode nouvellement créée qui combine la coloration X-Gal de lacZ-taggés cellules tumorales avec la perfusion in situ / fixation du tissu pulmonaire. Cette combinaison de deux techniques permet de détecter des lésions de sensibilité micrométastatiques jusqu&#39;au niveau de la cellule unique et améliore également la visualisation de macrométastases sur la surface du poumon (figure 1) ainsi que dans les sections du poumon (figure 2). Bien que la coloration X-Gal permet également la détection de (micro) métastases dans d&#39;autres organes, in-situ de perfusion / fixation améliore la détectabilité des foyers métastatiques dans les tissus autres que le poumon que légèrement en raison de la couleur naturelle du sang et des tissus liée à de ces 13 organes. Même si la perfusion est dirigé vers un autre organe, par exemple le foie, l&#39;élimination du sang serait que partiellement améliorer le contraste pariween coloration X-Gal et de la couleur naturelle de l&#39;organe. Cependant, la méthode est applicable à tout type de lacZ étiquetées cellules tumorales, va considérablement améliorer la détectabilité des métastases pulmonaires jusqu&#39;au niveau des dormants unicellulaires micrométastases et permet une quantification simple et fiable de macro-et micro-métastases. Une limitation de cette méthode et toutes les autres techniques qui sont basées sur des gènes rapporteurs luciférase, y compris les protéines fluorescentes, et c&#39;est la stabilité de l&#39;expression du transgène. Comme le montre la figure 2d, toutes les cellules tumorales dans les foyers macrométastatique sont colorés en bleu, ce qui indique un manque d&#39;activité beta-galactosidase. Cela pourrait être lié à la nécrose, mais il est plus probablement due à une perte de l&#39;expression du transgène. Nous avons observé que la Dunn et LM8 cellules sont très efficaces dans la régulation négative de lacZ et d&#39;autres transgènes même dans la sélection continue d&#39;expression. Nous avons donc mis dans des études récentes de la K12 murinet K7M2 et les humains HOS, 143B et Saos-2 lignées de cellules d&#39;ostéosarcome, qui ont tous maintenu stable expression de lacZ in vitro ainsi que in vivo jusqu&#39;à 100% au cours du temps. Une fois stable lacZ-expression est garantie, cette technique peut être appliquée dans des études avec des gènes manipulés cellules tumorales de façon mécanique, par exemple pour étudier le processus de colonisation des tissus de 13 ainsi que pour le développement et les essais de nouveaux traitements visant à l&#39;éradication des lésions métastatiques 15 , 16. De plus, il peut servir de référence pour l&#39;amélioration des techniques actuelles d&#39;imagerie radiologique, tels que le PET, le (micro) TDM et l&#39;IRM, utilisés pour la détection précoce des lésions métastatiques. Dans une étude récente PET (inédit) avec différents traceurs nous avons vérifié le dans le poumon détecté in vivo les métastases in vivo par la suite ex avec le protocole décrit. Dans une étude en cours avec un animal nouveau petit micro-CT (SkyScan) nous sommes si loin able pour détecter les métastases pulmonaires in vivo à une taille de 0,5 mm et ex vivo à 0,3 mm, mais nous visons à une résolution de 0,1 mm. Il est intéressant, c&#39;est la limite de taille que nous avons mis de distinguer macro et micro-métastases avec la méthode combinée de la perfusion in situ et coloration X-Gal. Cela souligne encore une fois la sensibilité et l&#39;utilité de cette technique facile et rentable.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Narketan10 (kétamine) </td><td> Vétoquinol SA </td><td></td><td> 100 mg / ml, solution </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazine) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml, solution </td></tr><tr><td> Prequilan (acépromazine) </td><td> FATRO SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml, solution </td></tr><tr><td> Bulldog Type de Serrefine clamp vasculaire </td><td> Outils Fine Science </td><td> 18051-35 </td><td> courbé, 35 mm </td></tr><tr><td> Gobelet en plastique avec couvercle </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 tasses ml avec couvercles </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); poudre </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> dissoudre dans de la N, N-di-méthylformamide à 40 mg / ml, magasin protégée lumière à -20 ° C </td></tr><tr><td> Une solution de coloration de base, équilibrée à pH 7,1, stockée lumière protégés à 4 ° C pendant max. 1 mois </td><td> auto-rendu </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L 1M MgCl2, 2 ml / L 10% de NP40, 1 ml / L 10% Sodium désoxycholate- </td></tr><tr><td> Moyen Embedding PolyFreeze </td><td> Polysciences; distributeur suisse: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Intégration moule </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 cryostat </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diapositives SuperFrost </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red-- solution de sulfate d&#39;aluminium </td><td> Division Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-Mount </td><td> Thermo Electron, distributeur suisse: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réactifs et matériel.

amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la résolution single cell chez les souris en combiné<em&gt; in situ</emperfusion&gt; du tissu pulmonaire et coloration x-gal de<em&gt; lacz</em&gt;-tag cellules tumorales

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Les métastases sont la principale cause de décès dans la plupart des types de cancer et par conséquent un des principaux axes de recherche sur le cancer. Cependant, la détection des micrométastases par imagerie radiologique et le succès de leur éradication thérapeutiques restent limitées. Alors que les modèles animaux se sont révélés être des outils précieux pour recherche sur le cancer 1, le suivi / visualisation des micrométastases reste un défi et une évaluation inexacte de la dissémination métastatique dans les études précliniques conduit potentiellement à des résultats décevants dans les essais cliniques 2. Par conséquent, il ya un grand intérêt à perfectionner les méthodes pour enfin permettre la détection reproductible et fiable des métastases jusqu&#39;au niveau de la cellule unique dans les tissus normaux. L&#39;objectif principal est donc sur des techniques qui permettent la détection de cellules tumorales in vivo, comme les micro-tomographie par ordinateur (micro-CT), la tomographie par émission de positons (TEP), imagerie de fluorescence ou de bioluminescence &lt;sup&gt; 3,4. Nous sommes actuellement à l&#39;optimisation de ces techniques pour la surveillance in vivo de la croissance tumorale primaire et les métastases dans des modèles différents d&#39;ostéosarcome. Certaines de ces techniques peuvent également être utilisées pour l&#39;analyse ex vivo de métastases à côté des méthodes classiques comme qPCR 5, 6 ou FACS différents types de coloration histologique. Comme point de référence, nous avons établi dans la présente étude la transfection stable ou la transduction des cellules tumorales avec le gène lacZ codant pour l&#39;enzyme bactérienne β-galactosidase qui métabolise le substrat chromogène 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bêta-D -galactopyranoside (X-Gal) à un colorant insoluble bleu indigo 7 et permet très sensible et sélective coloration histochimique bleu de cellules tumorales in vivo de souris ex tissu jusqu&#39;au niveau de la cellule unique comme indiqué ici. Il s&#39;agit d&#39;un outil à faible coût et non l&#39;équipement à forte intensité, ce qui permet la validation précise des métastases 8 en études évaluant un nouveauthérapies ticancer 9-11. Un facteur limitant de coloration X-gal est le faible contraste par exemple à du sang liée à une coloration rouge des tissus vascularisés ainsi. Dans le tissu pulmonaire, ce problème peut être résolu par la perfusion pulmonaire in situ, une technique qui a été récemment mis en place par Borsig et al. 12 qui perfuse les poumons de souris sous anesthésie pour les faire disparaître du sang et de fixer et d&#39;intégrer les in-situ sous gonflage à travers la trachée. Cette méthode empêche également l&#39;effondrement du poumon et maintient ainsi la morphologie fonctionnelle des alvéoles pulmonaires, ce qui améliore la qualité du tissu pour analyse histologique. Dans la présente étude, nous décrivons un nouveau protocole, qui tire parti d&#39;une combinaison de coloration X-gal de lacZ cellules tumorales exprimant et in-situ de perfusion et de la fixation du tissu pulmonaire. Ce protocole permet raffiné de haute sensibilité de détection de simples cellules métastatiques dans les poumons et nous a permis dans une étude récente à detect «dormants» micrométastases pulmonaires dans un modèle de 13 souris, qui a été décrit à l&#39;origine comme non métastatique 14.

Le nouveau protocole indiqué dans la présente étude permet une détection sélective des métastases pulmonaires à la résolution cellule unique chez la souris par combiné<em&gt; In situ</emPulmonaire de perfusion&gt; et la coloration de fixation et de X-Gal<em&gt; LacZ</em&gt;-Marqué cellules tumorales.

Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné<em&gt; In situ</emPerfusion&gt; du tissu pulmonaire et coloration X-gal de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tag cellules tumorales

Les métastases constituent la principale cause de décès dans la majorité des types de cancer et représentent, par conséquent, un axe majeur de la recherche sur le cancer. Cependant, la détection de...

