Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

L’objectif global de ce protocole est d’isoler les cellules stromales mésenchymateuses de quatre sources distinctes de tissus périnataux, la muqueuse du cordon ombilical, la gelée de Wharton, la jonction corde-placenta et le placenta fœtal. Cette méthode peut aider à faire progresser le domaine de la biologie des cellules souches, de la médecine alternative en obtenant des cellules souches mésenchymateuses de qualité spéciale, de manière non invasive. Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit de manière productive un grand nombre de populations cellulaires homogènes de haute qualité à partir de sources de tissus périnataux distinctes.

Les cellules stromales mésenchymateuses de cordon multipotentes dérivées de cette technique peuvent être utilisées pour traiter diverses maladies et troubles car elles sont plus primitives que les cellules souches mésenchymateuses isolées des tissus adultes. Cette méthode peut donner un aperçu des caractéristiques des cellules stromales mésenchymateuses de différents segments et de niches spécifiques du cordon et du placenta. Commencez par placer l’échantillon dans une boîte de Pétri de 150 millimètres sur de la glace dans une enceinte de sécurité biologique et utilisez une aiguille et une seringue pour rincer le tissu plusieurs fois avec du PBS glacé.

Lorsque tous les caillots sanguins ont été retirés, examinez soigneusement l’échantillon pour identifier les différentes régions anatomiques. Ensuite, utilisez une pince pour saisir l’extrémité fœtale du cordon ombilical et utilisez des ciseaux pour faire soigneusement une incision au sommet de la jonction cordon-placenta. Faites une deuxième incision sous la jonction pour séparer la jonction cordon-placenta du placenta.

Et divisez les tissus séparés en boîtes de Pétri individuelles. Ensuite, coupez le cordon ombilical longitudinalement pour exposer complètement les vaisseaux sanguins et la gelée de Wharton environnante sans perturber l’épithélium. À l’aide d’un scalpel, grattez la gelée de Wharton pour l’éloigner des vaisseaux sanguins et de l’interépithélium du subamnion.

Ensuite, retirez les vaisseaux sanguins, transférez toute gelée périvasculaire restante sous et autour des vaisseaux sanguins dans le bol de gelée de Wharton et placez le tissu restant de la muqueuse du cordon dans son propre bol. Lorsque tous les tissus ont été disséqués, remplacez le PBS dans chaque boîte par trois à cinq millilitres de trypsine et utilisez des ciseaux pour couper chaque échantillon de tissu en morceaux d’un à deux millimètres pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Utilisez un microscope à contraste de phase pour observer la digestion partielle en visualisant la libération de cellules du tissu.

À la fin de la période de digestion partielle, neutralisez la trypsine avec un volume égal de milieu de culture et transférez les échantillons dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres. Laissez les morceaux de tissu reposer pendant trois minutes. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et mettez en plaques 15 à 20 morceaux de tissu partiellement digérés par échantillon dans des flacons de culture de tissus individuels de 75 centimètres carrés.

Ensuite, ajoutez neuf millilitres de milieu de culture pour une incubation de deux à trois jours à 37 degrés Celsius. Changez de milieu de culture après trois jours et examinez les xplants par microscopie à contraste de phase pour détecter la croissance cellulaire. Lorsque la croissance cellulaire atteint 70 % de confluence, dissociez les cellules dans un à deux millilitres de solution de trypsine par flacon, en tournant le ballon pour un enrobage uniforme avec la solution enzymatique et incubez les cultures pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.

Neutralisez ensuite la réaction avec un à deux millilitres de milieu de culture. Collectez les cellules par centrifugation, en remettant en suspension la pastille dans le milieu de culture pour la sous-culture à une fois dix à quatre cellules par centimètre carré de densité de semis. Les cellules de la muqueuse du cordon ombilical et des cultures de gelée de Wharton présentent des valeurs d’efficacité de formation de colonies de 59 et 80 colonies respectivement.

Cependant, la valeur de l’efficacité de formation des colonies des cellules de la jonction moelle-placenta est similaire à celle observée pour les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse, ce qui suggère que les cellules dérivées de la jonction moelle-placenta ont des capacités de prolifération et d’auto-renouvellement plus élevées. Du côté de l’écoulement, une analyse métrique des suspensions de cellules uniques isolées de ces tissus périnataux indique que les pourcentages de cellules positives pour des marqueurs spécifiques de cellules souches mésenchymateuses provenant des quatre sources tissulaires sont similaires à ceux exprimés par les cellules mésenchymateuses standard dérivées de la moelle osseuse. Les rapports médians d’intensité de la fluorescence indiquent toutefois que les cellules dérivées de la gelée de Wharton et de la jonction corde-placenta sont très similaires ou supérieures à la muqueuse du cordon dans les cellules dérivées du placenta fœtal.

Il est intéressant de noter que, malgré leurs valeurs variables d’efficacité de formation de colonies, toutes les cellules des différentes sources périnatales expriment des niveaux similaires de marqueurs de pluripotence par analyse quantitative RTPCR, à l’exception des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la jonction corde-placenta, qui expriment les niveaux d’expression les plus élevés pour tous les marqueurs de pluripotence testés. De plus, les cellules stromales mésenchymateuses isolées de toutes les sources périnatales se différencient facilement en types de cellules adipogènes, chondrogènes et ostéogéniques, et ont démontré une différenciation trilinéaire. Bien que le potentiel de différenciation varie en fonction de la source des cellules stromales mésenchymateuses.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est exécutée efficacement. Lors de cette procédure, il est important de pratiquer la technique latérale et d’éviter la contamination croisée entre les sources tissulaires. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer la nature des niches de cellules souches dans les tissus périnataux.