Name: Préparation de silice fonctionnelle en utilisant une méthode de Bioinspired (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez la synthèse de silice bioinspirée pour l'immobilisation d'enzymes en utilisant une méthode rapide et écologique. Ce protocole permet d'encapsuler des biomolécules in situ avec un rendement de 58%.

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Les auteurs remercient l’appui financier de la département de chimie et génie biologique (Université de Sheffield) et l’EPSRC (EP/L017059/1 et EP/P006892/1).

1. préparation du précurseur des Solutions (et Solutions d’encapsulation en option)
<ol><li>Dans un récipient en plastique de 180 mL, mesurer 1,5 mmol de silicate de sodium pentahydrate (318,2 mg) et les dissoudre dans 20 mL d’eau désionisée.</li>
	<li>De même, dans un deuxième contenant, mesurent 0,25 mmol d’hexamine pentaéthylène (PEHA, 58,1 mg) et dissoudre dans 20 mL d’eau désionisée.<ol>
<li>Lors de l’utilisation de rechange contenant des amines composés p. ex.diéthylènetriamine (DETA) ou triéthylènetétramine (TETA), s’assurer que le rapport molaire de Si:N total reste constant à 1 (i.e., correspondant à 0,5 mmol de DETA ou 0,375 mmol de TETA dans la procédure décrite)15.</li>
		<li>Lorsque vous utilisez amine polymère additifs par exemple,poly(ethyleneimine) (PEI) ou poly(allylamine hydrochloride) (HAP), maintenir une concentration de 1 mg/mL (volume de réaction finale)15. ATTENTION : Manipulez ces amines uniquement à l’intérieur d’une hotte aspirante, car ils sont corrosifs ou toxiques dans leurs formes pures (en particulier comme les vapeurs).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour effectuer sur place l’encapsulation au cours de la synthèse, dissoudre une masse prédéterminée de protéine (ici 50 mg d’albumine sérique Bovine, BSA) dans 5 mL d’eau désionisée. Soustraire cette quantité d’eau sur le volume d’eau déionisée à utiliser pour la dissolution du silicate de sodium pentahydrate.<ol>
<li>Pour faciliter la dissolution de la protéine sans modifier sa structure, une fois mélangé à l’eau désionisée, boucher le récipient et conserver à 4 ° C. Vérifiez occasionnellement sur les progrès de la dissolution, de préférence sans agitation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. silice synthèse
<ol><li>Combiner les solutions de silicate de sodium pentahydraté et PEHA dans l’un du conteneur de 180 mL et ajouter suffisamment d’eau déionisée pour faire la finale solution volume 41 mL (ou 46 si in situ encapsulation est omise).</li>
	<li>Placer le mélange fraîchement préparés du silicate de sodium et solutions PEHA sur le dessus une plaque agitateur, ajout d’une barre d’agitateur pour fournir un mélange uniforme.</li>
	<li>Dans ce vaisseau, suspendre une sonde pH et enregistrer le pH initial.<ol>
<li>À ce stade, vous pouvez également supprimer une quantité de 750 µL du mélange départ pour détermination ultérieure de la concentration initiale de [Si] en utilisant le dosage spectrophotométrique bleu de molybdène, tel que décrit à l’étape 8.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Commencer la synthèse en ajoutant une quantité prédéterminée de 1 M HCl, calculé à partir de la Figure 1et d’observer l’évolution immédiate de turbidité (voir Figure 2)</li>
	<li>Dès que l’addition d’acide est terminée, ajouter la solution d’enrobage (le cas échéant) aussi rapidement que possible. Remarque : Le volume final, compte tenu de ces quantités est 50 mL du mélange de réaction totale, conduisant à des concentrations de Si et de N de 30mM. Elle peut être ajustée comme vous le souhaitez en multipliant les quantités ci-dessus par une quantité constante.</li>
	<li>Enregistrer le pH après 5 min pour déterminer la fin de la réaction ; veiller à ce que le pH est de 7 ± 0,05.</li>
</ol>3. acide élution des matières
<ol><li>Modifier la composition de silice produite après que la réaction ait atteint fin (que ce soit comme un coagulum comme fabriqués soit en resuspendant un précédent échantillon synthétisé de silice) par l’addition d’acide supplémentaire.</li>
	<li>Si resuspendant silice, mélanger environ 150 mg préparés comme bioinspired de silice avec 100 mL d’eau désionisée dans un récipient en plastique de 180 mL et placer sur le dessus une plaque de l’agitateur.</li>
	<li>Une fois que la suspension est bien mélangée, suspendre une sonde pH dans la cuve.</li>
	<li>Titrer en outre HCl jusqu'à ce que le pH désiré (entre 7 et 2) a été atteint et permettre de stabiliser pendant env. 1 min.</li>
	<li>Attendre 5 minutes supplémentaire pour s’assurer que le système a parfaitement équilibrée et continuer à isoler la silice solide.</li>
</ol>4. silice séparation et séchage
<ol><li>Décanter la suspension de silice bioinspired dans des tubes à centrifuger 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger la suspension à 5 000 g pendant 15 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant après centrifugation et magasin pour une analyse ultérieure (par exemple, analyse de Bradford, voir ci-dessous). Remplir les tubes de centrifugeuse à l’eau désionisée et remettre en suspension la silice à l’aide d’un agitateur Vortex.</li>
	<li>Répéter deux fois la centrifugation, le surnageant stockage et remise en suspension.</li>
