Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser une technologie de mesure de la consommation d'oxygène basée sur des microplaques afin d'évaluer la fonction de la chaîne de transport d'électrons, du cycle de l'acide tricarboxylique, de la voie de la β-oxydation et des transporteurs de substrats. Cette évaluation est réalisée en préparant tout d'abord le substrat et les solutions d'injection pour le test. La deuxième étape consiste à ajouter les solutions d'injection dans une cartouche d'essai tric préalablement hydratée afin de calibrer l'appareil de mesure de la consommation d'oxygène.

Ensuite, préparez les solutions de substrat mitochondrial et ajoutez ces solutions dans la plaque de culture cellulaire. Faites tourner la plaque de culture cellulaire afin de permettre l'adhérence des mitochondries au fond des puits avant de placer la plaque dans le test respiratoire. Les résultats de l'appareil permettent d'obtenir les taux de consommation d'oxygène en fonction de la respiration mitochondriale pour chaque test respirométrique.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l'électrode de Clark est que les technologies basées sur les plaques de microtitration permettent d'acquérir de manière plus efficace et à haut débit la consommation d'oxygène, avec de plus faibles quantités de mitochondries. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison du grand nombre d'éléments à coordonner lors de la préparation des solutions pour le dosage. La veille de l'expérience, hydrater la cartouche d'essai Tric dans un millilitre de solution d'étalonnage, dans un incubateur non CO2 à 37 degrés Celsius. Le jour suivant, sortir toutes les tiges congelées et les décongeler dans un bain ou un incubateur à 37 degrés Celsius. Préparer toutes les solutions de substrat et les solutions d'injection, puis les conserver sur glace. L'étape suivante consiste à programmer l'appareil de mesure de la consommation d'oxygène en multi-puits avec les paramètres appropriés de mélange, de poids et de mesure.

Lancez le logiciel d'analyse et sélectionnez le mode standard. Accédez au forum invité de Seahorse et cliquez sur l'assistant d'essai. Une fois dans l'assistant d'essai, cliquez sur protocole pour modifier les paramètres de mélange, de poids et de mesure.

Étiquetez les puits de fond sous l'onglet de correction du fond et assurez-vous de les surligner. Effectuez la correction du fond. Étiquetez les conditions en cliquant d'abord sur l'onglet groupes et étiquettes, puis sur l'onglet informations du groupe.

Après avoir saisi ces paramètres, cliquez sur fin, puis sur enregistrer le modèle. Pour commencer cette procédure, chargez les solutions d'injection dans une cartouche d'analyse. Veillez à injecter les solutions dans les orifices appropriés.

Insérez la cartouche d'analyse dans la machine en orientant l'angle cranté vers le bas à gauche. Lancez l'étalonnage en accédant d'abord au logiciel d'analyse, puis en sélectionnant le mode standard. Accédez au forum invité de Seahorse.

Ouvrez le modèle enregistré dans le lecteur XF, sous l'onglet modèles. Une fois ouvert, cliquez sur démarrer pour lancer l'étalonnage, ce qui prendra environ 30 minutes. Les mitochondries utilisées pour cette procédure ont été isolées à partir de muscle squelettique rouge ; mélangez délicatement mais soigneusement le stock de substrat mitochondrial en agitant doucement la solution à l’aide d’une pipette de 200 microlitres dont environ trois millimètres de l’extrémité ont été coupés.

Après avoir déterminé la concentration en protéines de l'extract de mitochondries, resuspendre 10 microgrammes de protéines mitochondriales par 200 microlitres du mélange substrat connu de succinate-rot. Mélanger délicatement mais complètement la solution de protéines mitochondriales et de substrat en agitant doucement la solution à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres dont environ trois millimètres de l’extrémité ont été coupés de la même manière. Pour les autres mélanges de substrats, utiliser 14 microgrammes de protéines mitochondriales par 200 microlitres ; placer tous les mélanges de protéines mitochondriales et de substrats sur de la glace.

Placer une plaque de culture cellulaire à 24 puits sur de la glace et charger en triple exemplaire 50 microlitres par puits de chacun des mélanges de substrats mitochondriaux. Les développeurs du test tric basé sur plaque recommandent de laisser au minimum deux puits témoins sans mitochondries, de préférence de chaque côté de la plaque de culture cellulaire. Faire centrifuger la plaque de culture cellulaire à 2000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius afin d'adhérer les mitochondries aux puits pendant que la plaque centrifuge.

