Haute résolution Respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale dans perméabilisées et des cellules intactes

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la respirométrie à haute résolution pour déterminer la consommation d’oxygène mitochondriale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les syndromes et les maladies associés au dysfonctionnement mitochondrial tels que ; septicémie, diverses maladies neurologiques et troubles liés à l’âge. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle a une sensibilité plus élevée et la capacité de réaliser des expériences de titrage de substrat sur des inhibiteurs couplés avec un petit nombre d’échantillons biologiques tels que des cellules intactes ou perméabilisées.

Sandra Nansoz, une technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Avant de commencer la procédure, calibrez à l’air les capteurs d’oxygène polarographiques, puis remettez les cellules en suspension dans le tampon respiratoire à une fois dix à six cellules par millilitre de concentration et remplacez le milieu respiratoire dans une chambre de l’oxygraphe par 2,1 millilitres de suspension cellulaire. Fermez la chambre avec le bouchon et réglez la barre d’agitation magnétique dans la chambre sur 700 rotations par minute.

Enregistrez ensuite la respiration cellulaire pendant 5 à 10 minutes jusqu’à ce qu’un signal de flux d’oxygène stable soit obtenu. Ensuite, à l’aide d’une seringue, injectez deux microlitres de roténone à travers l’orifice d’injection de titane dans la chambre d’oxygraphe et enregistrez la respiration cellulaire pendant 5 à 10 minutes supplémentaires. Lorsqu’un signal de flux d’oxygène stable est obtenu, injectez 20 microlitres d’une molaire de succinate suivi de 10 microlitres de 0,5 molaire d’ADP.

Ensuite, injectez deux volumes de deux microlitres de deux millimolines de digitonine et enregistrez la respiration cellulaire pendant deux à cinq minutes après chaque injection, suivie de l’injection progressive de deux à quatre microlitres de deux millimolitres de digitonine millimolaire jusqu’à ce que le signal de flux d’oxygène atteigne le niveau maximum et que d’autres injections de digitonine n’augmentent pas le taux respiratoire. Pour l’évaluation de l’intégrité de la membrane externe mitochondriale, préparez une chambre d’oxygraphe comme nous venons de le démontrer et injectez deux microlitres de digitonine millimolaire pour perméabiliser les cellules. Après cinq minutes, injectez 20 microlitres d’une molaire de succinate et enregistrez la respiration cellulaire pendant 5 à 10 minutes jusqu’à ce qu’un signal de flux d’oxygène stable soit obtenu.

Injectez ensuite 10 microlitres d’ADP 0,5 molaire pour stimuler le complexe deux, et induire une augmentation de la consommation d’oxygène. Lorsqu’un signal de flux stable est obtenu, injectez cinq microlitres de cytochrome c millimolaire suivi d’un microlitre de quatre milligrammes par millilitre de ligamycine. Pour mesurer la respiration des cellules du carcinome hépatocellulaire hépatique stimulée par l’ADP, préparez une chambre d’oygraphe comme nous venons de le démontrer, et injectez deux microlitres de digitonine de huit millimolaires dans la chambre à oxygène pour perméabiliser les cellules pendant cinq minutes, suivie de l’injection de 12,5 microlitres de mallade molaire 0,8 et de 10 microlitres de glutamate molaire.

Lorsqu’un flux d’oxygène stable est atteint, injectez 10 microlitres d’ADP 0,5 molaire pour augmenter la consommation d’oxygène, suivis de deux microlitres de roténone de 0,2 millimolaire et de 20 microlitres de succinate molaire. Ensuite, injectez deux microlitres de cinq millimoles d’antimycine et enregistrez la respiration cellulaire. Lorsque le signal diminue et se stabilise, injectez 2,5 microlitres d’escorbate de 0,8 millimolaire suivi de l’injection immédiate de 2,5 microlitres de TMPD de 0,2 millimolaire, en enregistrant la respiration cellulaire jusqu’à ce que le signal de flux d’oxygène augmente et se stabilise.

Injectez ensuite 10 microlitres d’une molaire d’azite de sodium dans la chambre d’oxygraphe et enregistrez l’aspiration cellulaire jusqu’à ce que le signal de flux d’oxygène diminue et se stabilise. Pour mesurer la consommation d’oxygène d’une cellule intacte, préparez une chambre d’oxygraphe comme nous venons de le démontrer et injectez 1 microlitre de quatre milligrammes par millilitre d’aligimicyn suivi d’une injection d’un et trois microlitres de FCCP de 0,2 millimolaire. Ensuite, titrez le FCCP par incréments de 0,1 à 0,3 micromolaire en injectant un à trois microlitres de FCCP de 0,2 à un millimolaire jusqu’à ce que le signal de flux d’oxygène atteigne son niveau maximal sans augmenter davantage, puis commence à diminuer.

Ensuite, injectez deux microlitres de roténone de 0,2 millimolaire et deux microlitres d’antimycine A de cinq millimolaires et enregistrez la respiration jusqu’à ce que le signal de flux d’oxygène diminue et se stabilise. En l’absence de digitonine, la respiration cellulaire est très faible et la respiration des cellules intactes et non perméabilisées n’est pas stimulée en présence du substrat mitochondrial et de l’ADP. Cependant, lors de l’ajout progressif de digitonine, la membrane plasmique cellulaire devient perméabilisée et la respiration mitochondriale augmente jusqu’à la perméabilisation complète, moment auquel le succinate et l’ADP pénètrent dans les cellules.

L’intégrité de la membrane externe mitochondriale peut toutefois être compromise si des quantités excessives de digitonine sont utilisées, induisant une réduction de la respiration complexe à l’état trois dépendant. Le cytochrome c n’améliore pas la respiration complexe à l’état trois dans les cellules traitées aux digitonines, ce qui indique qu’il n’y a pas de perte de cytochrome c de la membrane externe mitochondriale et que l’intégrité mitochondriale est préservée, même si le cytochrome c peut améliorer la respiration des cellules traitées avec de très fortes doses de digitonine. L’ajout de substrats exogènes de l’activité du complexe mitochondrial après la perméablation des digitonines induit une augmentation des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale un, deux et quatre fréquences respiratoires maximales.

La génération de niveaux respiratoires réduits peut être due à la contamination des chambres oxygraphiques par des inhibiteurs mitochondriaux de l’expérience précédente. En présence d’alygimycine et de l’ajout séquentiel de FCCP, la fréquence respiratoire maximale découplée des cellules est observée. Une fois maîtrisée, n’importe laquelle de ces techniques peut être réalisée en moins d’une heure si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de se souvenir des chambres d’oxygraphe de lavage et des bouchons après chaque expérience. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que les mesures de la teneur en ATP cellulaire, chacune présentant dans l’activité cymatique, les niveaux de substrat mitochondrial, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que si les changements dans les fréquences respiratoires sont dus à un manque de substrats mitochondriaux ou à une activité réduite des cyntates ATP. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biogénétique pour explorer la fonction mitochondriale dans des domaines tels que les maladies mitochondriales acquises et génétiques, le stress oxydatif, les lésions de perfusion cutanée et le vieillissement dans des cellules ou des fibres intactes ou perméabilisées et des mitochondries isolées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’aider le fonctionnement des mitochondries dans les cellules perméabilisées et intactes à l’aide de la respirométrie à haute résolution. N’oubliez pas que travailler avec de l’antimycine a, de la roténone, de l’iozide de sodium, du FCCP et de l’aricomycine peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de blouses de laboratoire doivent toujours être prises lors de cette procédure.