Préparation et respirométrique évaluation des mitochondries isolées de tissu musculaire squelettique Obtenu par biopsie percutanée aiguille

L’objectif global de cette procédure est d’examiner le contrôle respiratoire dans les mitochondries, isolés à partir de tissu musculaire squelettique biopsié. Ceci est accompli en obtenant d’abord une petite quantité de muscle par biopsie percutanée à l’aiguille. La deuxième étape consiste à isoler les mitochondries du muscle biopsié par homogénéisation.

Ensuite, les mitochondries isolées sont lavées et séparées des fractions non mitochondriales par centrifugation et passage de l’échantillon à travers une étamine mariée. La dernière étape consiste à mettre sur plaque des mitochondries isolées pour effectuer une analyse respirométrique à l’aide de tests de flux extracellulaires afin de visualiser le taux de consommation d’oxygène. En fin de compte, l’analyseur de flux extracellulaire hippocampe est utilisé pour examiner le contrôle respiratoire dans les mitochondries isolées.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle nécessite une quantité minimale de tissu musculaire aussi faible que 20 milligrammes et limite la variabilité inter-expérimentale. Ces caractéristiques rendent cette technique adaptée aux applications de recherche clinique. Les implications de cette technique sont pour le diagnostic de la dysfonction mitochondriale chez les patients.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la biopsie musculaire et l’isolement mitochondrial nécessitent des manipulations précises qui sont mieux démontrées visuellement plutôt que décrites uniquement dans le texte. Pour réaliser la biopsie localement, administrez 1 % de lidocaïne en prenant soin de ne pas infiltrer le muscle. Poursuivez avec une période d’attente de 10 minutes.

Pour permettre un engourdissement suffisant, prélevez les biopsies de la région médiane du muscle entre l’insertion et l’origine, en évitant les zones sous-fasciales et myo-tendines. Pour y parvenir, utilisez d’abord une aiguille percutanée et suivez un pop fascial ou une résistance du fascia comme guide. Estimez la profondeur avec l’aiguille d’anesthésie, puis palpez-la avec la lame étroite du scalpel et faites une incision de quatre à cinq millimètres à travers le fascia.

Faites avancer l’aiguille à travers l’incision jusqu’à ce qu’elle soit insérée dans le muscle. Prélevez plusieurs échantillons avec la fenêtre tournée dans différentes directions. Appliquez une aspiration continue à l’aide d’une seringue de 60 centimètres cubes tout en avançant et en prélevant des échantillons musculaires dans l’aiguille percutanée deux à quatre fois dans différentes directions.

Arrêtez l’aspiration et retirez l’aiguille. Demandez à un assistant d’appliquer une pression ferme sur le site de ponction pendant cinq minutes. Pour établir l’hémostase, débranchez l’aiguille de la tubulure d’aspiration et retirez soigneusement les échantillons musculaires de la fenêtre et du canon.

Faites un deuxième passage si plus de muscle est nécessaire en répétant cette procédure. Retirez tous les caillots sanguins visibles de l’échantillon musculaire à l’aide d’une pince. Pesez ensuite l’échantillon et placez-le immédiatement dans un tube contenant de la glace.

Sérum physiologique tamponné au phosphate ECCO froid ou DPBS. Retirez le tissu conjonctif visible de l’échantillon à l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler. Complètement. Lavez les échantillons trois à quatre fois avec un tampon DPBS glacé.

Pour prélever du sang, conservez les échantillons sur du DPBS glacé et traitez-le dès que possible. Dans les 45 minutes suivant la biopsie, prenez la précaution de retirer soigneusement tous les tendons ou le tissu adipeux de l’échantillon musculaire. Retirez une petite partie de tout tissu supplémentaire pour l’entreposer à moins 80 degrés Celsius.

Cela peut être utilisé pour d’autres expériences telles que les transferts Western. Coupez immédiatement le tissu musculaire en petits morceaux. À l’aide d’une paire de ciseaux stériles, puis suspendez dans 500 microlitres à un millilitre d’un inhibiteur de l’ECA de la protéine Sixtine, comme les nagars dissous dans un tampon CP à une concentration de 0,2 milligramme par gramme de tissu.

Hachez l’échantillon jusqu’à ce qu’il apparaisse bien suspendu. Poursuivez avec une incubation de cinq minutes à température ambiante avant de transférer dans de la glace, en vous assurant que l’homogénéisateur est bien lavé. Préalablement. Homogénéiser les tissus hachés traités avec des nagars.

Utilisation d’un homogénéisateur automatisé. Gardez l’échantillon sur de la glace tout au long de ce processus. Homogénéiser chaque échantillon de tissu quatre fois à chaque fois pour une impulsion de deux secondes.

À l’aide de l’homogénéisateur automatisé à une vitesse de 10 000 tr/min, replacez l’échantillon sur de la glace. Lavez la sonde avec de l’éthanol à 70 % puis de l’eau distillée entre les tissus. Maintenant, lavez le tissu homogénéisé avec un volume égal de tampon chapel Perry one ou CP one.