Réchauffez les solutions de substrat dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Une fois la centrifugation terminée, déposez soigneusement 450 microlitres de chaque solution de substrat au-dessus des puits respectifs. Veillez à charger la plaque à température ambiante.

Remplir les puits témoins avec 500 microlitres de substrat témoin. Les puits destinés au dosage du flux électronique doivent être remplis avec le substrat de flux électronique, tandis que les puits témoins de l'essai couplé peuvent être remplis avec n'importe quel substrat d'essai de couplage. Après avoir ajouté 450 microlitres de substrat à chaque puit, observer la couche de mitochondries dans le puit à une amplification de 20 x afin de s'assurer que les mitochondries sont uniformément dispersées en une monocouche unique.

Comme illustré dans cet exemple, les puits d'image qui ne semblent pas présenter une monocouche uniformément répartie peuvent être éliminés après l'oc. Après avoir confirmé l'adhérence mitochondriale, transporter la plaque de culture cellulaire vers l'appareil d'analyse Respir metric. Cliquer sur OK.

La machine va éjecter la plaque utilitaire qui a été utilisée précédemment pour l'étalonnage. Retirez la plaque utilitaire et placez la plaque de culture cellulaire contenant les mitochondries sur le plateau. L'encoche bleue de la plaque de culture cellulaire doit être positionnée dans le coin inférieur gauche du plateau.

Cliquez sur continuer pour démarrer l'analyse, qui prend environ 40 minutes. Une fois l'analyse terminée, appuyez sur éjecter à l'écran pour sortir la plaque de culture cellulaire. Une fois la plaque éjectée, retirez-la et jetez-la ainsi que la cartouche.

Appuyez sur continuer à l'écran. L'analyse sera automatiquement enregistrée sous forme de fichier XLS dans le dossier de données. Ouvrez ce fichier et modifiez l'affichage de O2 à OCR en cliquant sur la flèche vers le bas sous le marqueur Y un.

Ensuite, modifiez le point central pour passer des taux de point à point aux taux affichés comme option dans les données de taux. Cliquez sur OK. Pour appliquer ces modifications, cliquez sur l'onglet mode de regroupement des puits situé en bas à gauche de l'écran afin de regrouper les puits ayant des conditions similaires.

Enfin, cliquez sur l'onglet erreur type de la moyenne de l'échantillon vers le milieu de l'écran à gauche. Ces commandes pourraient également être configurées avant le dosage. Ces tracés représentent les taux de consommation d'oxygène ou OCR en fonction du temps pour quatre dosages de couplage.

Le premier panneau représente l'état deux, la respiration ou la respiration en l'absence d'un DP. Le deuxième panneau, après l'injection d'un DP, représente la respiration couplée maximale, également appelée respiration à l'état trois. Le troisième panneau, après l'injection d'oligomycine, représente la respiration due à la fuite de protons, également appelée respiration à l'état quatre oh.

Le quatrième tracé après l'injection de FCCP représente la respiration maximale découplée, également appelée respiration à l'état trois U. Le cinquième tracé après l'injection d'antimycine A représente l'inhibition de la respiration oxydative. Tous les états mitochondriaux présentent un écart-type minimal en raison du mélange complet du stock de mitochondries et des mélanges de substrats mitochondriaux, ainsi que de l'obtention d'une monocouche unique de mitochondries après la centrifugation d'adhérence.

En revanche, charger un nombre inégal de mitochondries dans chaque puits et ne pas obtenir une monocouche unique de mitochondries entraîne une augmentation de l'écart type dans chaque état, comme indiqué par le tracé bleu, qui montre des valeurs de OCR supérieures à 1 500 ole par minute, ainsi qu'une diminution des taux de respiration au cours de la période de mesure, illustrée par la baisse des valeurs de taux de point à point. Notez que le tracé rouge montre des taux de point à point constants et que les valeurs maximales de OCR sont inférieures à 1 500 ole par minute. Un excès de protéines mitochondriales peut également entraîner l'épuisement de l'oxygène dans la micro-chambre du puits, empêchant ainsi une mesure précise du OCR pour chaque mesure successive, comme indiqué par le tracé bleu, qui affiche des valeurs d'O₂ proches de zéro pendant la période de mesure, ainsi que des valeurs initiales d'O₂ nettement réduites après chaque mesure successive.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder de la patience lors du mélange des solutions de mitochondries et de substrat. Une fois ces méthodes maîtrisées, des expériences supplémentaires peuvent être adaptées afin de répondre à d'autres questions, comme : comment un traitement ciblé par médicament d'un transporteur de substrat spécifique influence-t-il la consommation d'oxygène mitochondriale ?