	<li>Après la centrifugation finale, éliminer le surnageant et racler la silice dans un creuset en céramique.</li>
	<li>Sécher dans une étuve pendant la nuit à 85 ° C.<ol>
<li>Si l’encapsulation a eu lieu, utiliser une installation de lyophilisation ou un four fonctionnant sous vide pour éviter la dénaturation de la protéine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. la production de molybdène bleu réactif (MBR) pour la détermination de [TR]
<ol><li>Une fiole jaugée de 1 L en plastique, ajouter 8 mmol (10 g) d’ammonium molybdate tétrahydraté dans une hotte.</li>
	<li>Cela dissoudre dans 500 mL d’eau désionisée sous agitation.</li>
	<li>Acidifier la solution en ajoutant soigneusement 60 mL de solution d’HCl 10 M.</li>
	<li>Ajuster le volume final à 1 L.</li>
</ol>6. production de para-aminophénol sulfate réducteur (RA) pour la détermination de [TR]
<ol><li>Placer une fiole jaugée de 500 mL verre dans un bain d’eau à température ambiante dans une assiette d’agitateur dans une hotte.</li>
	<li>Ajouter 111 mmol (10 g) de l’acide oxalique anhydre, 19,5 mmol (3,35 g) du sulfate de para-aminophénol et 16 mmol (2 g) de sulfite de sodium et se dissout dans 250 mL d’eau.</li>
	<li>Soigneusement et lentement ajouter 92 g (50 mL) d’acide sulfurique saturé tout en remuant et attendez que la solution refroidir.</li>
	<li>Enfin, diluer dans 500 mL d’eau désionisée.</li>
</ol>7. Silicomolybdic acide dosage sur les espèces de silice monomère
<ol><li>Dans un flacon en plastique de 5 mL, diluer 300 µL de bromure de méthyle produites à l’étape 5.4 avec 3 mL d’eau désionisée.</li>
	<li>Ajouter 10 µL d’une solution de test de l’acide silicique et agiter pour mélanger. Remarque : Cette solution devient lentement jaune.</li>
	<li>Après exactement 15 minutes, ajouter 1,6 mL de l’agent réducteur, préparé à partir d’article 6 afin de réduire le silicomolybdate jaune complexe en son isomère bleu.</li>
	<li>Laisser une couleur bleue se développer pour au moins 2, mais pas plus de 24h.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance d’échantillon à 810 nm dans un spectrophotomètre UV-vis et calculer [Si] contre une courbe d’étalonnage.</li>
</ol>8. Silico molybdique dosage acide sur les espèces de silice polymérique
<ol><li>Pour mesurer la concentration d’espèces polysilicate à l’aide de la méthode du bleu de molybdène, dans un tube de microcentrifuge, combiner 750 µL de solution d’hydroxyde de sodium de 2 M avec 750 µL de suspension de silice.</li>
	<li>Seal et les place dans un flotteur de microcentrifuge.<ol>
<li>S’assurer que l’espace libre suffisant est laissé dans le tube pour éviter l’éclatement en raison de l’accumulation de pression. Remarque : Un espace de 500 µL est généralement suffisant pour éviter ce problème. Par ailleurs, la procédure est réalisable dans des flacons ouverts tant que perte de liquide due à l’évaporation est prise en compte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flotter les tubes de microcentrifuge dans un bain d’eau chauffé à 80 ° C et laissez-le se dissoudre pendant 1 h.</li>
	<li>Après que 1 h est écoulé, retirer les tubes de microcentrifuge et essuyez l’extérieur.</li>
	<li>Une fois refroidie, [Si] peut être déterminé comme décrit ci-dessus, comme décrit aux étapes 7,2 à 7,5.</li>
</ol>9. Bradford mode opératoire pour la détermination de la Concentration de protéines en silice
<ol><li>Insérer un nombre prédéterminé de réactif (température ambiante), Bradford et échantillon dans chaque cuvette assigné (voir tableau 1 et tableau 2 pour les volumes spécifiques). Pointes de pipette jetable pour chaque cuve permet d’éviter des modifications de volume en raison de la nature du réactif et répéter chaque point en triple exemplaire.</li>
	<li>Mélanger chaque cuvette en retournant 3 fois et laisser pour développer pendant 10 min.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance à 595 nm à l’aide de surnageant pure comme blanc.</li>
	<li>Calculer l’absorbance original de chaque cuve en soustrayant chaque mesure de l’absorbance trouvé pour l’échantillon de contrôle (cuve no 0 dans les deux essais).</li>
	<li>Calculer la concentration de protéines de l’échantillon inconnu à l’aide d’une courbe d’étalonnage (Figure 3). En cas de dilution de l’échantillon initial, le facteur de dilution doit être pris en compte.<ol>
<li>Créer une courbe d’étalonnage pour chaque série d’expériences par traçage absorbance mesurée contre la concentration de BSA pour éviter des fluctuations aléatoires qui pourraient affecter la sensibilité de l’essai.</li>
		<li>Bien que cette analyse de la protéine est censée utiliser BSA en tant que norme pour chiffrer n’importe quel type de protéine, créer une courbe d’étalonnage pour chaque protéine spécifique d’intérêt pour une meilleure précision.</li>
		<li>Si la teneur en protéines de l’échantillon inconnu est censée être supérieure à la plage couverte de la courbe d’étalonnage, le diluer au besoin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déterminer la teneur en protéines pour chaque échantillon au cours de la remise en suspension pour surveiller la perte possible de la protéine.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrente.

