Visualisation et la Quantification du potentiel de différenciation des cellules mésenchymateuses adipocytaire avec un marqueur spécifique de la lignée

L’objectif général de cette procédure est de visualiser et de quantifier la différenciation des cellules stromales en lignée adipogénique, à l’aide d’un marqueur protéique spécifique à la lignée, la protéine de liaison aux acides gras quatre. Ceci est accompli en isolant et en élargissant d’abord les cellules stromales d’intérêt. Les cellules stromales sont ensuite récoltées et plaquées dans des plaques de culture in vitro standard.

Après une incubation de quelques jours, les cellules sont traitées avec un milieu de différenciation adipogénique. Les cellules sont incubées pendant 14 jours, avec remplacement régulier des milieux. Après la différenciation, les cellules sont fixées et colorées avec des anticorps contre la protéine de liaison aux acides gras quatre.

Un microscope immunofluorescent de dépistage automatisé à haut contenu est utilisé pour capturer des images des cellules marquées dans les plaques de micropuits. La différenciation est ensuite quantifiée à l’aide d’un logiciel spécialisé d’analyse d’images. Contrairement aux méthodes traditionnelles de mesure de la différenciation adipogénique à l’aide de colorants tels que Oil Red O, le test décrit dans cette vidéo utilise un anticorps contre une protéine spécifique à la lignée, la protéine de liaison aux acides gras quatre, pour confirmer la différenciation adipogénique.

Ce faisant, cette méthode quantifie les changements dans l’expression des gènes qui correspondent à la différenciation adipogénique. Ce test est capable de fournir une multitude d’informations, notamment le pourcentage de cellules différenciées, l’intensité du signal de fluorescence par cellule et les changements dans la morphologie cellulaire. La capacité d’analyser plusieurs caractéristiques permet d’identifier des changements subtils potentiels de différenciation en réponse à divers traitements.

Ce test a également une capacité de traction élevée, ce qui le rend idéal pour les applications de criblage de drogues à haute traction. Remettre les cellules en suspension dans un milieu ASC complet, qui est un milieu basal DMEM/F-12, complété par 10 % de sérum fœtal bovin, GlutaMAX et des antibiotiques. Pipeter dans une plaque de culture de 96 puits, à 5000 cellules par puits.

Huit puits sont nécessaires pour chaque donneur. Quatre puits reçoivent un milieu témoin, tandis que les autres reçoivent un milieu de différenciation. Un puits sur quatre de chaque traitement servira à un ganglion de contrôle primaire.

Incuber des cellules à 37 degrés, humidifiées avec des conditions atmosphériques de 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre jours. Il s’agit de permettre aux cellules de se développer jusqu’à la confluence dans chaque puits. Au quatrième jour, sortez les assiettes de l’incubateur.

Retirez la moitié du milieu de chaque puits. Ajoutez un volume égal de milieu ASC complet, ou milieu de différenciation adipogénique, qui est complété par de l’insuline, de l’isobutylméthylxanthine, de la dexaméthasone et de l’indométhasone. Plaque d’incubation à 37 degrés, humidifiée avec une condition atmosphérique de 5 % de dioxyde de carbone.

La période de temps nécessaire pour une différenciation suffisante est de 14 jours. Pendant ce temps, réapprovisionnez les supports en effectuant un changement de support tous les deux à trois jours. Après la différenciation, sortez les plaques de l’incubateur.

Pipetez soigneusement tous les milieux dans chaque puits. Fixez les cellules en ajoutant du méthanol glacé. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante.

Retirez le méthanol, puis lavez-le avec une solution saline tamponnée au Tris. Bloquer en ajoutant 0,25 % de bloqueur de caséine. Incuber 10 minutes à température ambiante.