L'objectif général de cette procédure est d'améliorer la détection des micro-métastases dans le poumon de souris ex vivo tout en préservant l'architecture des poumons gonflés. Ceci est réalisé en perfusant d'abord le poumon in situ avec du PBS afin d'éliminer le sang, qui constitue la principale source de fond coloré dans ce tissu. Les étapes suivantes consistent à insuffler le poumon par injection de PFA, puis à le pincer pour fixer le tissu pulmonaire sous inflation.Ensuite, le poumon est prélevé et fixé davantage dans du PFA, ou des lobes pulmonaires individuels sont inclus pour la cryoséction. Les étapes finales consistent à colorer les tissus dans une solution Xal et à visualiser les cellules tumorales LA zag ; enfin, les métastases peuvent être détectées au niveau des lobes pulmonaires entiers ou dans des sections de tissu pulmonaire jusqu'au niveau de la cellule unique à l'aide d'un microscope binoculaire ou d'un microscope optique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le sky standing on its own, est que la détection des micro-métastases est considérablement améliorée grâce à l'élimination du bruit de fond lié au sang.Commencez le protocole en anesthésiant une souris par une injection intrapéritonéale de kétamine, de xylazine et d'acépromazine dans environ 150 microlitres de PBS. Lorsque les réflexes douloureux de la souris ne sont plus observés, fixez-la sur la table d'opération. Rabaissez-vous puis lissez le pelage avec de l'éthanol à 70 %.Ouvrir la peau depuis l'abdomen jusqu'au cou. Écarter la peau sur les côtés ou l'ôter. Ouvrir soigneusement le péritoine dans le thorax afin d'éviter la rupture de gros vaisseaux tels que les veines jugulaires.Cela améliorera l'efficacité de la perfusion. Coupez maintenant la veine cave cardiaque sous le foie à l’aide d’une seringue de 20 millilitres munie d’une aiguille de 21 à 24 gauge. Injectez lentement 10 à 15 millilitres de PBS dans le ventricule droit du cœur en activité jusqu’à ce que le poumon devienne complètement blanc et que le cœur cesse de battre.Ensuite, pincer les vaisseaux sanguins au-dessus du foie et du diaphragme à l’aide d’un clamp vasculaire. Remplir une seringue de 10 millilitres avec du paraformaldéhyde à 3 %, puis injecter environ deux millilitres dans le ventricule droit à l’aide d’une aiguille de calibre 21 à 24.Découvrez la trachée en dehors du thorax et insufflez les poumons par une injection dans la trachée de environ trois millilitres d'aldéhyde depuis l'extérieur du thorax. Ensuite, immédiatement après avoir retiré l'aiguille, pincez la trachée au niveau du point de ponction à l'aide d'un clamp vasculaire et attendez 10 minutes pour permettre la fixation. Ensuite, sectionnez les vaisseaux sanguins situés au-dessus du clamp vasculaire.Ensuite, retirez le clamp et injectez environ deux millilitres de PBS dans le ventricule droit afin d'éliminer l'excès de formaldéhyde. Percez avec une aiguille les parties inférieures de tous les lobes pulmonaires et retirez le clamp vasculaire au niveau de la trachée. Injectez maintenant trois à cinq millilitres de solution d'inclusion diluée dans la trachée, en coordonnant cette injection avec la précédente.Arrêtez l'injection lorsque la paraforme cachée dans les lobes pulmonaires est remplacée par la solution. Retirez soigneusement le poumon en tirant sur le cœur à l’aide d’une pince et en sectionnant les ligaments conjonctifs, les vaisseaux sanguins et la trachée. Veillez à maintenir le cœur relié aux poumons.Mettre de côté un lobe pour les coupes cryogéniques et utiliser le tissu pulmonaire restant pour la coloration du poumon entier. Placer le poumon dans un récipient en plastique avec un couvercle hermétique et le fixer avec du formaldéhyde à 2 % dans du PBS. Déposer un morceau de gaze sur le poumon afin de le maintenir dans la solution et laisser reposer à température ambiante pendant 30 minutes.Après une demi-heure, retirez la solution de fixation et lavez soigneusement le tissu avec du PBS trois fois. Préparez fraîchement la solution de Xal prête à l'emploi en diluant un millilitre de solution mère de Xal, une fois sur quarante, dans la solution de coloration de base, puis ajoutez-y au moins 10 millilitres de cette solution. Immergez le poumon avec un morceau de gaze. Fermez le couvercle légèrement afin de permettre les échanges gazeux et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq heures, à l'abri de la lumière.Après l'incubation, retirez la solution de xal. Rincez les poumons une fois avec du PBS pour éliminer la solution de xal résiduelle et ajoutez au moins 10 millilitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS. Le tissu est désormais prêt pour l'histologie et peut être conservé longtemps dans du PFA 4 % à quatre degrés Celsius.Commencez par remplir un tiers d'un moule d'inclusion avec du milieu d'inclusion poly forze non dilué. Ensuite, placez