Name: Préparation et respirométrique évaluation des mitochondries isolées de tissu musculaire squelettique Obtenu par biopsie percutanée aiguille (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Découvrez l'évaluation respirométrique de mitochondries isolées à partir de biopsies musculaires squelettiques par aiguille. Cette méthode minimalement invasive permet d'étudier le contrôle respiratoire mitochondrial avec seulement 20 mg de tissu.

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Nous tenons à remercier le Dr Marc Liesa, de la Boston University School of Medicine, pour les discussions utiles, Mme Karin Murphy, Mme Heather Gregory et M. John Stone, tous de la Wake Forest School of Medicine, pour leur aide technique utile dans l’élaboration de ce protocole.

REMARQUE: Le protocole décrit a été approuvé par le Conseil de l&#39;École de médecine de Wake Forest Institutional Review. Le consentement éclairé a été obtenu par écrit. Tous les participants étaient des adultes âgés en bonne santé (65 à 79 ans) des deux sexes, ayant un IMC allant de 23 à 35. 1. Skeletal Muscle biopsie <ol><li> Comme décrit précédemment, neuf effectuer toutes les biopsies en début de matinée après une O / N rapide. Demandez aux sujets de se abstenir de prendre de l&#39;aspirine, de prescription et over-the-counter médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens, ou d&#39;autres composés qui peuvent affecter des saignements, des plaquettes, ou des ecchymoses pour la semaine avant la biopsie. Demandez aux participants de se abstenir également de toute activité physique intense pendant au moins 36 heures avant la biopsie. REMARQUE: Muscle est obtenu à partir du vaste externe en utilisant la technique aiguille de biopsie percutanée avec une aiguille percutanée sous anesthésie locale avec 1% de lidocaïne. Pas de complications médicales ou other signalé les effets indésirables de la procédure ont eu lieu dans notre unité de recherche clinique. </li><li> NOTE: La procédure de biopsie décrite est adaptée de celle de 10 Bergstrom. <ol><li> Brièvement, administrer localement une prise% de lidocaïne soin de ne pas se infiltrer dans le muscle. Suivez ce avec une période d&#39;attente de 10 min pour permettre engourdissement suffisante. </li><li> Prenez les biopsies du ventre du muscle (la région centrale du muscle entre l&#39;insertion et de l&#39;origine) en évitant les zones sous-aponévrotique et myotendonous. <ol><li> Utilisez percutanée à l&#39;aiguille (un appareil réutilisable d&#39;aspiration assistée avec un côté fenêtre et cylindre de coupe intérieure de coupe) et de suivre un aponévrotique «pop» ou la résistance de l&#39;aponévrose comme un guide. </li><li> Estimer la profondeur avec l&#39;aiguille d&#39;anesthésie, puis de nouveau sentir avec la lame de bistouri étroit et faire une incision de 4-5 mm à travers le fascia. Avancer l&#39;aiguille à travers l&#39;incision jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit insérée dans le muscle. </li><li> Recueillirplusieurs échantillons avec la fenêtre tournés dans des directions différentes. Appliquer une aspiration continue à l&#39;aide d&#39;une seringue de 60 cc en avançant et en retirant des échantillons de muscles dans l&#39;aiguille percutanée deux à quatre fois dans des directions différentes. Cesser d&#39;aspiration et de retirer l&#39;aiguille. NOTE: Chaque passage (insertion et le retrait de l&#39;aiguille) devraient prendre moins d&#39;une minute. </li><li> Demander à un assistant applique une pression ferme pour percer site pour 5 min à établir l&#39;hémostase. Débranchez aiguille du tuyau d&#39;aspiration et enlever soigneusement échantillons de muscles de la fenêtre et le baril. </li></ol></li><li> Faire une deuxième passe si plus de muscle est nécessaire en répétant la procédure ci-dessus. </li><li> Retirez les caillots de sang de l&#39;échantillon musculaire en utilisant une pince, peser l&#39;échantillon, et le placer immédiatement dans un tube contenant du DPBS glacées. NOTE: Le rendement moyen en utilisant cette méthodologie est de 150 ± 20 mg. </li></ol></li></ol> 2. Isolement mitochondriale &lt;ol&gt; <li> Fraîchement préparer le Chappel-Perry (CP) et mitochondrial Dosage Solution (MAS) tampons (tableau 1) le jour de l&#39;expérience, ou aliquote et de les stocker à -20 ° C. Préparer les composés dans du diméthylsulfoxyde à une concentration de 2,5 mM et aliquote et stocker à -20 ° C. Utilisez les aliquotes de tampon et de composés stockées à -20 ° C dans les 2 mois à partir du jour de préparation. </li><li> Retirer le tissu conjonctif visible de l&#39;échantillon en utilisant ciseaux et des pinces acérées; si nécessaire l&#39;utilisation d&#39;un microscope binoculaire pour cette étape. Laver soigneusement les spécimens 3-4 fois avec un tampon de DPBS glacé pour éliminer le sang. Gardez les échantillons sur DPBS et processus glacés dès que possible, en prenant soin de ne pas dépasser plus de 45 min de biopsie. Prenez des précautions pour retirer soigneusement tous les tendons ou les tissus adipeux de l&#39;échantillon de muscle. </li><li> Hacher immédiatement le tissu musculaire en petits morceaux à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux stériles et de suspendre dans 500 pi à 1 ml contenant IPC proteinase (Nagarse) à une concentration de 0,2 mg / g de tissu. Suivez ce avec une incubation de 5 min à température ambiante, puis les transférer à la glace. </li><li> Homogénéiser les tissus hachés traités avec l&#39;aide d&#39;un homogénéisateur Nagarse automatisé. Conserver l&#39;échantillon sur la glace tout au long de ce processus. Homogénéiser chaque échantillon de tissu à quatre reprises, chaque fois pour une impulsion de 2 secondes, aide de l&#39;homogénéisateur automatisé à un réglage de vitesse de 10 000 tours par minute. Laver la sonde avec de l&#39;éthanol à 70% puis à l&#39;eau distillée entre les tissus. </li><li> Laver le tissu homogénéisé avec un volume égal de CP I (500 ul à 1 ml) et 