Retirez la caséine, puis lavez-la avec une solution saline tamponnée au Tris. Préparez le mélange d’anticorps primaires en diluant l’anticorps anti-FABP4 200 fois dans un tampon de dilution d’anticorps. Ajouter le mélange à tous les puits, à l’exception de ceux réservés comme contrôle primaire des nœuds.

Ajoutez plutôt un tampon de dilution d’anticorps dans ces puits. Incuber à température ambiante pendant une heure. Après l’incubation, lavez les cellules une fois avec une solution saline tamponnée au Tris.

Retirez, ajoutez une solution saline fraîche tamponnée au Tris et incubez pendant cinq minutes sur la bascule. Répétez ce processus deux fois. Préparez le deuxième mélange de réanticorps en diluant 200 fois le deuxième réanticorps Anti-Rabbit Alexa 488 dans un tampon de dilution d’anticorps.

Ajouter le DAPI, qui marque les noyaux cellulaires, à une dilution finale de un à 2000. Ajoutez le mélange dans tous les puits et enveloppez la plaque de papier d’aluminium pour éviter le photoblanchiment. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

Après l’incubation, laver les cellules avec du TBS, puis deux autres lavages de 15 minutes sur le rocker. Retirez tout le tampon des puits et ajoutez un tampon de stockage, complété par 0,4 milligramme par millilitre de thimérosal, pour prévenir la croissance bactérienne. Une machine de criblage à haut contenu équipée d’une platine automatisée, d’objectifs de focalisation et de filtres est utilisée pour imager cet essai biologique.

Vérifiez que les bons filtres sont en place. Nettoyez le fond de la plaque pour une meilleure qualité. Chargez la plaque dans la platine avec A1 positionné dans le coin supérieur gauche.

À l’aide de l’assistant d’acquisition de plaques, enregistrez des informations essentielles sur l’expérience, telles que le numéro de plaque, le grossissement, la date, les conditions expérimentales et les détails de l’étiquetage. Sélectionnez le type de plaque de micropuits utilisée. Les utilisateurs ont la possibilité de sélectionner les puits et le nombre de sites à acquérir.

Sélectionnez tous les puits à imager en mettant la grille en surbrillance. Déplacez la scène vers le puits le plus brillant. La sélection du puits le plus lumineux garantira que toutes les images seront acquises avec des valeurs de gris pixel qui se situent dans une plage linéaire, et donc directement proportionnelles à l’intensité de la coloration.

Si cette étape n’est pas effectuée, les images prises dans des puits plus lumineux peuvent être sursaturées. Sélectionnez les combinaisons de canaux, le temps d’exposition et les paramètres de décalage Z appropriés pour l’expérience. Les filtres utilisés pour l’imagerie de FABP4 et DAPI correspondent aux étiquettes spécifiques utilisées pour visualiser la coloration.

Alexa 488, qui excite à 480 nanomètres et émet à 560 nanomètres, a été utilisé pour visualiser FABP4. Et le colorant DAPI, qui excite à 360 nanomètres et émet à 460 nanomètres, a été utilisé pour visualiser les noyaux cellulaires. Pour les plaques étiquetées avec Oil Red O, les gouttelettes de graisse ont été visualisées avec une lumière brillante transmise par du carburant.

Et l’étiquette Oil Red O a également été visualisée avec la fluorescence, car elle excite à 575 nanomètres et émet à 630 nanomètres. Lorsque toute la configuration est terminée, le test biologique est prêt à être acquis. L’image est automatiquement enregistrée sur le serveur en ligne, afin de permettre un accès à distance facile aux images.

L’ensemble complet des images stockées sur le serveur en ligne est accessible à l’aide du programme de bureau à distance. Les images peuvent ensuite être analysées à l’aide du logiciel MetaXpress. L’application de notation des cellules permet aux utilisateurs de sélectionner une longueur d’onde pour détecter tous les noyaux d’un champ, tel que DAPI, dans ce cas.

