Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta
3 avril 2017
Ici, nous présentons un protocole pour la dissection du cordon ombilical humain (UC) et l'échantillon de placenta fœtal en alignant le cordon (CL), la gelée de Wharton (WJ), de la jonction de cordon placenta (CPJ), et le placenta fœtal (FP) pour l'isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) en utilisant la technique de culture des explants.
L’objectif global de ce protocole est d’isoler les cellules stromales mésenchymateuses de quatre sources distinctes de tissus périnataux, la muqueuse du cordon ombilical, la gelée de Wharton, la jonction corde-placenta et le placenta fœtal. Cette méthode peut aider à faire progresser le domaine de la biologie des cellules souches, de la médecine alternative en obtenant des cellules souches mésenchymateuses de qualité spéciale, de manière non invasive. Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit de manière productive un grand nombre de populations cellulaires homogènes de haute qualité à partir de sources de tissus périnataux distinctes.
Les cellules stromales mésenchymateuses de cordon multipotentes dérivées de cette technique peuvent être utilisées pour traiter diverses maladies et troubles car elles sont plus primitives que les cellules souches mésenchymateuses isolées des tissus adultes. Cette méthode peut donner un aperçu des caractéristiques des cellules stromales mésenchymateuses de différents segments et de niches spécifiques du cordon et du placenta. Commencez par placer l’échantillon dans une boîte de Pétri de 150 millimètres sur de la glace dans une enceinte de sécurité biologique et utilisez une aiguille et une seringue pour rincer le tissu plusieurs fois avec du PBS glacé.
Lorsque tous les caillots sanguins ont été retirés, examinez soigneusement l’échantillon pour identifier les différentes régions anatomiques. Ensuite, utilisez une pince pour saisir l’extrémité fœtale du cordon ombilical et utilisez des ciseaux pour faire soigneusement une incision au sommet de la jonction cordon-placenta. Faites une deuxième incision sous la jonction pour séparer la jonction cordon-placenta du placenta.
Et divisez les tissus séparés en boîtes de Pétri individuelles. Ensuite, coupez le cordon ombilical longitudinalement pour exposer complètement les vaisseaux sanguins et la gelée de Wharton environnante sans perturber l’épithélium. À l’aide d’un scalpel, grattez la gelée de Wharton pour l’éloigner des vaisseaux sanguins et de l’interépithélium du subamnion.
Ensuite, retirez les vaisseaux sanguins, transférez toute gelée périvasculaire restante sous et autour des vaisseaux sanguins dans le bol de gelée de Wharton et placez le tissu restant de la muqueuse du cordon dans son propre bol. Lorsque tous les tissus ont été disséqués, remplacez le PBS dans chaque boîte par trois à cinq millilitres de trypsine et utilisez des ciseaux pour couper chaque échantillon de tissu en morceaux d’un à deux millimètres pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Utilisez un microscope à contraste de phase pour observer la digestion partielle en visualisant la libération de cellules du tissu.
À la fin de la période de digestion partielle, neutralisez la trypsine avec un volume égal de milieu de culture et transférez les échantillons dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres. Laissez les morceaux de tissu reposer pendant trois minutes. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et mettez en plaques 15 à 20 morceaux de tissu partiellement digérés par échantillon dans des flacons de culture de tissus individuels de 75 centimètres carrés.
Ensuite, ajoutez neuf millilitres de milieu de culture pour une incubation de deux à trois jours à 37 degrés Celsius. Changez de milieu de culture après trois jours et examinez les xplants par microscopie à contraste de phase pour détecter la croissance cellulaire. Lorsque la croissance cellulaire atteint 70 % de confluence, dissociez les cellules dans un à deux millilitres de solution de trypsine par flacon, en tournant le ballon pour un enrobage uniforme avec la solution enzymatique et incubez les cultures pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.
Neutralisez ensuite la réaction avec un à deux millilitres de milieu de culture. Collectez les cellules par centrifugation, en remettant en suspension la pastille dans le milieu de culture pour la sous-culture à une fois dix à quatre cellules par centimètre carré de densité de semis. Les cellules de la muqueuse du cordon ombilical et des cultures de gelée de Wharton présentent des valeurs d’efficacité de formation de colonies de 59 et 80 colonies respectivement.
Cependant, la valeur de l’efficacité de formation des colonies des cellules de la jonction moelle-placenta est similaire à celle observée pour les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse, ce qui suggère que les cellules dérivées de la jonction moelle-placenta ont des capacités de prolifération et d’auto-renouvellement plus élevées. Du côté de l’écoulement, une analyse métrique des suspensions de cellules uniques isolées de ces tissus périnataux indique que les pourcentages de cellules positives pour des marqueurs spécifiques de cellules souches mésenchymateuses provenant des quatre sources tissulaires sont similaires à ceux exprimés par les cellules mésenchymateuses standard dérivées de la moelle osseuse. Les rapports médians d’intensité de la fluorescence indiquent toutefois que les cellules dérivées de la gelée de Wharton et de la jonction corde-placenta sont très similaires ou supérieures à la muqueuse du cordon dans les cellules dérivées du placenta fœtal.