2x volume de CP II (1 ml à 2 ml), et de recueillir le contenu dans un tube de centrifugation et centrifuger à 600 xg, 4 ° C pendant 10 min. Passez le surnageant à travers une étamine mouillée, recueillir le filtrat et jeter le culot, éliminant ainsi la majorité des fractions non-mitochondriales. </li></ol> 3. laver les mitochondries <ol><li> Centrifuger le surnageant provenant de l&#39;étape ci-dessus à 10,000 xg, 4 ° C pendant 10 min. Suspendre le culot dans 4 ml de CP II tampon et encore centrifuger à 10 000 xg, 4 ° C pendant 10 min. NOTE: En de rares occasions, une fine pastille de sang est formée en dessous le culot mitochondrial. Dans ce cas, retirez le culot de mitochondries par aspiration douce avec un tampon de CPII. Cette étape peut être évité en lavant soigneusement le sang à l&#39;étape 2. </li><li> Suspendre le culot obtenu à 2 ml de tampon CP I. A ce stade, utiliser une petite aliquote de cette suspension pour l&#39;estimation de la protéine. Reprendre l&#39;échantillon restant dans CP I tampon et centrifuger comme décrit. Suspendre le culot final dans une quantité minimale (200 pi) de mitochondrial Assay Solution (MAS). REMARQUE: Les protéines sont dosés à ce stade car tampon CP I n&#39;a pas BSA, alors que MAS dans laquelle les échantillons seront suspendus tard ne avoir BSA en elle. </li></ol> 4. Estimation du contenu mitochondrial par mesure Concentration en protéines aide d&#39;un kit de dosage de protéines BCA <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTE: Utilisez cette concentration pour calculer la quantité de mitochondries utilisés pour le chargement sur une microplaque de 24 puits pour les mesures respirométriques, ou pour des expériences de Western blot. Prendre en compte le facteur de dilution (10) pour le calcul de la concentration en protéines. 5. Effectuer les tests XF comme décrit par Rogers, GW, et al. 12 REMARQUE: Visualiser le taux de consommation d&#39;O 2 (OCR) en O 2 pmoles / min, ou les niveaux absolus de O 2 et un pH dans la sortie de données. <ol><li> Utilisez 1x MAS pour préparer des composés à injecter. Ajouter une concentration 10X des composés aux ports AD pour donner une concentration finale comme suit: Port A, ADP [Adénosine 5 &#39;-diphosphate, 2 mM, 50 ul]; le port B, oligomycine (2 uM, 55 ul); le port C, FCCP [carbonyl cyanure 4- (trifluorométhoxy) phénylhydrazone, 6 pm, 60 pi]; et le port D, 2 uM antimycine-A (65 pi). Préparerun volume suffisant de composés pour le nombre requis de puits. </li><li> Déterminer la quantité optimale de mitochondries par titrage. Par exemple, charge 1,0 ug, 2,5 ug, 5,0 ug et de la mitochondrie par puits dans un volume de 50 ul de 1 x glacées contenant MAS substrat. Pour minimiser la variabilité entre les puits, d&#39;abord dilué 10x mitochondries dans le substrat 1x MAS + froid. Ensuite, 50 ul de fournir cette suspension dans chaque puits (à l&#39;exception des puits de correction d&#39;arrière-plan). </li><li> Centrifuger la plaque à 2000 xg, 20 min à 4 ° C. Après centrifugation, ajouter doucement 450 ul de 1 x MAS succinate + (10 mM) et la roténone (2 pM) (conditions initiales, voir ci-dessous) à chaque puits. Voir les mitochondries sous le microscope pour assurer le respect homogène pour le bien avant de transférer la plaque à l&#39;analyseur XF. REMARQUE: Les conditions initiales utilisées dépendra de savoir si la respiration est entraîné soit par ETC I ou II du complexe complexe. Pour la respiration complexe entraîné II, utilisez succinate (10 mM) et la roténone (2 uM) en tant que conditions initiales. blocs de roténone I et succinate complexe fournit le carburant pour les complexes II (succinate déshydrogénase). Pour étudier la respiration entraînée par complexe I, appliquez une pyruvate et malate, chacun à une concentration finale de 5 mM de glutamate ou malate et chacun à une concentration finale de 10 mM en tant que conditions initiales. Celui-ci peut aider à distinguer entre la dysfonction cycle de Krebs et de transport de substrat. Pour étudier la respiration entraînée par deux I et II du complexe complexe, notamment pyruvate et succinate sans roténone ou malate comme conditions initiales. Utilisation palmitoyl carnitine en tant que substrat pour β-oxydation. </li><li> Mesurer séquentiellement la respiration mitochondriale en temps réel en utilisant le respiromètre par elle programmation comme décrit précédemment 12. Utilisez les paramètres pour le respiromètre fourni dans le tableau 2. REMARQUE: Une brève explication des différents états de la respiration mitochondriale sont comme suit: </li><li&gt; État 2 = état couplé avec le substrat présente; 3 = Etat de phosphorylation respiration en présence de saturer ADP; Etat 4 o = non-phosphorylation induite par la respiration oligomycine; 3u État = maximale respiration découplé stimulé par le FCCP découplant; Résiduelle non mitochondrial respiration = respiration après complexe III inhibition par antimycine-A. Il convient également de rappeler que, la longueur de la mesure OCR en combinaison avec la concentration mitochondrial pourrait influencer les données en épuisant l&#39;oxygène au cours des périodes de mesure. </li></ol> 6. Western Blot NOTE: Déterminer le marqueur mitochondrial COX IV et GAPDH de tissu entier par Western blot pour assurer l&#39;enrichissement des mitochondries dans l&#39;échantillon final <ol><li> Séparez les mitochondries isolées et l&#39;extrait de tissu entier de 12% dodécyle sulfate de sodium gels de polyacrylamide. </li><li> Transférer les protéines sur un polyfluorure de vinylidène (PVDF).</li><li> Incuber avec l&#39;anticorps COX IV (1: 20.000), suivi par la peroxydase de raifort (HRP) conjugué à des anticorps secondaires. Pour la détermination de GAPDH, dépouiller la tache et la sonde avec un anticorps monoclonal GAPDH (1: 2000). NOTE: Si les différences dans la contamination de l&#39;ER sont préoccupantes, notamment marqueurs ER tels que ERp72, calnexine ou la calréticuline dans l&#39;analyse. </li></ol>

