Établissement et analyse des organoïdes tridimensionnels (3D) dérivés des spécimens de métastasie osseuse du cancer de la prostate du patient et de leurs Xénogreffes

Les cultures tridimensionnelles des spécimens patients de BMPC et des xénogreffes du cancer de la prostate métastatique d'os maintiennent l'hétérogénéité fonctionnelle de leurs tumeurs originales ayant pour résultat des kystes, des sphéroïdes et des organoïdes complexes de tumeur-comme. Ce manuscrit fournit une stratégie d'optimisation et un protocole pour la culture 3D d'échantillons dérivés de patients hétérogènes et leur analyse à l'aide de l'IFC.

Nous décrivons des stratégies et des protocoles étape par étape pour établir les organoïdes patients-dérivés 3D périodiques du cancer métastatique de prostate d’os. Nos protocoles optimisés sont pratiques pour mettre en place des cultures 3D pour des expériences utilisant le matériel de départ limité directement des patients ou des tissus de tumeur de xénogreffe patients-dérivés. Les organoïdes 3D de ce protocole peuvent être utilisés comme modèles ex vivo pour comprendre les mécanismes de base de la pathologie métastatique du cancer de la prostate osseuse et pour tester le traitement.

Le média de culture organoïde 3D dans ce protocole est spécifique pour les cellules prostate-dérivées. D’autres parties de nos protocoles sont applicables à différents types de tissus tumoraux et de sites métastatiques. La technique du doming peut s’avérer être la partie la plus difficile de ce processus.

La pratique de la technique de doming assurera une taille cohérente du mélange bombé des organoïdes, des médias, et de Matrigel, et de réduire au minimum la formation de bulle pendant la suspension d’échantillon. La démonstration visuelle de cette méthode permet de mieux comprendre comment manipuler le Matrigel visqueux pour réussir à culturer des organoïdes de basse densité à partir d’un faible nombre de cellules. Commencez par réutiliser la pastille cellulaire dans le volume approprié de la membrane du sous-sol pour une installation de plaque de 24 puits.

Pipette de haut en bas doucement pour s’assurer que les cellules sont résuspendées, puis pipette le volume approprié de la suspension cellulaire dans le centre d’une plaque de culture de tissu préchauffé. Inverser la plaque et la placer immédiatement à l’envers dans l’incubateur de culture cellulaire fixé à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 15 minutes. Pipette le volume approprié de milieu préchauffé contenant 10 micromolaires Y-27632 dihydrochlorure dans chaque puits.

Pour former un dôme flottant à partir du dôme rond ci-joint, détachez le dôme de la plaque à l’aide d’un grattoir cellulaire. Coupez un morceau de film de paraffine de deux par quatre pouces et placez-le sur les divots d’une grille vide de fixation de pointe d’une boîte en plastique de pointe de pipette d’un millilitre. Utilisez un index ganté pour appuyer doucement sur le film de paraffine pour tracer les divots en prenant soin de ne pas percer le film.

Vaporiser le film de paraffine avec 70% d’éthanol et allumer la lampe UV dans le capot de culture cellulaire pour stériliser le film préparé pendant au moins 30 minutes. Pendant ce temps, résuspendez les cellules pré-traitées dans 20 microlitres de membrane de sous-sol. Puis pipette la suspension dans les divots formés dans le film de paraffine.

Placez les perles solidifiées et le film de paraffine dans une assiette de six puits et pipette de trois à cinq millilitres de milieu préchauffé contenant 10 micromolaires Y-27632 dihydrochlorure dans chaque puits tout en brossant doucement les perles du film de paraffine. Pour traiter les organoïdes pour l’histologie, retirez les supports existants du puits en prenant soin de ne pas aspirer les dômes membranaires du sous-sol. Ajouter un volume égal de solution de récupération cellulaire et incuber la plaque pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius.

Après l’incubation, déloger le dôme membranaire du sous-sol à l’aide d’une pipette et l’écraser à l’aide d’une pointe de pipette. Recueillir le dôme dissocié et la solution de récupération cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifugez le tube à 300 fois g en quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, puis retirez le supernatant et mettez-le de côté.

Gardez tous les supernatants jusqu’à l’étape finale où la présence d’organoïdes est confirmée au volume désiré de PBS froid et pipette doucement de haut en bas pour déloger mécaniquement la pastille sans perturber les organoïdes. Répétez la centrifugation et retirez le supernatant. Fixez la pastille dans un volume assorti de 4%PFA pendant 60 minutes à température ambiante.

Après la fixation, répétez l’étape de centrifugation et le lavage PBS. Ajoutez ensuite lentement 200 microlitres d’agarose chaude de 2 % et détachez immédiatement mais doucement la pastille cellulaire de la paroi du tube sans la perturber à l’aide d’une aiguille de calibre 25 fixée à une seringue d’un millilitre. Pour la méthode de spin down agarose, il est essentiel de détacher la pastille cellulaire de la paroi du tube juste après l’ajout d’agarose à l’aide d’une aiguille de calibre 25.

Une fois que l’agarose s’est complètement solidifiée, détachez-la du tube avec une aiguille de calibre 25 fixée à une seringue d’un millilitre et transférez-la dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Remplissez le tube de 70 % d’éthanol et procédez au protocole conventionnel de déshydratation des tissus et d’intégration de la paraffine. Ce protocole a été avec succès employé pour établir des organoïdes 3D des modèles xénogreffe patients-dérivés du cancer de la prostate métastatique d’os aussi bien que directement du tissu de cancer.

Les organoïdes ont montré différents phénotypes qui se sont manifestés comme kystes, sphéroïdes, et organoïdes de plus grande complexité. Un dôme entier de membrane de sous-sol et d’organoïdes peut être vu dans une image cousue à partir de 25 images de grossissement à haute résolution et 10X. Pour étudier plus loin le tissu de tumeur, la cytochimie immunofluorescente a été exécutée sur une section épaisse de paraffine de cinq micromètres des organoïdes ciblant le marqueur épithélial basal de cellules cytokeratin-5, cytokeratin-8 épithélial de marqueur épithélial de cellules luminal et DAPI.

Ce protocole peut être optimisé pour d’autres applications telles que le ballonnement occidental, la co-culture et la cytométrie d’écoulement pour explorer les caractéristiques des organoïdes 3D et les effets des traitements médicamenteux. Ces expériences pourraient aborder les mécanismes de résistance aux médicaments et l’efficacité de nouvelles thérapeutiques seules ou en combinaison avec les thérapies actuelles. Les organoïdes 3D de cette technique conservent l’hétérogénéité inter-sujet et intra-sujet et sont donc un modèle plus précis de la maladie chez les patients.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer les mécanismes de résistance aux médicaments, tumorigenesis, métastases et thérapeutiques qui peuvent être plus prévisibles de la progression de la maladie chez les patients et leur réponse à la thérapie.