Name: Préparation de Drosophila Larval et Pupal Testes pour l’analyse de la division cellulaire en direct, Tissu intact (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Apprenez à préparer des testicules de larves et pupes de Drosophila pour l'analyse de la division cellulaire en direct par microscopie à fluorescence. Cette technique préserve l'environnement physiologique natif des cellules.

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Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage du ministère de la Défense à J.T.S.

1. Préparer les animaux, les outils et les médias pour la dissection
<ol><li>Traversez les mouches mâles et femelles pour obtenir la progéniture du génotype désiré. Les marqueurs transgéniques utiles pour l’identification et la mise en scène des spermatocytes méiotiques incluent GFP-tubulin pour étiqueter le fuseau méiotique et la DP-histone 2A pour étiqueter les chromants8. Utilisez cinq à dix femelles par croix et maintenez les croix sur les aliments à mouche standard dans des flacons dans un incubateur de 25 oC jusqu’à ce que les larves de l’étoile troisième commencent à ramper sur les côtés de la fiole (4-5 jours). Les premières pupes blanches commenceront à se former un jour plus tard.</li>
	<li>Obtenez deux paires de forceps droits avec des pointes fines. Assurez-vous que les pointes sont nettes, même en longueur, et droites (figure 1A). Utilisez ces forceps uniquement pour les dissections, et le bouchon avec des pointes de pipette de 10 l lorsqu’ils ne sont pas utilisés.</li>
	<li>
Préparer un outil de scalpel.
	<ol>
<li>Insérez l’extrémité émoussée d’une goupille noire d’insecte en acier anodisé dans un porte-épingle, et tordez la vis du support pour fixer la goupille en place. À l’aide d’une paire de forceps et sous un microscope disséqué, saisissez la goupille d’insecte au milieu et pliez-la pour former un angle interne de 135 degrés(figure 1B). L’extrémité pointue est pour couper le tissu, tandis que le bord est employé pour transférer des testicules entre les gouttes de support.</li>
		<li>Capuchon avec une pointe de pipette de 1 000 l lorsqu’il n’est pas utilisé.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Travailler dans une hotte de culture tissulaire, préparer 5 mL aliquots des médias de Schneider et stocker à 4 oC jusqu’au moment de l’utilisation. Lorsqu’il est prêt à commencer les dissections, réchauffer un aliquot média de 5 ml à température ambiante. Ensuite, transférer le support de dissection réchauffé dans une seringue de 10 ml et attacher un filtre à seringue de 0,22 m.</li>
</ol>2. Dissection des testicules des larves et des pupaes précoces
<ol><li>Utilisez la seringue de filtre remplie de supports pour expulser trois gouttes de support (50 ll chacune) en haut, au milieu et au bas d’une glissière en verre.</li>
	<li>Utilisez une sonde disséquée pour transférer cinq à dix troisième larves instar ou pupes précoces (pupes encore blanches ou jaunes) à la chute supérieure. Agitez doucement les larves et les pupes dans les médias avec la sonde disséquante pour enlever toute nourriture ou débris.</li>
	<li>Sous un microscope disséqué, tournez une seule larve ou pupe sur le côté avec une sonde disséquante pour identifier les deux testicules bilatéraux s’ils sont présents, qui apparaissent comme des structures translucides ovales dans le tiers postérieur du corps(figure 2A, B). Les animaux qui n’ont pas de testicules sont femelles et doivent être jetés.</li>
	<li>Lorsqu’une larve ou une pupe mâle est trouvée et est propre, déplacez-la vers la deuxième goutte de médias. Répétez l’opération jusqu’à ce que 3 ou 4 larves mâles et/ou pupes aient été transférées à la deuxième goutte de médias.</li>
	<li>Travaillant dans la deuxième goutte de médias, saisissez une seule larve mâle ou pupe avec une paire de forceps à sa mi-région, juste antérieur aux testicules. Utilisez la deuxième paire de forceps pour déchirer doucement l’animal en deux.</li>