Lavez ensuite le mouchoir avec deux fois le volume de tampon CP deux. Ajoutez le tube d’équilibre en portant l’eau au même volume dans un autre tube conique. Récupérez le contenu dans un tube à centrifuger et centrifugez à 600 GS, quatre degrés Celsius ou 10 minutes avant de mouiller l’étamine pour permettre à toutes les particules de passer à travers et de ne pas se coincer dans le tissu.

Passez le surnageant à travers une étamine mariée, en recueillant le filtrat et en jetant la pastille, éliminant ainsi la majorité des fractions non mitochondriales. Ensuite, ultracentrifugez le surnageant à 10 000 GS quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Suspendre la pastille dans quatre millilitres de tampon CP deux avant de centrifuger une seconde fois de la même manière après la centrifugation.

Jetez le surnageant et remettez le pâté en suspension dans deux millilitres de CP un tampon. À ce stade, placez une petite aliquote de cette suspension dans un tube à essai séparé à utiliser pour l’estimation des protéines. Résume, suspendre l’échantillon restant dans un tampon CP et centrifuger.

Comme précédemment, notez que la plaque protéique doit être mise en place avec les étalons lors des étapes de centrifugation précédentes. Enfin, remettre en suspension la pastille finale dans une quantité minimale de solution ou de masse de dosage mitochondrial. Effectuez des tests XF pour visualiser le taux de consommation d’oxygène ou OCR en picomoles d’oxygène par minute ou les niveaux absolus d’oxygène et de pH.

Dans la sortie de données. Ajouter une concentration de 10 x des composés dans une masse X aux orifices A à D du respiromètre sur plaque pour obtenir une concentration finale telle qu’indiquée dans le protocole de texte. Préparez un volume suffisant de composés pour le nombre requis de puits.

Utilisez les calculs de protéines mesurés précédemment pour déterminer les concentrations de mitochondries à ajouter. Déterminez la quantité optimale de mitochondries en titrant un microgramme, 2,5 microgrammes et cinq microgrammes de mitochondries par puits. De la plaque de 24 puits pour minimiser la variabilité entre les puits.

Diluez d’abord 10 x mitochondries dans du substrat froid, un x masse plus substrat. Ensuite, livrez 50 microlitres de cette suspension à chaque puits. Laissant quatre puits contenant seulement 50 microlitres de masse à utiliser comme relevés de fond.

Placez la plaque d’étalonnage pré-trempée avec la cartouche supérieure précédemment dans le respiromètre pour effectuer l’étalonnage de l’instrument. Préparation pour le fonctionnement de la plaque d’essai, centrifugez la plaque à 2000 GS pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation.

Ajoutez doucement 450 microlitres d’une masse x, plus du succinate et du pourri connus de chacun. Observez les mitochondries au microscope pour assurer une adhérence homogène au puits avant de transférer la plaque dans l’analyseur XF. Séquentiellement. Mesurez la respiration mitochondriale en temps réel à l’aide du respiromètre en la programmant à l’aide des paramètres du respiromètre fournis dans le protocole textuel montré ici sont des profils métriques Respiro typiques pilotés par le complexe deux utilisant un microgramme, 2,5 microgrammes et cinq microgrammes de mitochondries comme prévu.

Dans l’ensemble, l’OCR est augmenté avec des quantités plus élevées de mitochondries. Le rapport de contrôle respiratoire (RCR) calculé pour ce test est de 7,95, ce qui indique que la préparation mitochondriale est de haute qualité afin de comparer la cohérence des résultats lors du profilage de différentes quantités de mitochondries, l’analyse des variants ou de l’Inova a été effectuée et la somme des carrés a été calculée. La somme des carrés ou SS est présentée pour l’état deux, l’état trois, l’état trois, l’antimycine A découplée et la RCR pour les mesures d’état deux et d’état trois à sens unique.

Innova était statistiquement significatif ainsi que pour ANTIMYCIN et RCR. Aucune différence significative n’a été observée pour l’état trois découplé entre les groupes. Ces résultats indiquent que cinq microgrammes de mitochondries par puits ont donné la SS la plus faible par rapport aux autres concentrations.

Ce graphique sert de guide pour indiquer la quantité de protéines mitochondriales attendue en fonction de la taille initiale de l’échantillon musculaire. Comme prévu, il existe une forte corrélation entre la quantité de muscle traité et la teneur totale en protéines mitochondriales de l’échantillon final. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de trois heures si elle est exécutée correctement.

Après la biopsie musculaire, il est important de s’assurer que le patient ne prend pas d’aspirine ou d’ibuprofène ou d’autres non-stéroïdiens en vente libre pendant les trois prochains jours afin de s’assurer qu’il y a une bonne cicatrisation des tissus que nous avons biopsiés. La prochaine chose est que nous voulons nous assurer qu’ils ne font pas d’activité intense également pendant le prochain jour et demi, donc rien de tel que des secousses. Ce serait une motoneige de basket-ball, mais ils peuvent faire leurs propres activités normales.

Nous leur demandons également de garder la zone sèche pendant 24 heures, mais la première fois qu’elle est mouillée, d’être sous une douche afin que tout type de bactéries qui peuvent se trouver sur la peau que nous n’avons pas nettoyées ne pénètre pas dans l’incision. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la biopsie du tissu musculaire squelettique latéral S, d’isoler les mitochondries et de mesurer le contrôle respiratoire.