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</ol>

L’auteur, George Rogers, est un employé de Seahorse Bioscience qui produit l’instrument utilisé dans cet article. Les frais d’accès ouvert ont été pris en charge par Seahorse Biosciences.

Mitochondries isolées sont souvent utilisés dans les études qui examinent le rôle de la fonction ETC, ainsi que d&#39;autres activités mitochondriales, y compris le transport de substrat et la fonction du cycle TCA. Dosages respirométriques utilisant organites isolés permettent examen direct des processus fondamentaux de la phosphorylation oxydative et les propriétés intrinsèques de la ETC. Respirométrique profilage des mitochondries isolées par rapport aux cellules entières ou fibres musculaires perméabilisées a les avantages de relativement facile l&#39;interprétation des données et l&#39;absence d &#39;&quot;ingérence&quot; de processus non mitochondriaux ou des changements de masse mitochondriale / biogenèse. Normalisation des données est basée sur la teneur en protéine mitochondriale, permettant ainsi simple comparaison croisée des mitochondries entre les échantillons. Respirométrique profilage des mitochondries isolées est une approche privilégiée lorsque le but de l&#39;étude est de déterminer les mécanismes sous-jacents et identifier des cibles spécifiques tels que composante de ETCs / complexes, ou des mécanismes de transport mitochondriales. L&#39;invention concerne un protocole de biopsie musculaire et l&#39;isolement des mitochondries fonctionnelles à partir de petits échantillons de tissu. Cette méthode donne des résultats reproductibles entre les utilisateurs en raison de l&#39;utilisation d&#39;un homogénéisateur automatisé par rapport à main homogénéisateurs de Dounce. Isolement des mitochondries peut être effectuée avec aussi peu que 20 mg de tissu musculaire. La quantité de mitochondries isolées qui peut être obtenu à partir de cette taille d&#39;échantillon est suffisant pour exécuter Seahorse respirométrie base plaque tout en laissant mitochondries excédentaires à d&#39;autres expériences et de stockage pour d&#39;autres analyses moléculaires. On peut noter que cette méthode peut être traduit à la XF 96, où même de petites quantités de mitochondries peuvent être utilisés (1-2 ug par puits). Plusieurs protocoles d&#39;isolement pour les mitochondries se appuient sur homogénéisateurs de Dounce pour la perturbation initiale du tissu. Un inconvénient de cette méthode est la pratique de la nature du tissu initialhomogénéisation. La force et la vitesse du pilon dans le homogénéisateur peuvent varier considérablement entre les opérateurs 6. Ceci peut entraîner des variations expérience à l&#39;expérience, ainsi que la variation laboratoire à laboratoire, et conduit à des difficultés dans la comparaison des données entre les expériences. Ce est particulièrement préoccupante dans les études d&#39;intervention humaine lorsque les données des participants sont collectées à des moments distincts, généralement avant et après traitement, et potentiellement à des sites multiples. Nous utilisons un homogénéisateur automatisé pour une approche plus cohérente qui donne des résultats plus reproductibles avec une variation limitée de personne à personne. La vitesse de préparation rend également cette approche appropriée pour le traitement de plusieurs échantillons en même temps. En général, un maximum de trois expériences peuvent être effectuées en une seule journée. Limitations potentielles de la technique décrite ici résultent de l&#39;utilisation des organites isolés et l&#39;utilisation d&#39;un format à base de plaque. Par exemple, Picard et al. ont démontré que les mitochondries isolées possèdent des caractéristiques fonctionnelles qui diffèrent fondamentalement de celles des mitochondries intactes dans myofibres perméabilisées. Ils ont proposé que les techniques d&#39;isolement mitochondriales résultent en fonction bioénergétique altérée, comme l&#39;augmentation significative par rapport à RCR myofibres perméabilisées accompagnés de plus d&#39;oxygène production d&#39;espèces réactives 13. Par rapport aux fibres musculaires perméabilisées, l&#39;isolement des mitochondries ne nécessite plus de temps de préparation. En outre, la perte de la teneur cellulaire diminue pertinence physiologique, ce qui est retenu dans des cellules entières perméabilisées même et les fibres. L&#39;utilisation de respirométrie base plaque avec les permis de répliquer pistes technique décrite par échantillon. Cependant, les mitochondries doivent adhérer au fond de chaque puits. Cette configuration est différente de leur environnement normal et peut affecter les caractéristiques fonctionnelles. En outre, il convient de noter que l&#39;utilisation de ce protocole pour l&#39;isolement des mitochondries, there peut encore être contamination de réticulum endoplasmique (RE) dans la préparation mitochondriale. Les différences dans la contamination de ER peuvent affecter la détermination du rendement et d&#39;influencer les résultats mitochondriales. En conclusion, cette étude présente des données qui confirment que les mitochondries isolées à partir de tissus en utilisant cette procédure sont fonctionnellement actifs et peuvent être utilisés pour des études / applications qui nécessitent une haute qualité à partir de mitochondries isolées quantité minimale d&#39;échantillons de muscles squelettiques. L&#39;avantage de cette méthode est que: i) il est possible d&#39;isoler les mitochondries à partir de quantités minimales de muscle squelettique, ii) la procédure est rapide, iii) avec la technologie de plaque sur la base, il est possible d&#39;exécuter plusieurs échantillons en même temps, et iv) il ya assez de tissu excédentaire et les mitochondries isolées après l&#39;analyse bioénergétique pour le stockage de l&#39;échantillon et d&#39;autres enquêtes de biologie moléculaire.