Il est intéressant de noter que, malgré leurs valeurs variables d’efficacité de formation de colonies, toutes les cellules des différentes sources périnatales expriment des niveaux similaires de marqueurs de pluripotence par analyse quantitative RTPCR, à l’exception des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la jonction corde-placenta, qui expriment les niveaux d’expression les plus élevés pour tous les marqueurs de pluripotence testés. De plus, les cellules stromales mésenchymateuses isolées de toutes les sources périnatales se différencient facilement en types de cellules adipogènes, chondrogènes et ostéogéniques, et ont démontré une différenciation trilinéaire. Bien que le potentiel de différenciation varie en fonction de la source des cellules stromales mésenchymateuses.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est exécutée efficacement. Lors de cette procédure, il est important de pratiquer la technique latérale et d’éviter la contamination croisée entre les sources tissulaires. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer la nature des niches de cellules souches dans les tissus périnataux.
Aperçu
Ce protocole décrit la dissection du cordon ombilical humain et du placenta fœtal afin d'isoler des cellules souches mésenchymateuses (CSM) par la technique de culture d'explant. La méthode permet la caractérisation des CSM provenant de sources tissulaires périnatales distinctes, contribuant ainsi aux progrès en biologie des cellules souches.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des cellules souches
- Médecine régénérative
- Techniques de culture cellulaire
Contexte
- Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) possèdent un potentiel thérapeutique en raison de leur pluripotence.
- Les tissus périnatals constituent des sources riches en CSM primitives.
- Ce protocole vise à augmenter le rendement de CSM de haute qualité à partir du cordon ombilical et du placenta.
- La compréhension des caractéristiques des CSM provenant de différentes sources tissulaires peut orienter leurs applications cliniques.
Objectif de l'étude
- Isoler des CSM à partir de l'épithélium du cordon ombilical, de la gelée de Wharton, de la jonction cordon-placenta et du placenta fœtal.
- Évaluer la qualité et les caractéristiques des CSM provenant de ces tissus.
- Proposer une méthode non invasive pour obtenir des CSM à des fins de recherche et thérapeutiques.
Méthodes utilisées
- Disséction du cordon ombilical et du placenta en régions anatomiques distinctes.
- Utilisation de la trypsine pour la digestion partielle des échantillons de tissus.
- Culture des tissus disséqués dans des conditions spécifiques de milieu.
- Évaluation de la croissance cellulaire et caractérisation par microscopie et cytométrie en flux.
Résultats principaux
- Une efficacité élevée de formation de colonies observée chez les cellules du gel de Wharton et de la jonction cordon-placenta.
- Toutes les CSM exprimaient des marqueurs de pluripotence similaires, avec des variations au niveau de l'expression.
- Les CSM ont démontré la capacité de se différencier en plusieurs lignées.
- La technique peut être réalisée efficacement en deux à trois heures.
Conclusions
- Ce protocole fournit une méthode fiable pour isoler des MSC de haute qualité à partir de tissus périnataux.
- La compréhension des propriétés des MSC provenant de différentes sources peut améliorer leurs applications thérapeutiques.
- Il est recommandé d'approfondir l'exploration des niches de cellules souches dans les tissus périnataux.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet l'isolement de cellules souches mésenchymateuses (CSM) à partir de différentes sources de tissus périnatals, offrant une alternative non invasive et éthiquement favorable aux CSM issues de la moelle osseuse. En comparant des régions anatomiques telles que la jonction cordon-placenta (JCP), la gelée de Wharton (GW), l'enveloppe du cordon (EC) et le placenta fœtal (PF), cette méthode soutient la validation ciblée et la réduction des risques mécanistiques dans les filières de médecine régénérative. L'efficacité accrue de formation de colonies et l'expression de marqueurs de pluripotence observées dans les CSM dérivées de la JCP offrent une prédiction fiable pour les applications en thérapie cellulaire, facilitant ainsi l'identification de candidats thérapeutiques et le tri des portefeuilles de développement.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en isolant des cellules souches mésenchymateuses (CSM) à partir de niches périnatales distinctes présentant des capacités variables de prolifération et d'auto-renouvellement.
- Valeur opérationnelle : Contribue à la réduction des risques biologiques grâce à la validation fonctionnelle de la multipotence au sein des lignées adipeuse, chondrogène et ostéogénique.
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la cible en identifiant le CPJ comme une source puissante de CSM, dotée d'une efficacité supérieure en termes de formation de colonies et d'expression des marqueurs de pluripotence.
Développement de criblages et de tests
- Valeur opérationnelle : Prépare des systèmes biologiques validés pour des procédés en aval en produisant des populations homogènes de cellules souches mésenchymateuses adhérentes présentant un profil défini de marqueurs d'expression membranaires (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105).