Dans les travaux en cours, nous présentons une méthode pour rapidement précipiter bioinspired silice matières et encapsulation de biomolécules qui y sont. Nous démontrons des étapes cruciales dans la procédure, soit la somme de déclenchant les réaction acide à ajouter et le moment de l’addition de l’encapsulation de la biomolécule. Nous montrons l’effet du montant de l’addition d’acide sur la progression de la réaction et le rendement (Figure 4 et Figure 5, respectivement) et a démontré une méthode pour un contrôle strict des conditions de synthèse, permettant la cohérence malgré cette sensibilité. Concernant les espèces actives encapsulation, bien que simples en termes de procédure, encapsulation est indiquée comme étant sensibles aux conditions de l’expérience (ordre d’ajout, pH d’addition, les conditions environnementales), cependant, la cohérence en matière Propriétés est à nouveau réalisable.
Les conditions de synthèse peuvent être modifiées par l’utilisation de différents additifs, dont bon nombre ont été publiés ailleurs,15 fournissant un éventail de morphologies et de porosités. En outre, les synthétiques techniques pour modifier et adapter chimiquement bioinspired matériaux de silice ont été signalés tels que la décoration de purification légère13 et surface d’amine. 20 Enfin, en raison du caractère doux, aqueux, de la synthèse, in situ l’encapsulation est possible pour un large éventail de substrats que celles démontré ici, allant des enzymes17,18 à cellules entières,21 sels métalliques,22 ingrédients pharmaceutiques actifs, points23 et quantique. 24
Contrairement à d’autres synthèses de silice organique-négociée (par exemple, la famille MCM-41 ou SBA-15 des matériaux), la nature polyfonctionnels de bioinspired ne peut pas produire des additifs classés pore structures, ni très monodispersés distributions granulométriques caractéristique de la silice type Stöber. 25 c’est faute de comportement micellisation bien défini de bioinspired additifs (en dehors des cas particuliers)26 couplé avec leur augmentation de l’activité catalytique sur les additifs contenant des amines monofonctionnel. 26
En revanche, cette nature additive polyfonctionnels permet d’utiliser des temps de réaction plus court et température plus doux & par rapport aux autres synthèses de silice organique par l’intermédiaire de la pression. Cela entraîne aussi la possibilité d’élution additif à température ambiante comme décrit ci-dessus, qui doit encore être réalisé pour ces autres familles de silice en raison de la spécificité de leur chimie de surface. 27 , 28 , 29 par conséquent, matériaux de silice bioinspired montrent à la fois plus économique et pratique pour produire à grande échelle, menant au développement et de commercialisation plus facile. 14
En résumé, synthèse de silice bioinspired représente une méthode rapide et facile pour produire des espèces actives appuie ou supports absorbants de gaz. Par une parfaite maîtrise du pH pendant et après la réaction, une vaste gamme de composites de silice-amine peut être synthétisée avec diverses propriétés, qui est encore complété par la possibilité d’in situ encapsulation d’un tableau des différents organique, matériaux inorganiques, ou bio-organique. Même si indépendante modification post synthétique d’additif de bioinspired et de la concentration de l’encapsulation doit encore être atteints, ces méthodes représentent une étape prometteuse vers des processus chimiques inoffensive pour l’environnement.

L’utilisation de la silice comme un soutien structurel de catalyseurs industriels est bien établie, ce qui permet l’activité du catalyseur améliorée, la stabilité et la traitabilité,1 par conséquent qui pourrait réduire les coûts d’exploitation. Ces avantages sont ajoutent dans le cas d’immobilisation d’enzymes, comme le stockage dans un système de pore de silice peut conférer des avantages considérables sur la vie de l’enzyme au cours de son homologue libre. En conséquence, beaucoup d’efforts ont été consacré à trouver la meilleure méthode pour fixer les enzymes aux espèces de silice, avec plusieurs clients en comparant les enquêtes à l’aide de différentes méthodes d’immobilisation sur des supports solides siliceux. 2 , 3 , 4
Enzymes sont généralement fixés par adsorption ou par liaison covalente, en plus de l’encapsulation dans un matériau poreux. 5 Toutefois, il y a des inconvénients significatifs associés à chaque méthode : physisorption s’appuie sur les interactions surfaces transitoires entre la silice et biomoléculaires, qui peut très facilement être affaibli par les conditions de la réaction conduisant à l’inacceptable lessivage de l’enzyme. Le beaucoup plus grand attachement covalent se traduit généralement par une activité plus faible en raison de la liberté conformationnelle réduite d’espèces actives. Encapsulation peut entraîner une activité réduite en raison de l’inaccessibilité de l’enzyme ou limitations de diffusionnelles. 6
Développements récents dans le domaine des synthèses de silice plus douces (souvent surnommé « bioinspired ») ont mis en place l’encapsulation in situ des biomolécules et des autres espèces actives au cours de la synthèse de matière. 7 , 8 , 9 cette méthode annule bon nombre des inconvénients de l’immobilisation conventionnelle - contrairement aux approches de la chimisorption la liberté conformationnelle de la biomolécule est maintenue par l’utilisation d’interactions non covalentes plus faibles, mais que les formes de cavité de pore autour la biomolécule, lessivage est encore entravée. En effet, encapsulation a été démontrée à travailler pour une gamme de biomolécules et cellules même entières,10 et par encapsulation dans des effets de silice bioinspired tels que désactivation due à des processus rigoureux des conditions peuvent être évitées. 7 , 11
L’objectif de la méthode décrite ici consiste à préparer une silice poreuse avec des propriétés contrôlables, dans des conditions ambiantes, en utilisant un additif organique bioinspired. La méthode peut être facilement modifiée pour inclure l’encapsulation de molécules inorganiques ou bioorganique, dont une sélection doit être indiquée. De plus, nous montrons une méthode facile pour modifier les matériaux synthétisés comme pour atteindre les propriétés désirées en vrac et purification en enlevant le modèle organique par élution acide.
Par rapport à la synthèse traditionnelle de silice poreuse basé sur un modèle prend en charge (p. ex.,matériaux de silice basé sur un modèle à travers des assemblages supramoléculaires agent tensio-actif comme MCM-41 ou SBA-15)12 , que cette méthode est nettement plus rapide et plus doux, ce qui permet adaptées, en situ encapsulation sans besoin de nombreuses étapes de l’immobilisation et la purification laborieuse. En outre, l’utilisation d’acide d’élution plutôt que calcination ouvre la possibilité de fonctionnalisation de surface organique.
Cette méthode est très applicable à ceux qui travaillent dans l’immobilisation des espèces actives qui ont trouvé une physisorption ou immobilisation covalente inefficaces. Il est également utile pour les recherches sur les processus mesurent-vers le haut comme la synthèse de bioinspired est particulièrement bien placée pour l’industrialisation par rapport aux matériaux conventionnels silice basé sur un modèle. 13 , 14 que cette méthode n’est pas recommandée pour les applications qui requièrent un tableau ordonné des pores dans la matière par exemple,pour la photonique, comme la structure des matériaux est désordonné malgré toute similitude dans les propriétés en bloc.