Les mitochondries sont les sites de production d&#39;énergie primaire dans la cellule et ont un rôle important dans le vieillissement ainsi que divers troubles liés à l&#39;âge comme les maladies cardiovasculaires, la maladie d&#39;Alzheimer, le diabète, le cancer et l&#39;obésité. Respirométrique profilage des mitochondries isolées fournit une analyse directe de la fonction de la chaîne de transport d&#39;électrons (ETC) et a contribué de manière significative à notre compréhension de la biologie mitochondriale et son rôle dans la santé et la maladie. Mitochondries isolées sont utilisées pour étudier divers aspects de la bioénergétique comme, transport de substrat, l&#39;activité de l&#39;ATP synthase, fuite de protons, etc. La méthodologie décrite dans ce manuscrit a été optimisé pour permettre une analyse respirométrique des mitochondries isolées de biopsies de tissus du muscle squelettique obtenus à partir de sujets humains. Le protocole de biopsie décrit dans ce manuscrit a été utilisé par notre personnel pour les 12 dernières années. Notre groupe a effectué plus de 700 procédures sur les adultes de différents âges,jusqu&#39;à 90 ans, et avec diverses maladies chroniques sans aucun problème de sécurité défavorables. Un aspect clé de ce protocole est qu&#39;il est spécifiquement conçu pour utiliser des quantités minimes de tissu, ce qui facilite son utilisation dans les études de recherche clinique. Divers protocoles ont été développés pour isoler les mitochondries. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 décrit un procédé pour isoler les mitochondries à partir de différents tissus de rat ainsi que des cellules en culture. Garcia-Cazarin et al. 3 ont fait état ​​d&#39;une méthode pour isoler les mitochondries à partir de muscles squelettiques de rat et la souris. Procédé pour isoler les mitochondries à partir de cerveau de rat a également été rapporté par Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al. Ont rapporté 5 un procédé pour isoler les mitochondries à l&#39;aide du barocycler et / ou le destructeur de PCT. Récemment, Franko et al. 6 rapporté un procédé pour isoler les mitochondries fortement enrichis utilisant des anticorps anti-TOM22 Billes magnétiques. Bien que ces protocoles donnent d&#39;excellents résultats, les exigences de taille de tissu sont élevées par rapport à la méthode décrite dans ce manuscrit. Par exemple, Gross et al., 5 g de 01/05 à 01/08 utilisé le muscle gastrocnémien, et environ 2 g de tissu rénal. De même, Franco et al. 6 utilisé 500 mg de tissu de foie de souris. D&#39;après notre expérience, les rendements typiques à attendre de la biopsie percutanée du muscle squelettique (vaste externe) vont de 100 à 200 mg. La capacité à évaluer la fonction mitochondriale dans 20-50 mg de tissu musculaire en utilisant le protocole décrit ici permet aux utilisateurs d&#39;effectuer des évaluations multiples par biopsie et à conserver les échantillons pour une utilisation future dans d&#39;autres expériences de biologie moléculaire. Ce est une caractéristique essentielle dans la recherche clinique et d&#39;autres études qui nécessitent l&#39;utilisation diligente des échantillons. Il convient de noter que les mitochondries préalablement congelés ne sont pas bonnes pour l&#39;étude de la respiration couplé en raison de outEr dommages de la membrane mitochondriale et la perte de l&#39;activité du cytochrome C. Notre méthode a été adaptée et modifiée de la méthode publiée par Chappell et Perry 7. En utilisant les méthodes décrites dans ce manuscrit, nous avons récemment rapporté que le profil respirométrique des mitochondries isolées à partir Vastus humaine lateralis est directement corrélée avec la capacité physique, mesurée comme la vitesse de marche 8.