- Valeur scientifique : Contribue à la standardisation et à la reproductibilité des tests grâce à des techniques de culture d’explant cohérentes et à des paramètres quantitatifs tels que l’efficacité de formation de colonies et les mesures de cytométrie en flux.
- Valeur opérationnelle : Met en évidence la préparation au criblage et la possibilité de montée en échelle, le protocole étant réalisé en deux à trois heures, permettant ainsi une évaluation fiable de composés dans des séries de criblage préclinique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Aborde la pertinence pour les maladies et l'alignement des biomarqueurs translationnels en démontrant la capacité de différenciation trilignée, un paramètre fonctionnel clé pour la validation préclinique.
- Valeur opérationnelle : Décrit la continuité allant de la découverte à la validation préclinique en fournissant des MSC qui conservent une morphologie adhérente de type fibroblastoïde ainsi qu'une expression des marqueurs membranaires comparable à celle des MSC dérivés de la moelle osseuse.
- Valeur scientifique : Met l'accent sur la valeur prédictive de réduction des risques en montrant que les CPJ-MSC se différencient plus efficacement que ceux provenant d'autres sources, ce qui appuie les décisions d'avancement ajustées au risque.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de la phase de découverte précoce à l'identification de candidats et aux travaux précliniques, en soutenant la vérification d'hypothèses, la clarification des voies biologiques et la réduction des risques biologiques grâce à l'isolement de cellules souches mésenchymateuses (MSC) avec une résolution anatomique.
- Découverte en biologie : Explique comment la méthode soutient la vérification d'hypothèses et l'élucidation de voies biologiques en permettant la comparaison des propriétés des cellules souches mésenchymateuses (CSM) provenant de l'épithélium du cordon ombilical, de la gelée de Wharton, de la jonction cordon-placenta et du placenta fœtal.
- Essais de dépistage : Décrit la préparation des tests, leur reproductibilité et leurs résultats quantitatifs, tels que l'efficacité de formation de colonies (59 pour CL, 80 pour WJ, similaire à celle de la MO pour CPJ) et l'analyse de l'expression des marqueurs par cytométrie en flux.
- Analytique : Met en évidence des mesures telles que l'efficacité de formation de colonies, les rapports d'intensité de fluorescence et la RT-PCR quantitative des marqueurs de pluripotence, qui aident les équipes à comparer les conditions expérimentales et à évaluer leur valeur prédictive.
- Recherche translationnelle : Relie la méthode à la continuité préclinique en démontrant la différenciation des CSM en lignées adipoïgènes, chondrogéniques et ostéogéniques, soutenant ainsi l'alignement des biomarqueurs et la validation fonctionnelle.
- Réutilisation institutionnelle : Présente la méthode comme une capacité réutilisable plutôt qu'une technique à usage unique, permettant une standardisation entre différentes sources de tissus périnatals afin d'assurer un approvisionnement constant en CSM pour les programmes de médecine régénérative.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles et réduction de l'ambiguïté mécanistique grâce à l'isolement anatomiquement résolu des CSM et à leur caractérisation fonctionnelle.
- Valeur opérationnelle : Standardisation, reproductibilité et évolutivité par le biais de cultures d'explantats, de paramètres de digestion définis et d'une densité d'ensemencement constante (1×10⁴ cellules/cm²).
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'avancement ou d'abandon, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée en identifiant précocement des sources de CSM à haute puissance, comme le CPJ, lors de la phase de découverte.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur les différences de prolifération, d'auto-renouvellement et d'efficacité de différenciation entre les sources de CSM périnatales.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Une expertise scientifique requise en dissection tissulaire, culture cellulaire stérile et cytométrie en flux pour l'analyse des marqueurs.
- Les besoins en instrumentation et en infrastructure analytique comprennent la microscopie en contraste de phase, des centrifugeuses, des incubateurs (37°C, 5 % CO₂) et des cytomètres en flux pour l'évaluation des marqueurs CD et de l'intensité de fluorescence.
- Les exigences de standardisation entre équipes impliquent des protocoles de dissection tissulaire, une neutralisation de la trypsine et des densités de semis cohérents afin d'assurer la reproductibilité entre laboratoires.
- Les considérations d'adaptation selon les systèmes modèles incluent l'ajustement de la taille des explants et du temps de digestion en fonction de la source tissulaire, car la cinétique de migration varie (3 à 4 jours pour CPJ, 7 à 10 jours pour CL/WJ, 11 à 14 jours pour FP).
- Les limitations pratiques appuyées par les données sources incluent la nécessité d'éviter toute contamination croisée entre les sources tissulaires durant la dissection, ainsi que la variabilité de l'efficacité de formation de colonies et de la cinétique de migration selon les régions anatomiques.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Human Umbilical Cord (UC), Cord-Placenta Junction (CPJ), and Fetal Placenta (FP) Processing and Cell Isolation
6:21
Conclusion
4:29
Results: Colony-Forming Efficiency and Mesenchmyal Stromal Cell (MSC) Marker Expression of Perinatal Tissue-Isolated Cells