<table><tbody><tr><td><Synthèse de silice >forte</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicate de sodium pentahydraté</td><td></td><td>Fisher scientific 10070470</td><td></td></tr><tr><td>Pentaethylene hexamine (PEHA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>292753</td><td></td></tr><tr><td>Diethylenetriamine (DETA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D93856</td><td></td></tr><tr><td>Triethylenetetraamine toxique (TETA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90460</td><td></td></tr><tr><td>Poly(éthylèneimine) (Î.-P.-É)</td><td>Polysciences</td><td>6088</td><td>1,2K MW</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de poly(allylamine) (HAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>283215</td><td>17,5k MW</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl) 1M</td><td>Fisher Scientific</td><td>10487830</td><td></td></tr><tr><td>Dosage de l’acide silicolybdique</ fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ammonium molybdate tétrahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7302</td><td>Produit remplacé par M1019</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl) 37,0 % en poids</td><td>Fluka Analytical</td><td>84436</td><td></td></tr><tr><td>Acide oxalique anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75688</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de para-aminophénol</td><td>Fisher Scientific</td><td>10446880</td><td></td></tr><tr><td>Sodium sulfite</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234400</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84727</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autotitrator Titrando 902</td><td>Metrohm</td><td>2.902.0010</td><td></td></tr><tr><td>801 Plaque d’agitation magnétique</td><td>Metrohm</td><td>2.801.0040</td><td>Pour une utilisation avec ci-dessus</td></tr><tr><td>800 Dosino</td><td>Metrohm</td><td>2.800.0010</td><td>Pour une utilisation avec ci-dessus</td></tr><tr><td>Aquatrode Plus</td><td>Metrohm</td><td>6.0253.100</td><td>Pour une utilisation avec ci-dessus</td></tr><tr><td>Centrifuge Sorvall ST16</td><td>Thermo Scientific</td><td>11814243</td><td>Code est pour Fisher scientific</td></tr><tr><td>UV-Vis spectrophotomètre Genesys 10A</td><td>Thermo scientific</td><td>12104972</td><td>Code est destiné à Fisher scientific</td></tr></tbody></table>

préparation de silice fonctionnelle en utilisant une méthode de bioinspired

Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method

L’objectif des protocoles décrits dans les présentes est de synthétiser des matériaux de silice bioinspired, effectuer l’encapsulation de l’enzyme qui y sont et partiellement ou totalement le même purifier par élution acide. En combinant le silicate de sodium avec un additif de bioinspired polyfonctionnels, silice est rapidement formée aux conditions ambiantes à la neutralisation.
L’effet de neutralisation taux et biomolécule ajout point sur le rendement de la silice sont l’objet d’une enquête et l’efficacité de la biomolécule immobilisation est indiquée pour faire varier le point de l’addition. Contrairement aux autres méthodes de synthèse de silice poreuse, il est démontré que les conditions douces requises pour la synthèse de silice bioinspired sont entièrement compatibles avec l’encapsulation de biomolécules délicat. En outre, des conditions douces sont utilisées à travers toutes les étapes de la synthèse et la modification, rendant la silice bioinspired une cible prometteuse pour l’intensification et de la commercialisation comme un matériau nu et soutien actif moyen.
La synthèse est indiquée comme étant très sensibles aux conditions, c'est-à-dire, le taux de neutralisation et pH final de synthèse, toutefois serré la maîtrise de ces paramètres est démontrée par l’utilisation de méthodes de titrage automatique, conduisant à une reproductibilité élevée dans réactionnelle de la progression et du rendement.
Bioinspired de silice est donc un choix excellent soutien matériel actif, montrant la polyvalence vers nombreuses applications courantes, non limitées à ceux qui ont démontré ici et la puissance dans les futures applications.