<table><tbody><tr><td>Equipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur Bio-Gen PRO200</td><td>BioExpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R Fisher Scientific</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deepwell late Rotor&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mm University College Hospital Needle</td><td>Cadence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc seringue</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques à 96 puits</td><td>Tecan (Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyseur Seahorse XF 24-3</td><td>Seahorse Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de gel protéique</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak Gel Logic 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ensemble appareil photo Kodak</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF24 V7 Microplaque de culture cellulaire et cartouche de capteur XF24</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>Acros</td><td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate salin tamponné Dulbecco’s&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Sans acides gras BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase bactérienne</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Magnésium chlorure (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit de dosage des protéines</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>Acide succinique*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Acide pyruvique*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Acide malique*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP(K+ sel)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF Cell mito test kit</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&nbsp ;</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 12 % Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membranes de transfert d’immobiline (0,45 um)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de transfert NuPAGE (20X)-1 litre</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaires (mAB à VDAC1/Porin)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaires (mAB à GAPDH)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-souris (chèvre),</td><td>PerkinElmer</td> marqué HRP <td>NEF822E001EA</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin (chèvre),</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF812E001EA</td><td></td></tr><tr><td>*L’ADP, l’acide succinique, l’acide pyruvique et l’acide malique doivent être ajustés à un pH de 7,4 avec du KOH uniquement.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

préparation et respirométrique évaluation des mitochondries isolées de tissu musculaire squelettique obtenu par biopsie percutanée aiguille

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirométrique profilage des mitochondries isolées est couramment utilisé pour étudier la fonction électronique de la chaîne de transport. Nous décrivons une méthode pour obtenir des échantillons de vaste externe humaines, isoler les mitochondries des quantités minimes de tissu musculaire squelettique, et la plaque profilage respirométrique base en utilisant un flux extracellulaire (XF) analyseur. Comparaison des profils respirométriques obtenus en utilisant 1,0, 2,5 et 5,0 pg de mitochondries indiquent que 1,0 ug est suffisant pour mesurer la respiration et que 5,0 ug fournit des résultats plus constants sur la base de la comparaison des erreurs standard. Analyse par Western blot des mitochondries isolées pour le marqueur mitochondrial COX IV et non mitochondrial marqueur de tissu GAPDH indiquer qu&#39;il ya contamination non limitée mitochondriale utilisant ce protocole. La possibilité d&#39;étudier respirométrie mitochondrial en aussi peu que 20 mg de tissu musculaire permet aux utilisateurs d&#39;utiliser biopsies individuels pour plusieurs paramètres de l&#39;étude en cliniqueprojets de recherche.

La figure 1 représente un organigramme détaillé de l&#39;ensemble du protocole. Des profils de transfert de Western de la COX IV / GAPDH (Figure 2) représentent l&#39;expression de la protéine mitochondriale, COX IV, et le marqueur non mitochondrial, GAPDH. L&#39;expression de la COX IV et GAPDH sont évidentes dans l&#39;ensemble du lysat de muscle. Après mitochondries sont isolées en utilisant la technique décrite dans ce protocole, des bandes COX IV sont encore visibles tout GAPDH est absent à la même exposition. Des expositions plus longues peuvent révéler une bande de GAPDH faible. Ces empreintes indiquent que les mitochondries isolées ont contamination non mitochondrial minime. En outre, l&#39;expression de la COX IV dans les mitochondries isolées est compatible entre les échantillons. La figure 3 montre les profils typiques respirométriques entraînés par le complexe II (succinate et la roténone) en utilisant 1,0 ug, 2,5 pg et 5,0 pg de mitochondries. Comme prévu, l&#39;ensemble OCR est augmentée wvec des montants plus élevés de mitochondries. Le rapport de contrôle respiratoire calculée (RCR) pour ce dosage est 7,95, ce qui indique que la préparation mitochondriale est de haute qualité. En outre, l&#39;état 3U OCR est légèrement supérieur à celui de l&#39;Etat 3, confirmant la qualité mitochondrial. Afin de comparer l&#39;uniformité des résultats lors du profilage des quantités différentes de mitochondries, nous avons effectué ANOVA (analyse de variance) et calculé la somme des carrés (SS) en tant que valeurs réelles de la variance en utilisant 1,0 ug, 2,5 ug, 5,0 ug et chargés par des mitochondries ainsi (Figure 4). SS est présenté pour l&#39;état 2, 3 état, état 3U, antimycine A et RCR. Pour l&#39;état 2 et l&#39;état trois mesures, une ANOVA était statistiquement significative (p &lt;0,01 et p &lt;0,05, respectivement). De même, une ANOVA était statistiquement significatif pour antimycine et RCR (p &lt;0,01 et p &lt;0,0001 respectivement. Aucune différence significative n&#39;a été observée pour l&#39;état 3U entre les groupes. ThCes ré- sultats montrent que 5,0 ug par puits des mitochondries a donné le SS bas par rapport à d&#39;autres concentrations et est la quantité optimale à utiliser dans le système 24 XF avec notre population de participants. La figure 5 sert de guide pour indiquer la quantité de protéines mitochondriales peut se attendre sur la base de la taille initiale de l&#39;échantillon de muscle. Comme on s&#39;y attendait, il existe une forte corrélation entre la quantité de muscle (mg) traitées et la teneur totale en protéines mitochondriales (mg) de l&#39;échantillon final. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Tampon Chappel-Perry I (IPC) </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mM </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Tampon Chappel-Perry II (CPII) </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Acides gras libres BSA </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitochondrial Assay Solution (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 35 mM </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> 110 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1,0 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Acides gras libres BSA </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitochondrial Assay Solution (MAS) avec complexes II conditions initiales </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Roténone </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitochondrial Assay Solution (MAS) avec complexes I conditions initiales </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvate</td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Malate </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Tous les tampons à effectuer dans l&#39;eau déminéralisée </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Solution Recettes tampons. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Étapes de protocole </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> Commandement </td><td> Temps (min) </td><td> Port </td></tr><tr><td> Étalonner </td><td> 0,00 </td><td></td></tr><tr><td> Attendez </td><td> 10,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1,00 </td><td></td></tr><tr><td> Attendez </td><td> 3,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1,00 </td><td></td></tr><tr><td> Attendez </td><td> 3,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 0,50 </td><td></td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 3,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 3,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 0,50 </td><td></td></tr><tr><td> Injecter </td><td></td><td> Un </td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 6,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1,00 </td><td></td></tr><tr><td> Injecter </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 3,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1,00 </td><td></td></tr><tr><td> Injecter </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1,00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> Mesure </td><td> 3,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1,00 </td><td></td></tr><tr><td> Injecter </td><td></td><td> Ré </td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 3,00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Mix, mesurer et mélanger réglage de cycle pour le respiromètre. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> Figure 1. Organigramme de l&#39;ensemble du protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Un Western blot représentatif de tissu musculaire squelettique ensemble ainsi que mitochondries isolées. Extrait de tissu entier ainsi que mitochondries isolées ont été immuno- empreinte avec COX IV anticorps comme marqueur mitochondrial et l&#39;anticorps GAPDH pour le contrôle non-mitochondriale. Aucune bande de GAPDH a été observée dans les mitochondries isolées indiquant peu ou pas de contamination à partir de sources non-mitochondriales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> Figure 3. Profil respirométrique Représentant des mitochondries isolées à partir Vastus humaine lateralis. Trois concentrations de mitochondries isolées, 5,0 ug, 2,5 pg et 1,0 ug nous<html> re utilisé dans cet essai. Les concentrations finales des composés après injections portuaires étaient 2 mM ADP (port A); 2 uM oligomycine (port B); 6 uM FCCP (port C); et 2 uM antimycine A (port D). RCR calculée pour cette course était 7,95. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> Figure 4. Somme des carrés. Somme des carrés pour les différents états de la respiration mitochondriale et RCR en utilisant 5,0 pg, 2,5 pg et 1,0 ug mitochondries. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; Figure 5. Ceci peut être utilisé comme un guide pour estimer la quantité de protéine mitochondriale qui peut être attendu sur la base de l&#39;analyse initiale échantillon muscle poids de régression:. De quantité de muscle (mg) et le rendement en protéine mitochondriale totale (mg). Comme prévu, il ya une corrélation positive directe entre la quantité de muscle et la protéine mitochondriale total obtenu.

