Haute résolution respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale des cellules bêta intactes en présence de composés naturels

Le but du présent protocole est de mesurer l’effet des changements induite par le glucose de la respiration mitochondriale en présence de composés naturels sur les cellules bêta intact 832/13 à l’aide de respirométrie haute résolution.

L’objectif global de cette approche est d’évaluer directement la fonction respiratoire des cellules bêta pancréatiques, dans des conditions de stimulation de l’insuline. Cela peut également être utilisé pour observer l’effet de différents composés sur la fonction respiratoire des cellules bêta. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie des cellules bêta pancréatiques, par exemple si un certain composé a un impact sur la fonction des cellules bêta pancréatiques via des changements dans la respiration.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour évaluer directement la fonction respiratoire dans les cellules bêta pancréatiques, dans des conditions de stimulation basale et insulinique. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de préparation des cellules et d’utilisation de la machine sont difficiles à apprendre, en raison de la précision requise dans la préparation des cellules et la mesure de la respiration. Pour commencer, cultivez des cellules bêta 832/13 dérivées de l’INS-1 dans du RPMI 1640 supplémenté.

Retirez les cellules d’une fiole T75, en ajoutant deux millilitres de trypsine à 0,25 %, et laissez incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, neutralisez la trypsine en ajoutant huit millilitres de milieu RPMI 1640 complet. Diluez 100 microlitres du volume cellulaire dans 900 microlitres de PBS et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Ensuite, plaquez les cellules à une densité d’un million de cellules par millilitre, dans une boîte de 10 centimètres. Cultivez les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2, avant de commencer les expériences de respiration. Changer le milieu 24 heures après le placage et la culture des cellules 832/13 dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Ensuite, traitez les cellules avec un contrôle de véhicule ou dérivé du cacao, le monomère d’épicatéchine, pour une concentration finale de 100 nanomolaires. S’ensuit l’ajout d’un traitement avec culture pendant 24 heures supplémentaires dans un incubateur humidifié, à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Ensuite, lavez les cellules dans 1 tampon de dosage à faible sécrétion de glucose, ou SAB, pendant cinq minutes.

Aspirez le tampon et incubez les cellules dans 1 SAB à faible teneur en glucose pendant trois heures, en changeant le tampon toutes les heures. Après l’incubation, retirez les cellules de la boîte avec un millilitre de trypsine à 0,25 %. Combinez les cellules de trypsine de la boîte traitée avec le contrôle du véhicule, avec quatre millilitres de SAB dans un tube conique de 15 millilitres.

De même, combinez le plat traité avec le composé d’intérêt, avec un tampon. Diluez 100 microlitres du volume cellulaire dans 900 microlitres de PBS et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Diluez 100 microlitres du volume cellulaire dans 900 microlitres de PBS et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Les données démontrent qu’une concentration d’un million de cellules par millilitre est la plus efficace. Après avoir préparé le respiromètre à haute résolution comme indiqué dans le protocole de texte, ajoutez 2,4 millilitres de 1 tampon SAB à faible teneur en glucose dans chaque chambre d’oxygraphe. Agitez le tampon en continu à l’aide de barres d’agitation magnétiques dans la chambre à 750 tr/min et 37 degrés Celsius, avec un intervalle d’enregistrement des données de 2,0 secondes.

Pour ce faire, sélectionnez le bouton F7 et ouvrez l’onglet Systèmes. Poussez les pistons à fond, puis rétractez-les jusqu’au réglage d’aération de la clé. Laissez la machine s’équilibrer pendant au moins une heure jusqu’à ce qu’un flux d’oxygène stable soit obtenu.

Ensuite, réglez la machine à 37 degrés Celsius pour la durée de l’expérience. Appuyez sur le bouton F7 et ouvrez l’onglet étiqueté Oxygène O2 pour régler la tension de polarisation à 800 millivolts avec un gain de deux. Équilibrez la concentration d’oxygène du tampon SAB pendant au moins 30 minutes, jusqu’à ce que la variation de la concentration d’oxygène soit stable.

Ensuite, sélectionnez une région où le changement de concentration d’oxygène est stable pour établir une mesure d’arrière-plan du changement de concentration d’oxygène, en appuyant sur la touche Maj, en faisant un clic gauche sur la souris et en faisant glisser la souris sur la région sélectionnée. Cliquez sur la lettre associée à la région sélectionnée et changez-la en R1 pour chaque trace correspondant à chacune des deux chambres. Double-cliquez sur la case d’étalonnage O2 dans les coins inférieurs gauche et droit de l’écran.

Cliquez sur le bouton Sélectionner la marque pour l’étalonnage de l’air en tant que R1, puis sélectionnez Calibrer et copier dans le presse-papiers pour les deux chambres. Ensuite, chargez 2,4 millilitres d’échantillon dans chaque chambre, en chargeant une chambre avec les cellules traitées par le véhicule de contrôle et une chambre avec des cellules traitées composées dans 1x SAB à faible teneur en glucose. Enfoncez le piston à fond et aspirez le volume résiduel.

Remuez les cellules en continu tout au long de l’expérience à 750 tr/min et 37 degrés Celsius pour toutes les étapes suivantes. Faites une marque en cliquant sur F4 et en étiquetant la marque en tant que cellules lors du chargement des échantillons. Mesurez les échantillons pendant 30 minutes.