Les techniques décrites ci-dessus peuvent systématiquement et de façon reproductible précipiter la silice. C’est plus facile à déterminer par l’apparition rapide de turbidité dans la cuve de réaction, qui, à la cessation de l’agitation, réglera spontanément dans un coagulum épais de silice précipitée (Figure 2). L’ampleur de la réaction et donc le rendement peut être confirmé par la mesure de la masse de ce coagulum après séparation et est généralement 58 ± 6,5 % (Figure 4, jaune).
Autre aperçu de la progression de la réaction peut être généré en adaptant la méthode spectroscopique bleu de molybdène pour mesurer la concentration d’espèces n’ayant pas réagi silicate monomère ainsi que les espèces qui ont réagi à former polysilicates ou « oligomères », mais n’ont pas réussi à atteindre une taille suffisante pour coaguler (Figure 4, bleu et rouge respectivement).
Ces données de spéciation de silice spécifique sont d’un intérêt particulier lors de la comparaison des efficacités de titration différent pour la réaction de précipitation - c'est-À-dire comment le pH final de réaction et la vitesse à laquelle notre est atteinte affecte la polymérisation de silice monomère pour une « oligomère » et sa coagulation subséquente à la silice solide. En modifiant la quantité d’acide ajouté au stade 2.4 légèrement, sous - ou over - titration du mélange réactionnel peut être réalisée (Figure 5). En mesurant la spéciation de silice à nouveau pour ces deux cas, une nette différence transparaît dans l’achèvement de la réaction (Figure 4) bien que des changements mineurs au profil de titration de la réaction (Figure 5).
Bien qu’aucune différence n’existe entre la consommation d’espèces monomères dans les cas de trois réaction (restant entre 29 et 33 %), il y a une nette différence d’un montant d’espèces d’oligomères de silice qui précipitent dans chaque cas. C’est en accord avec la doctrine traditionnelle sur sol-gel silices - dans le cas de « dépasser » le pH est maintenu plus élevé pour plus longtemps, permettant des particules individuelles de croître et ainsi aider la coagulation efficace ; dans le cas de « dépassement » la coagulation est induite beaucoup plus rapidement en raison de la titration rapide, donc moins de l’espèce de silice ont augmenté à une taille suffisante pour coaguler et resteront coincés dans la phase colloïdale. 16
Compte tenu de l’importance de titration lors de la formation de silice, a priori la connaissance du volume titrage approprié est essentielle. Bien que non extractible de la stoechiométrie de la réaction en raison du comportement complexe protonation des additifs amine et changement d’acidité surface de silice sur la coagulation, des relations empiriques très fiables entre le contenu du système, les concentrations et les volumes de titre sont facilement générés (Figure 1).
Une fois terminée la coagulation, surfaces des matériaux sont facilement modifiables grâce à l’utilisation d’acide d’élution, comme l’a récemment signalé par ailleurs, les auteurs. 13 Ceci permet d’affiner des propriétés matérielles telles que la composition, la porosité et l’activité chimique d’additif (Figure 6 a et b).
Dans cette étude, BSA a été utilisé comme une enzyme d’encapsulation exemplar, toutefois, les techniques décrites ici peuvent servir pour plusieurs enzymes17,18. La procédure suivie pour la détection de la protéine est le protocole d’essai de Bradford,19 en utilisant les fractions surnageantes stockés de chaque cycle de centrifugation. La quantité de protéine dans le liquide surnageant est calculée à l’aide d’une courbe d’étalonnage, créée à partir des quantités connues de BSA dissous dans le liquide surnageant d’un échantillon avec zéro teneur en protéines (témoin). La quantité de protéines encapsulé en silice équivaudra en soustrayant de la protéine détectée dans les surnageants de la quantité initiale de protéine ajoutée. Le seul réactif nécessaire pour le dosage est le réactif de Bradford (achetés ou fabriqués selon des recettes standards).
Il existe trois types de format de test, selon le volume de l’échantillon, la quantité prévue de protéines pour être détectée et la méthode de mesure utilisée. Dans les présentes, le format de suivi est spécifié pour un spectrophotomètre, exige des cuvettes jetables des macro et micro taille et peut détecter de 10 µg/mL à 1,4 mg/mL de protéine.
Dans la Figure 7 , la quantité de protéines détectées après chaque lavage (étape 4.3) est montrée comme un % du montant initial de protéines (soit 50 mg). Environ environ 50 % des BSA a été détectée dans le surnageant après la centrifugation première, ce qui a trait à l’efficacité de l’immobilisation d’environ 50 %. Comme il n’y avait qu'aucun BSA ne détectés dans les lavages suivants, que BSA (ou n’importe quel autre enzyme) pourrait être solidement encapsulé au cours de la synthèse de la silice avec aucun lessivage - c’est un avantage important de cette méthode. Afin de confirmer la présence de BSA dans la silice produite, analyse de Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) a été réalisée. La présence des bandes caractéristiques d’amide I et II dans l’espace de 1 500/cm et 1650/cm (Figure 8) dans les échantillons préparés en présence de BSA, mais pas dans le contrôle des échantillons (aucun BSA) a confirmé la présence de BSA dans les solides.