Méthodes pour la biopsie du vaste externe, préparation de mitochondries purifiées, et le profilage respirométrique sont décrits. L&#39;utilisation de petit volume musculaire rend cette technique convient pour des applications de recherche clinique.

Préparation et respirométrique évaluation des mitochondries isolées de tissu musculaire squelettique Obtenu par biopsie percutanée aiguille

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

L'objectif général de cette procédure est d'examiner le contrôle respiratoire dans les mitochondries isolées à partir de tissu musculaire squelettique obtenu par biopsie. Cette analyse est réalisée en prélevant d'abord une petite quantité de muscle par biopsie percutanée à l'aide d'une aiguille. La deuxième étape consiste à isoler les mitochondries du muscle biopsié par homogénéisation.Ensuite, les mitochondries isolées sont lavées et séparées des fractions non mitochondriales par centrifugation et en faisant passer l'échantillon à travers un tamis en mousseline. La dernière étape consiste à déposer les mitochondries isolées afin d'effectuer une analyse respirométrique par des tests de flux extracellulaire pour visualiser le taux de consommation d'oxygène. Enfin, l'analyseur de flux extracellulaire Seahorse est utilisé pour examiner le contrôle respiratoire dans les mitochondries isolées.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans le fait qu'elle nécessite une quantité minimale de tissu musculaire, aussi faible que 20 milligrammes, et limite la variabilité entre les expériences. Ces caractéristiques rendent cette technique adaptée aux applications en recherche clinique. Les implications de cette technique concernent le diagnostic du dysfonctionnement mitochondrial chez les patients.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la biopsie musculaire et l'isolement des mitochondries exigent des manipulations précises qui sont mieux illustrées visuellement plutôt que décrites uniquement par un texte. Pour réaliser la biopsie sur place, administrer de la lidocaïne à 1 %, en prenant soin de ne pas infiltrer le muscle. Attendre ensuite pendant 10 minutes.Pour permettre une anesthésie suffisante, prélevez les biopsies à partir de la région médiane du muscle située entre l'insertion et l'origine, en évitant les zones sous-fasciales et myotendineuses. Pour ce faire, utilisez d'abord une aiguille percutanée et suivez le « déclic » fascial ou la résistance de la fascia comme guide. Estimez la profondeur à l’aide de l’aiguille d’anesthésie, puis percez-la avec la lame fine du scalpel et réalisez une incision de quatre à cinq millimètres à travers la fascia.Avancer l’aiguille à travers l’incision jusqu’à ce qu’elle pénètre dans le muscle. Prélever plusieurs échantillons en orientant la fenêtre vers différentes directions. Appliquer une aspiration continue à l’aide d’une seringue de 60 centimètres cubes tout en faisant avancer et retirer les échantillons musculaires dans l’aiguille percutanée deux à quatre fois, selon différentes directions.Arrêtez l'aspiration et retirez l'aiguille. Demandez à un assistant d'appliquer une pression ferme sur le site de ponction pendant cinq minutes. Pour obtenir l'hémostase, déconnectez l'aiguille du tube d'aspiration et retirez soigneusement les échantillons musculaires de la fenêtre et du corps de la seringue.Effectuez un deuxième passage si davantage de muscle est nécessaire en répétant cette procédure. Retirez tous les caillots sanguins visibles de l'échantillon musculaire à l'aide de pinces. Pesez ensuite l'échantillon et placez-le immédiatement dans un tube contenant de la glace.Phosphate tamponné ECCOs froid ou DPBS. Retirer soigneusement les tissus conjonctifs visibles de l'échantillon à l'aide de ciseaux pointus et de pinces. Laver les spécimens trois à quatre fois avec du tampon DPBS glacé.Pour éliminer le sang, maintenez les échantillons dans du DPBS glacé et traitez-les dès que possible. Dans les 45 minutes suivant la biopsie, prenez des précautions pour retirer soigneusement les tendons ou les tissus adipeux du prélèvement musculaire. Retirez une petite portion de tout tissu excédentaire pour la conserver à moins 80 degrés Celsius.Ceci peut être utilisé pour d'autres expériences telles que les immunotransferts. Hacher immédiatement le tissu musculaire en petits morceaux. À l'aide d'une paire de ciseaux stériles, puis suspendre dans 500 microlitres à un millilitre d'un inhibiteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine de type Sistine, tel que des nagars dissous dans un tampon CP1 à une concentration de 0,2 milligramme par gramme de tissu.Hachez l'échantillon jusqu'à ce qu'il apparaisse bien en suspension. Incubez pendant cinq minutes à température ambiante avant de transférer sur glace, en veillant à ce que l'homogénéisateur soit soigneusement rincé auparavant. Homogénéisez le tissu haché traité avec des nagars.À l'aide d'un homogénéisateur automatique. Gardez l'échantillon sur de la glace tout au long de ce processus. Homogénéisez chaque échantillon de tissu quatre fois, avec une impulsion de deux secondes à chaque fois.