le lobe pulmonaire dans le moule et continuez à ajouter du milieu jusqu'à ce que le lobe soit entièrement recouvert. Évitez soigneusement la formation de bulles d'air, puis incubez le lobe inclus à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.Ensuite, préparez les poumons inclus pour la sectionnement en les congelant lentement dans un mélange de neige carbonique et d'isopentane. Si nécessaire, ils peuvent maintenant être transférés dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pour le stockage. Sur un cryostat, réalisez des coupes cryogéniques de sept à 10 micromètres des lobes et montez les sections sur des lames prêtes pour cryosections disponibles dans le commerce. Une fois montées, incubez immédiatement les sections dans une solution de coloration Xal à 37 degrés Celsius pendant 24 heures dans une chambre humidifiée. Le lendemain, rincez les lames deux fois dans du PBS, cinq minutes par rinçage.Suivez par un bref rinçage à l’eau distillée. Contrecolorez ensuite les lames avec le rouge rapide de noyau pendant 10 secondes afin d’obtenir une faible coloration de contraste qui rend le xal plus dominant, puis rincez immédiatement la coloration de contraste à l’eau distillée. Pour une coloration de contraste plus intense, prolongez le temps jusqu’à 30 secondes ou plus.Montez les lames avec un milieu de montage immuno. La formation de métastases dans les modèles murins OS LM huit a été réexaminée. À l'aide des images représentatives décrites ici, provenant de poumons perfusés et non perfusés de souris ayant reçu simultanément des cellules LM huit transduites laxi et des cellules contrôles non transduites, ainsi que des souris injectées avec des cellules contrôles.Les métastases macroscopiques et microscopiques sont restées indétectables dans les poumons non perfusés et perfusés. Mais de manière intéressante, chez les souris injectées avec des cellules dun LA Z, la coloration xgl a révélé des foyers micrométastatiques bleus composés de cellules isolées ou de petits agrégats cellulaires à la surface des poumons non perfusés. La perfusion in situ et la fixation des poumons améliorent davantage la détection des micrométastases dun la z. Toutefois, aucune évolution en foyers macroscopiques n’a été observée chez les souris injectées avec les cellules témoins LM huit. Des foyers macrométastatiques translucides, à peine détectables et de diamètre supérieur à 0,1 millimètre, ont été identifiés dans les poumons non perfusés. La perfusion du poumon n’a pas amélioré la détection de ces foyers.Cependant, chez les souris injectées avec des cellules LAC Z, de nombreuses métastases macroscopiques bleues au X-gal ont été détectées à la surface des organes non perfusés. Des métastases microscopiques ont également été observées à la surface des organes non perfusés. En outre, la perfusion des poumons a encore amélioré la détection des métastases macroscopiques et microscopiques.Par conséquent, les micro- et macro-métastases sont devenues visibles avec une densité plus élevée et une taille majoritairement plus grande, principalement en raison de la transparence du tissu perfusé, dans lequel des foyers situés sous la surface de l'organe sont également devenus visibles. Une analyse histologique supplémentaire utilisant des sections cryogéniques de tissu pulmonaire a confirmé l'amélioration de la détection des métastases pulmonaires chez les souris injectées avec des cellules LAX Z transduites et des cellules LM huit, ainsi que chez les souris présentant des tumeurs primaires issues de cellules Dun LAX Z. Des micro-métastases ou même des foyers constitués d'une seule cellule ont été identifiés dans les sections pulmonaires.Ceci n'a pas été observé chez les souris présentant des tumeurs primaires issues des cellules témoins respectives. De plus, les métastases macroscopiques étaient également plus nettement visibles chez les souris injectées avec les cellules LM huit LA C que chez les animaux ayant reçu les cellules LM huit témoins. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer la perfusion et la fixation pulmonaires chez la souris ZI deux, ainsi que du marquage immunohistochimique ultérieur des métastases dans les poumons prélevés.Cette technique constitue un indicateur très sensible de la distribution des métastases pulmonaires dans toute étude sur le cancer et peut également servir de référence pour l'amélioration des techniques d'imagerie in vivo actuelles, telles que la micro-TDM, la TEP et l'IRM, utilisées pour la détection précoce des lésions métastatiques.

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Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné In situ du tissu pulmonaire et coloration X-gal de LacZ-Tag cellules tumorales (Vidéo) | JoVE Journal

Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné

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