Outre la méthode d’ajout d’enzyme décrite ci-dessus (BSA ajouté pendant la neutralisation du mélange réactionnel), il y a autre ajout variations possibles par exemple,BSA lors du mélange du silicate et des solutions additives, avant la neutralisation ou d’une enzyme ajouté à la solution de silicate ou additif avant leur mélange et la neutralisation. Certaines de ces possibilités ont été étudiées plus loin et l’efficacité de l’immobilisation (masse de BSA immobilisé comme un pourcentage d’enzyme ajouté au système de réaction, calculé basé sur l’analyse de Bradford) et la quantité de BSA dans la silice finale étaient mesurées ( concentration de BSA en silice sous forme de pourcentage du poids total composite produit, voir Figure 9). Il est clair que lorsque BSA a été ajouté pour les réactifs n’ayant pas réagis (cas A-C de la Figure 9) il n’y a pas de différences considérables dans l’efficacité de l’immobilisation ou la quantité de BSA dans le composite qui en résulte. Toutefois, lorsque BSA est ajouté pendant la formation de silice (cas D dans la Figure 9), efficacité de l’immobilisation et la quantité de BSA dans le produit final étaient significativement plus faible. Malgré ces différences, la quantité moyenne de silice produite est demeurée inchangée (entre 85-90 mg). Ces observations peuvent s’expliquer sur la base de l’ionisation (ou point isoélectrique) de BSA, silicate/silice et l’additif. Les différentes méthodes d’addition permettent différentes interactions entre les précurseurs enzymatiques et de silice. Lorsque le pH lors de l’ajout des modifications enzymatiques, l’ionisation de chaque espèce détermineront les interactions intermoléculaires, qui à son tour vont contrôler l’efficacité de l’immobilisation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>N° de cuve</td>
			<td>Concentration de la surface corporelle (mg/mL)</td>
			<td>Réactif de Bradford (mL)</td>
			<td>Échantillon (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>0 (témoin)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0,1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>0.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>0,5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0,75</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Échantillon inconnu (X)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Macro Bradford test installation et volumes composant calculé. Valable pour détermination gamme 0.1-1.4mg/mL (volumes pour la 1 réplique)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>N° de cuve</td>
			<td>Concentration de BSA (ug/mL)</td>
			<td>Réactif de Bradford (mL)</td>
			<td>Échantillon (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>0 (témoin)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>7.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Échantillon inconnu (X)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2: Bradford Micro dosage montage et volumes composant calculé. Valable pour la détermination allant de 1 à 10 µg/mL (volumes pour la 1 réplique)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig1.jpg"> Figure 1 : Volume titre contre la concentration de silice pour les systèmes de réaction utilisant PEHA comme additif ou DETA requis. La silice a été synthétisée à des concentrations variables tout en conservant un [N] : rapport [Si] 1, pour deux différents produits additifs chimiques. Barres d’erreur sont un écart-type autour de la moyenne. 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig2.jpg"> Figure 2 : Photographies du coagulum de silice dans la cuve de réaction (a) pendant et (b) après avoir agité, ce qui démontre la turbidité de la solution et de décantation qui sont le signe d’une réaction optimale.  
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig3.jpg"> Figure 3 : Courbe d’étalonnage exemplaire pour analyse macro Bradford. Surnageant de synthèse de silice bioinspired en absence de BSA est mélangée avec une quantité connue de la protéine, après quoi l’analyse de Bradford est jouée comme indiqué au point 9.1.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig4.jpg"> Figure 4 : États de polymérisation finale des espèces de silice pour différentes conditions de réaction. La silice est synthétisée à l’aide de conditions optimales (de base), ainsi qu’avec la sur - ou sous titrage, après quoi, concentration de silice relative est quantifiée pour les silicates monomère ou dimérique (rouge), polysilicate « oligomères » (bleu) et de coagulation instable silice (jaune).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig5.jpg"> Figure 5 : Progression de pH par système de réaction en fonction du volume du titre initial. L’acide est immédiatement dosée après env. 38 s de mélange, causant le pH à descendre rapidement sous 8. Par la suite, outre des quantités d’acide sont automatiquement dosées tels que le pH était de 7,0 ± 0,05 300 s après ajout initial. Dans le cas de titration trop, ce n’était pas réalisable, car la dose initiale ne suffisait pas à baisser le pH inférieur à 7, atteignant pH 6,65 après 300 s. Volume initial de HCl ajouté pour « sous-dépassement, » « de base », et « dépassement » était de 6,90 7.05 et 7,20 mL respectivement.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig6.jpg"> Figure 6 : Modifications de la propriété représentant sur l’acidification des matières coagulées silice. b changement de concentration additif en ce qui concerne le pH et (b) modification de la porosité de la silice à l’égard de pH. Reproduit de Manning et al. 13 aux termes de la licence Creative Commons. 
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig7.jpg"> Figure 7 : Concentration de BSA dans les surnageants de synthèse de silice bioinspired. Bradford essais ont été effectués sur les surnageants de réaction après centrifugation, d'où la quantité relative restante (donc obstrués de la silice synthétique) a été déterminée.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig8.jpg"> Figure 8 : Analyse FTIR sur silice bioinspired avec et sans encapsulation espèces actives. Spectres a montré : black line : ligne de silice, gris bioinspired : pure BSA, ligne bleue : bioinspired silice doté de BSA. Lignes pointillées verticales indiquent les groupes amide caractéristique. 
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig9.jpg"> Figure 9 : Efficacité de l’immobilisation et la quantité de BSA dans le composite pour la silice produisent à l’aide de PEHA. BSA a été ajouté (A) dans la solution PEHA avant de le mélanger avec du silicate, (B) dans la solution de silicate avant de les mélanger avec la PEHA, (C) après un mélange initial de solutions PEHA et silicate et (D) après avoir mélangé PEHA et silicate solutions et neutralisant. L’efficacité est mesurée en % de BSA encapsulé du mélange réactionnel en proportion du total BSA ajoutée, tandis que BSA en silice signifie concentration % de BSA en composite final de silice en masse. Barres d’erreur sont un écart-type autour de la moyenne.