Les longueurs d’onde ultérieures peuvent être utilisées pour détecter un marqueur positif dans le noyau, le cytoplasme ou les deux emplacements cellulaires. La protéine quatre de liaison aux acides gras, ou FABP4, est un marqueur de la lignée adipogénique. L’expression de FABP4 est localisée dans le noyau et le cytoplasme des adipocytes différenciés.

Dans cet essai biologique, nous analysons l’expression de FABP4 à l’aide du module de scoring cellulaire. Tout d’abord, détectez les noyaux cellulaires à l’aide du canal DAPI, avec des paramètres définis par l’utilisateur pour la taille et l’intensité du signal au-dessus du bruit de fond. Détectez le signal FABP4 à l’aide du canal C et des paramètres définis par l’utilisateur pour la taille et l’intensité du signal au-dessus du bruit de fond.

Dans ce test biologique, des gouttelettes de graisse marquées à l’huile rouge O, qui fluorent dans la gamme des 560 nanomètres, ont été analysées avec un module de canette MetaXpress, Transflour. Cet algorithme d’analyse détecte les cellules totales à l’aide de noyaux marqués DAPI, qui répondent aux critères de taille de cellule et d’intensité de coloration spécifiés par l’utilisateur. L’utilisateur spécifie également la taille et l’intensité des fosses, qui dans ce cas détectent les gouttelettes de graisse à proximité immédiate des noyaux cellulaires.

Les informations concernant la taille des gouttelettes de graisse, l’intensité de la coloration, le nombre par cellule, sont enregistrées par le test Transflour. Il est important de noter que l’étiquette Oil Red O s’est échappée ou s’est dissoute de certaines cellules, ce qui a potentiellement limité et confondu la véritable quantité de différenciation qui a lieu. Des images représentatives de cellules de passage précoce et tardif, de contrôle et différenciées, marquées avec du DAPI, une coloration nucléaire et FABP4, sont présentées à côté d’images de fusion et de segmentation.

Les images de segmentation affichent des cellules différenciées avec une superposition verte et des cellules indifférenciées avec une superposition rouge. Le pourcentage de cellules exprimant FABP4 a été utilisé comme mesure du potentiel de différenciation adipogénique. Une augmentation significative des cellules exprimant FABP4 a été observée avec la différenciation adipogénique dans les cellules de passage précoce et tardif.

Les cellules de passage précoce ont montré une augmentation significativement plus importante de la différenciation que les cellules de passage tardif. Les images représentatives de DAPI et Oil Red O sont présentées à côté des images de fusion et de segmentation. Les images de segmentation représentent tous les noyaux avec une superposition verte, et les gouttelettes lipidiques colorées en rouge à l’huile avec une superposition rouge.

L’aire de coloration au rouge d’huile O par cellule a été utilisée comme mesure du potentiel de différenciation adipogénique. Une augmentation significative de la zone de coloration du rouge huile O a été observée avec la différenciation adipogénique. Les cellules de passage précoce ont montré une plus grande surface de coloration O rouge huile par cellule, par rapport aux cellules de passage tardif.

Le Western blot a été effectué pour analyser le niveau d’expression de la protéine FABP4 des ASC différenciées à passage précoce et tardif. L’analyse semi-quantitative de la densité optique des bandes FABP4 en tant que rapport du contrôle de la charge protéique totale a montré que l’immunomarquage de FABP4 était significativement augmenté lors du passage précoce et, dans une moindre mesure, dans les cellules différenciées du passage tardif. En regardant cette vidéo, vous devriez avoir acquis une compréhension de la façon de différencier les cellules souches en lignée adipogénique, comment effectuer une coloration par immunofluorescence à l’aide d’un marqueur spécifique du gène adipogène, de la protéine de liaison aux acides gras quatre, et enfin, comment imager et analyser toutes les caractéristiques morphologiques pertinentes des cellules immunopositives pour la protéine de liaison aux acides gras quatre.

J’espère que vous trouverez cette vidéo utile pour vos recherches.