Après la stabilisation du signal, sélectionnez une région du changement de concentration d’oxygène correspondant aux conditions de faible glucose. Ensuite, ajoutez 12,5 microlitres d’une solution de glucose stérile à 45 % dans chaque chambre par l’orifice de chargement en titane à l’aide d’une seringue. Faites une marque étiquetée glucose, lorsque le traitement est ajouté.

Laissez le signal se stabiliser et enregistrer la respiration cellulaire jusqu’à ce qu’un flux d’oxygène stable soit atteint. À ce stade, sélectionnez la région du changement de concentration en oxygène pour représenter la lecture de glucose de 16,7 millimolaires, ce qui correspond à des conditions de stimulation. Une fois la stabilisation du signal atteinte, ajoutez un microlitre de cinq millimolaires d’oligomycine A dans chaque chambre par l’orifice de chargement.

Faites une marque étiquetée, OligoA, lorsque le traitement est ajouté. Laissez le signal se stabiliser et enregistrer la respiration cellulaire jusqu’à ce qu’un flux d’oxygène stable soit atteint. Une fois que le flux d’oxygène stable est atteint, sélectionnez cette zone de la courbe.

L’oligomycine A inhibe l’ATP synthase et donc le seul flux d’oxygène qui se produit est par fuite d’électrons et non par phosphorylation oxydative. Ensuite, ajoutez un FCCP millimolaire par incréments d’un microlitre jusqu’à ce qu’une fréquence respiratoire maximale soit établie. Cela représente une respiration découplée maximale.

Entre trois et quatre microlitres de FCCP, est suffisant pour induire une respiration découplée maximale des cellules bêta 832/13 dérivées de l’INS-1. Faites une marque étiquetée, FCCP lorsque le traitement est ajouté. Laissez le signal se stabiliser et enregistrer la respiration cellulaire jusqu’à ce qu’un flux d’oxygène stable soit atteint.

Sélectionnez ensuite cette zone de la courbe. Le FCCP est un agent de découplage, permettant de mesurer la respiration découplée. Une fois la stabilisation du signal atteinte, ajoutez un microlitre de cinq millimolaires d’antimycine A dans chaque chambre par l’orifice de chargement.

Faites une marque étiquetée AntiA lorsque le traitement est ajouté et répétez la procédure de sélection de courbe. Entrez le nombre de cellules par millilitre utilisées dans le dosage, en appuyant sur le bouton F3 du programme d’analyse du respiromètre. Changez les unités en cellules par millilitre, entrez la concentration cellulaire et changez le milieu en SAB.

Sélectionnez les lectures de fond pour normaliser les données en sélectionnant et en entrant dans le formulaire d’étalonnage de l’oxygène. Faites des sélections de lectures parmi 2,5 millimolaires de glucose, 16,7 millimolaires de glucose, d’oligomycine A, de FCCP et d’antimycine A.Dans le cadre du programme d’analyse du respiromètre, entrez la concentration de protéines et sélectionnez les valeurs moyennes appropriées pour chaque traitement lors de la mesure de la respiration. Ensuite, cliquez sur F2 et cliquez sur la fonction Copier dans le presse-papiers.

Cela permet d’exporter les données pour les utiliser dans d’autres programmes d’analyse. Utilisez les valeurs négatives de la pente O2 pour les calculs. Compiler les données pour trois à cinq séries indépendantes de témoins traités par véhicule et de cellules traitées à des composés naturels afin de déterminer l’effet sur la respiration cellulaire intacte des cellules bêta 832/13 dérivées de l’INS-1.

Les cellules bêta 832/13 dérivées de l’INS-1 intactes présentent une augmentation de l’utilisation de l’oxygène induite par le glucose. Il est essentiel d’utiliser le nombre approprié de cellules. Les résultats recueillis dans cette expérience démontrent qu’un million de cellules par millilitre est la quantité optimale.

cellules bêta 832/13 dérivées de l’INS-1 traitées avec de la curcumine ne montrent aucun changement dans la respiration globale. À l’inverse, les cellules bêta 832/13 dérivées de l’INS-1 traitées avec des épicatéchines de cacao monomères avaient une respiration accrue à 2,5 millimolaires de glucose et 16,7 millimolaires de glucose. Une respiration accrue est également observée pendant l’état de fuite, qui est l’état respiratoire basal non phosphorylant, ainsi que la respiration du système de transport d’électrons ou l’état ETS, qui est la respiration maximale.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer directement la fonction respiratoire des cellules bêta pancréatiques dans des conditions de stimulation de l’insuline. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prétraiter les cellules avec un tampon SAB à faible teneur en glucose et d’obtenir un nombre précis de cellules pour le test.

En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal à obtenir la bonne quantité de cellules pour des mesures efficaces. Avec trop de cellules, le signal est difficile à évaluer et avec trop peu, le signal n’est pas assez élevé pour être mesuré de manière cohérente. Les implications de cette technique s’étendent au traitement ou au diagnostic du diabète et de toute condition affectée par des modifications de la fonction des cellules bêta pancréatiques, car la respiration mitochondriale est un élément essentiel du fonctionnement de la sécrétion d’insuline.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que, quel est l’effet de ces composés sur la sécrétion d’insuline ? Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la fonction des cellules bêta, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que les analyses musculaires, hépatiques, adipeuses et autres analyses respiratoires mitochondriales.