Nous présentons ici un protocole pour synthétiser des matériaux de silice bioinspired et immobiliser les enzymes qui y sont. La silice est synthétisée en combinant le silicate de sodium et d’une amine « additive », qui neutralisent à une vitesse contrôlée. Fonctions et propriétés des matériaux peuvent être modifiés par in situ l’immobilisation enzymatique ou synthétique après élution acide des additifs encapsulés.

Préparation de silice fonctionnelle en utilisant une méthode de Bioinspired

The goal of the protocols described herein is to synthesize bioinspired silica materials, perform enzyme encapsulation therein, and partially or totally ...

Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est rapide, facile, respectueuse de l’environnement et qu’elle permet d’adapter les matériaux. Cette méthode peut donner un aperçu de la formation de la silice bio-inspirée, des voies disponibles d’incorporation des biomolécules et du traitement post-synthétique des matériaux. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la formation de silice est rapide et une quantité spécifique d’acide doit être ajoutée rapidement afin d’obtenir des résultats optimaux.Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons réalisé à quel point elle était douce, de sorte que les conditions étaient compatibles avec les enzymes. Nous avons pensé à utiliser cette méthode pour améliorer les performances et la stabilité des enzymes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’étape de neutralisation de l’acide est la plus importante pour les propriétés finales du matériau.Tout d’abord, pesez 318,2 milligrammes de silicate de sodium pentahydraté dans un récipient en plastique de 180 millilitres et dissolvez-le dans 20 millilitres d’eau déminéralisée. Dans un deuxième récipient, peser 58,1 milligrammes de pentaéthylène hexamine ou PEHA et dissoudre dans 20 millilitres d’eau déminéralisée. Soustrayez cette quantité d’eau du volume d’eau déminéralisée à utiliser pour la dissolution du silicate de sodium pentahydraté.Pour effectuer l’encapsulation in situ pendant la synthèse, dissolvez une masse prédéterminée de protéines dans cinq millilitres d’eau désionisée et placez la solution au réfrigérateur pour une dissolution totale. Vérifiez de temps en temps la progression de la dissolution, de préférence sans remuer. Combinez les solutions de silicate de sodium, de pentahydrate et de PEHA dans l’un des récipients et ajoutez suffisamment d’eau désionisée pour obtenir un volume de solution finale de 41,5 millilitres.Placez le mélange fraîchement préparé sur le dessus d’une plaque d’agitation et ajoutez une barre d’agitation pour assurer un mélange cohérent. Ensuite, suspendez une sonde de pH dans la solution d’agitation et enregistrez le pH initial. Commencer la synthèse en ajoutant une quantité prédéterminée d’acide chlorhydrique unimolaire et observer l’évolution immédiate de la turbidité.La première étape critique est l’ajout rapide d’acide pour initier la formation de silice. Le pH doit être abaissé à sept le plus rapidement possible. Si l’encapsulation a lieu, ajoutez la solution d’encapsulation dès que l’ajout d’acide est terminé.Enregistrez ensuite le pH après cinq minutes pour déterminer la fin de la réaction. Une fois la réaction terminée, modifiez la composition de la silice produite en ajoutant plus d’acide chlorhydrique au mélange jusqu’à ce que le pH souhaité entre deux et sept soit atteint et laissez la suspension se stabiliser pendant environ une minute. Ensuite, décantez la suspension de silice bioinspirée dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres, puis centrifugez la suspension à 5 000 g pendant 15 minutes.Après la centrifugation, retirer le surnageant et le stocker pour une analyse plus approfondie. Remplissez les tubes de centrifugation avec de l’eau désionisée et remettez la silice en suspension à l’aide d’un mélangeur vortex. Dans le cas de l’incorporation de biomolécules, une étape critique consiste à donner les surnageants issus d’un lavage de silice bioinspiré afin d’être analysés plus avant.Après avoir répété deux fois les étapes de centrifugation et de remise en suspension, retirez le surnageant et raclez la silice dans des creusets en céramique. Faites sécher la silice dans un four pendant la nuit à 85 degrés Celsius. Dans un flacon en plastique de cinq millilitres, diluez 300 microlitres de réactif de bleu de molybdène préalablement préparé avec trois millilitres d’eau déminéralisée.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de solution d’essai d’acide liquide liquide et agitez pour mélanger. Après 15 minutes, ajoutez 1,6 millilitre d’agent réducteur de sulfate de para-aminophénol préalablement préparé pour réduire le complexe silicomolybdate jaune en son isomère bleu. Ensuite, mesurez l’absorbance de l’échantillon à 810 nanomètres dans un spectrophotomètre UV-vis et calculez la concentration de silicium par rapport à une courbe d’étalonnage.À l’aide d’embouts de pipette jetables, ajoutez une quantité prédéterminée de réactif Bradford et un échantillon dans chaque cuvette assignée. Mélangez chaque cuvette en la retournant trois fois et laissez développer pendant 10 minutes. Ensuite, mesurez l’absorbance à 595 nanomètres en utilisant un surnageant pur comme blanc.Calculez l’absorbance d’origine de chaque cuvette en soustrayant l’absorbance de l’échantillon de contrôle de chaque mesure. Maintenant, créez une courbe d’étalonnage pour chaque série d’expériences en traçant l’absorbance mesurée en fonction de la concentration de BSA afin d’éviter les fluctuations aléatoires qui pourraient affecter la sensibilité du test. Enfin, déterminez la teneur en protéines de chaque échantillon lors de la remise en suspension afin de surveiller une éventuelle perte de protéines.Le rendement de la réaction de formation de la silice est généralement de 58 plus ou moins 6,5 %La méthode spectroscopique au bleu de molybdène a détecté la quantité d’espèces de silicates monomères n’ayant pas réagi ainsi que les espèces qui ont réagi pour former des polysilicates ou des oligomères mais n’ont pas réussi à atteindre une taille suffisante pour coaguler. Une fois la coagulation terminée, les surfaces du matériau peuvent être facilement modifiées grâce à l’utilisation de l’élution acide, ce qui permet d’affiner les propriétés du matériau telles que la composition, la porosité et l’activité chimique de l’additif. Environ 50 % de BSA a été détecté dans le surnageant après la première centrifugation, ce qui correspond à une efficacité d’immobilisation de 50 %.Comme aucun BSA n’a été détecté dans les lavages suivants, le BSA a pu être encapsulé en toute sécurité pendant la synthèse sans lixiviation. Le spectre FTIR de la silice a montré des bandes amides caractéristiques dans les échantillons avec BSA mais pas dans les échantillons témoins. Lorsque de la BSA a été ajoutée aux réactifs n’ayant pas réagi, il n’y avait pas de différences considérables dans l’efficacité d’immobilisation ou la quantité de BSA dans le composite résultant.Lorsque la BSA a été ajoutée lors de la formation de la silice, l’efficacité de l’immobilisation et la quantité de BSA dans le produit étaient nettement inférieures. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de cinq minutes si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être précis avec les poids et les volumes des réactifs et d’ajouter rapidement l’acide en une seule dose.À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la FTIR, la SCM, la porosimétrie et les dosages enzymatiques peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur les propriétés et la morphologie du matériau ainsi que sur l’activité des biomolécules. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la formation de silice bioinspirée pour explorer une méthode rapide, facile, contrôlable et respectueuse de l’environnement de synthèse de la silice avec la capacité de capsulation in situ des biomolécules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser la silice à l’aide d’une méthode bioinspirée, d’encapsuler des biomolécules in situ, de mesurer l’efficacité de l’encapsulation et d’effectuer une élution post-synthétique des additifs.N’oubliez pas que travailler avec des amines, des acides et des biomolécules peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’EPI et la prévention des déversements doivent toujours être prises lors de cette procédure.