À l’aide de l’homogénéisateur automatique réglé sur une vitesse de 10 000 tr/min, placez à nouveau l’échantillon sur de la glace. Lavez la sonde avec de l’éthanol à 70 %, puis avec de l’eau distillée entre chaque tissu. Lavez maintenant le tissu homogénéisé avec un volume équivalent de tampon chapel Perry un ou CP un.Ensuite, lavez le tissu avec un volume double de tampon CP deux. Ajoutez le tube d'équilibrage en complétant avec de l'eau jusqu'au même volume dans un autre tube conique. Recueillez le contenu dans un tube de centrifugeuse et centrifugez à 600 ×g et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Humidifiez préalablement le torchon en mousseline afin que toutes les particules le traversent sans rester piégées dans le tissu.Faites passer le surnageant à travers une gaze pliée, en recueillant le filtrat et en éliminant le culot, éliminant ainsi la majeure partie des fractions non mitochondriales. Ensuite, effectuez une ultracentrifugation du surnageant à 10 000 ×g à 4 °C pendant 10 minutes. Resuspendez le culot dans quatre millilitres de tampon CP2 avant de centrifuger une deuxième fois de la même manière après la centrifugation.Jetez le surnageant et resuspendez le culot dans deux millilitres de tampon CP1. À ce stade, placez une petite aliquote de cette suspension dans un tube à essai séparé destiné à l'estimation des protéines. Resuspendez l'échantillon restant dans du tampon CP1 et centrifugez.Comme précédemment, notez que la plaque protéique doit être préparée avec les étalons lors des premières étapes de centrifugation. Enfin, reprendre le culot final dans un volume minimal de solution d'essai mitochondrial ou de masse. Réaliser des essais XF afin de visualiser le taux de consommation d'oxygène, ou OCR, en pico-moles d'oxygène par minute ou en niveaux absolus d'oxygène et de pH.Dans la sortie des données. Ajoutez une concentration 10 x des composés dans une masse X aux ports A à D du respiromètre à plaque afin d'obtenir une concentration finale indiquée dans le protocole écrit. Préparez un volume suffisant de composés pour le nombre requis de puits.Utilisez les calculs protéiques mesurés précédemment pour déterminer les concentrations de mitochondries à ajouter. Déterminez la quantité optimale de mitochondries en titrant un microgramme, 2,5 microgrammes et cinq microgrammes de mitochondries par puits. De la plaque à 24 puits afin de minimiser la variabilité entre les puits.Diluez d'abord 10 fois les mitochondries dans du milieu froid, une fois la masse plus substrat. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de cette suspension dans chaque puits. Laissez quatre puits contenant uniquement 50 microlitres de milieu à utiliser comme lectures de fond.Placez la plaque d'étalonnage préalablement hydratée ainsi que la cartouche supérieure utilisée précédemment dans le respiromètre pour effectuer l'étalonnage de l'appareil. Avant de procéder à l'essai avec la plaque, centrifugez la plaque à 2000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation.Ajoutez délicatement 450 microlitres d'une masse x, plus du succinate et de la rotténone, à chacun. Observez attentivement les mitochondries au microscope afin de garantir une adhérence homogène au fond de la cavité avant de transférer la plaque vers l'analyseur XF. Mesurez séquentiellement la respiration mitochondriale en temps réel à l'aide du respiromètre, programmé selon les paramètres indiqués dans le protocole écrit fourni ici, qui illustrent des profils respirométriques typiques induits par le complexe II, en utilisant un microgramme, 2,5 microgrammes et cinq microgrammes de mitochondries, comme prévu.De manière générale, la CRO (consommation d'oxygène) augmente avec des quantités plus élevées de mitochondries. Le rapport de contrôle respiratoire (RCR) calculé pour ce dosage est de 7,95, indiquant que la préparation mitochondriale est de haute qualité, permettant ainsi de comparer la reproductibilité des résultats lors de l'analyse de différentes quantités de mitochondries. Une analyse de variantes ou d'Inova a été réalisée et la somme des carrés a été calculée. La somme des carrés (SS) est présentée pour l'état deux, l'état trois, l'état trois découplé, l'antimycine A, ainsi que pour le RCR relatif aux mesures des états deux et trois selon une approche unidirectionnelle.Innova était statistiquement significatif, tout comme ANTMYCINE et le RCR. Aucune différence significative n'a été observée concernant l'état trois non couplé entre les groupes. Ces résultats indiquent que cinq microgrammes de mitochondries par puits ont donné le SS le plus bas par rapport aux autres concentrations.Ce graphique sert de guide pour indiquer la quantité de protéines mitochondriales attendue en fonction de la taille initiale de l'échantillon musculaire. Comme prévu, une forte corrélation existe entre la quantité de muscle traitée et la teneur totale en protéines mitochondriales de l'échantillon final. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de trois heures si elle est effectuée correctement.Après la biopsie musculaire, il est important de s'assurer que le patient n'absorbe aucun aspirine, ibuprofène ou tout autre anti-inflammatoire non stéroïdien en vente libre pendant les trois prochains jours, afin de garantir une bonne cicatrisation des tissus prélevés. Ensuite, il faut veiller à ce qu'il n'effectue aucune activité physique intense pendant la journée et demie suivante, évitant ainsi tout mouvement brusque. Il s'agit par exemple de sauter sur un trampoline ou de jouer au basketball, mais il peut continuer à mener ses activités habituelles.Nous leur demandons également de garder la zone au sec pendant 24 heures, mais la première fois qu’elle sera mouillée, il est préférable que ce soit sous la douche, afin que tout type de bactéries présentes sur la peau que nous n’aurions pas nettoyées ne pénètre pas dans l’incision. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez mieux comprendre comment prélever par biopsie un tissu musculaire squelettique latéral, isoler des mitochondries et mesurer le contrôle respiratoire.