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Cet article décrit une méthode d'extraction supercritique rapide pour la fabrication d'aérogels de silice. En utilisant un moule clos et presse à chaud hydraulique, les aérogels monolithiques peuvent être effectués en huit heures ou moins.

Préparation de silice aérogel monolithes par une méthode d&#39;extraction rapide supercritique

Un protocole pour la synthèse et la caractérisation de colloïdes enrobés de fractions supramoléculaires est décrit. Ces colloïdes supramoléculaires s’auto-assemblent lors de l’activation des liaisons hydrogène entre les molécules ancrées en surface par la lumière UV.

Synthèse et caractérisation de supramoléculaires Colloids

Nous rapportons ici la synthèse et la caractérisation du carbone nanoporeux commandés (avec une taille de pore nm 4,6) et SBA-15 (avec une taille de pore 5,3 nm). Le travail décrit la surface et propriétés texturales de tamis moléculaires nanoporeux, leur mouillabilité et le comportement de fusion D2O confiné dans les matériaux.

Propriétés de surface de synthèse nanoporeux carbone et silice Matrices

Un nouveau catalyseur métallique du groupe IV pour la métathèse d'imine est préparé en greffant le complexe de métal d'amine sur la silice déshydroxylated. Les fragments de métal de surface sont caractérisés à l'aide de FT-IR, de microanalyse élémentaire et de spectroscopie RMN à l'état solide. D'autres expériences de spectroscopie de la rmN améliorées par la polarisation nucléaire dynamique complètent la détermination de la sphère de coordination.

Imine Metathesis par Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

Ce travail vise à faciliter le développement de techniques standardisées d’imprégnation ou de greffe de composés aminés sur des substrats de silice, qui sont souvent largement décrites dans la littérature. Les quantités spécifiques de solvant, de substrat, d’amines et les valeurs d’autres paramètres expérimentaux importants seront discutées en détail.

Une méthodologie synthétique pour la préparation de composites de silice à base d’amine imprégnés et greffés pour la capture du carbone

Surveillance en temps réel permet une optimisation rapide des réactions effectuées en utilisant un traitement en flux continu. Ici, la préparation de 3-acetylcoumarin est utilisé à titre d'exemple. Appareil pour effectuer une surveillance in-situ Raman est décrite, de même que les étapes nécessaires pour optimiser la réaction.

Suivi en temps réel de réactions effectuées en utilisant traitement en flux continu: la préparation du 3-Acetylcoumarin comme un exemple

Une nouvelle méthode de production d’aérogels à base de biopolymères par gélification induite par le dioxyde de carbone (CO2) est présentée. La technique utilise du dioxyde de carbone sous pression (5 MPa) pour la production d’hydrogels biopolymères et du CO2 supercritique (12 MPa) pour convertir les gels en aérogels. Les seuls solvants nécessaires en plus du CO2 sont l’eau et l’éthanol.

Préparation de biopolymères aérogels Utilisation de Solvants verts

Un procédé d'extrusion à l'aide d'une tige filetée calibrée est présentée, ce qui permet de sous-échantillonnage à l'échelle mm de noyaux de sédiments aquatiques. échantillonnage Millimeter-échelle est nécessaire pour caractériser pleinement récente stratigraphie des événements dans les dossiers de sédiments.

Sédiments de base Extrusion Méthode à Millimeter Résolution En utilisant une, tige filetée, Calibré

Découvrez la synthèse de silice bioinspirée pour l'immobilisation d'enzymes en utilisant une méthode rapide et écologique. Ce protocole permet d'encapsuler des biomolécules in situ avec un rendement de 58%.

Préparation de silice fonctionnelle en utilisant une méthode de Bioinspired

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