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Ce protocole décrit une procédure pour étudier la respiration des mitochondries isolées de muscles squelettiques. Cette méthode a été adaptée à partir...

Isolement mitochondriale du muscle squelettique

Procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de tissu de mammifère est décrite. foie de rat ou des préparations musculaires squelettiques ont été homogénéisés avec un dissociateur tissu commercial et les mitochondries ont été isolées par filtration différentielle à travers des filtres en filet de nylon. Temps d'isolement des mitochondries est &lt;30 min par rapport à 60 - 100 min en utilisant des méthodes alternatives.

Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

Les méthodes présentées fournissent des instructions étape par étape pour la réalisation d’une collection de tests respiratoires basés sur des microplaques utilisant des mitochondries isolées à partir de quantités minimales de muscle squelettique de souris. Ces tests sont capables de mesurer les changements/adaptations mécanistes de la consommation d’oxygène mitochondrial dans un modèle animal couramment utilisé.

Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

Ici, nous présentons une modification d’une méthode précédemment rapportée qui permet d’isoler des mitochondries purifiées de haute qualité à partir de plus petites quantités de muscle squelettique de souris. Cette procédure aboutit à des mitochondries fortement couplées qui respirent avec une fonction élevée lors des tests respiratoires sur microplaques.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Ici, un échantillon de muscle quadriceps est prélevé sur un porc anesthésié et les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. Ensuite, les fréquences respiratoires des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale I, II et IV sont déterminées à l’aide de la respirométrie à haute résolution.

Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

Nous avons conçu et construit un laboratoire mobile pour mesurer les taux de respiration dans les mitochondries isolées d’animaux sauvages capturés sur le terrain. Nous décrivons ici la conception et l’aménagement d’un laboratoire mitochondrial mobile et les protocoles de laboratoire associés.

Développement d’un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale pour la mesure de l’énergétique mitochondriale sur le terrain

Les mitochondries sont des organites métaboliques clés qui présentent un niveau élevé de plasticité phénotypique dans le muscle squelettique. L’importation de protéines du cytosol est une voie critique pour la biogenèse des organites, essentielle à l’expansion du réticulum et au maintien de la fonction mitochondriale.  Par conséquent, l’importation de protéines sert de baromètre de la santé cellulaire.

Mesure de la capacité d’importation de protéines des mitochondries du muscle squelettique

Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour l’isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris et l’analyse ultérieure de la respiration par taux de consommation d’oxygène (OCR) à l’aide de tests respirométriques sur microplaques. Ce pipeline peut être appliqué pour étudier les effets de multiples interventions environnementales ou génétiques sur le métabolisme mitochondrial.

Isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris pour les tests respirométriques

Les chevaux ont une capacité d’exercice aérobique exceptionnelle, faisant du muscle squelettique équin un tissu important pour l’étude de la physiologie de l’exercice équin ainsi que de la physiologie mitochondriale des mammifères. Cet article décrit des techniques pour l’évaluation complète de la fonction mitochondriale dans le muscle squelettique équin.

Fluoro-respirométrie à haute résolution du muscle squelettique équin

Ici, nous décrivons une méthode complète pour mesurer la phosphorylation oxydative mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques perméabilisées fraîches à partir de muscles humains ou de souris. Cette méthode permet de quantifier en temps réel la respiration mitochondriale et d’évaluer la préférence pour le carburant et la flexibilité métabolique tout en préservant les réseaux mitochondriaux existants et l’intégrité de la membrane.

Mesure de la respiration mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques humaines et murines par respirométrie à haute résolution

Découvrez l'évaluation respirométrique de mitochondries isolées à partir de biopsies musculaires squelettiques par aiguille. Cette méthode minimalement invasive permet d'étudier le contrôle respiratoire mitochondrial avec seulement 20 mg de tissu.

Préparation et respirométrique évaluation des mitochondries isolées de tissu musculaire squelettique Obtenu par biopsie percutanée aiguille (Vidéo) | JoVE Journal

Préparation et respirométrique évaluation des mitochondries isolées de tissu musculaire squelettique Obtenu par biopsie percutanée aiguille

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