	<li>Maintenez l’extrémité postérieure de la larve ou la pupe vers le bas sur la glissière en verre avec une paire de forceps. En commençant juste à côté des forceps, poussez vers le bas sur la cuticule en utilisant le bord de l’outil de scalpel et déplacez le scalpel vers l’extrémité coupée de l’animal. Cela expulsera les organes internes de l’animal, qui comprennent les intestins, les corps gras et les testicules.</li>
	<li>Taquiner doucement les testicules du reste des organes. Les testicules sont des organes clairs de forme ovale encastrés dans des rubans de graisse corporelle(figure 2C).</li>
	<li>Transférer les testicules un à la fois à la troisième goutte de médias. Pour ce faire, insérer le bord du scalpel sous le corps gras, soulever le tissu hors des médias, et rapidement le déplacer à la troisième goutte.</li>
	<li>Alternativement, s’il n’y a pas assez de corps de graisse encore attaché aux testicules pour soulever avec succès le tissu, transférer doucement le tissu à l’aide d’une pipette pasteur en verre qui a été pré-mouillé avec des supports de dissection.</li>
	<li>Utilisez l’extrémité pointue de l’outil de scalpel pour trancher doucement l’excès de graisse du corps des testicules, laissant juste une petite jante de corps gras autour des bords(figure 2C). Il n’est pas nécessaire d’enlever tout le corps gras, et tenter de le faire entraînera probablement une endommagement ou une rupture des testicules.</li>
	<li>Répétez les étapes ci-dessus pour toutes les larves mâles sur la glissière en verre.</li>
	<li>Procédez soit à l’étape 3, soit à l’étape 5.</li>
</ol>3. Montage d’essaiicules pour l’imagerie microscopique en direct
REMARQUE: Cette procédure de montage a été adaptée d’un protocole récemment publié pour l’imagerie des neuroblastes larvaires larvaires de Drosophila 20. Vous trouverez des détails supplémentaires dans cette référence.
<ol><li>Utilisez la seringue de filtre pour déposer une seule goutte de supports de Schneider (environ 30 ll) sur le centre d’un plat de culture à gaz de 50 mm perméable.</li>
	<li>Utilisez une pipette Pasteur pré-mouillée pour transférer les testicules préparés à la goutte sur le plat perméable au gaz. Les testicules flottent généralement à la surface de la chute.</li>
	<li>Utilisez l’outil scalpel pour pousser doucement les testicules vers le bas sur la membrane perméable au gaz. Veillez à ne pas rompre la membrane perméable au gaz avec le point pointu du scalpel. Poussez tous les testicules au centre de la goutte.</li>
	<li>Utilisez une seringue de 1 ml remplie d’huile de halocarbone pour faire quatre gouttes d’huile, environ 30 ll chacune, sur la membrane perméable du gaz. Espacez les gouttes d’huile autour de la goutte de support contenant les testicules pour correspondre aux quatre coins d’un housse de verre de 22 mm.</li>
	<li>Alignez les coins d’un housse en verre de 22 mm avec les quatre gouttes d’huile de halocarbone et abaissez doucement le coverlip sur le support et l’huile. Laissez le coverlip se déposer et que les supports contenant les testicules se propagent entre les gouttes d’huile.</li>
	<li>Retirez l’excès de support pour permettre au coverlip de s’installer sur la surface des testicules. Tout en observant les testicules sous un microscope disséquant, insérer le coin d’une tâche délicate essuyer dans les médias sous le coverlip pour évincer une petite quantité de liquide. Wick loin assez de médias jusqu’à ce que le coverlip de verre prend juste contact avec la surface des plus grands testis. Il est essentiel de ne pas enlever trop de supports et d’abaisser le coverlip trop loin, car cela exercera une pression sur les testicules et les entraînera à la rupture (voir la figure 5).</li>
</ol>4. Imagerie en direct des spermatocytes méiotiques
REMARQUE: Les spermatocytes peuvent être photographiés à l’aide d’un microscope confocal de balayage laser ou de disque tournant. Le système doit avoir une vitesse et une sensibilité adéquates pour éviter le photoblachage des protéines fluorescentes ou le photodamage du tissu.
<ol><li>Placez une goutte d’huile d’immersion sur le housse en verre juste au-dessus des testicules. Retournez sur le plat et placez-le sur le microscope et déplacez l’objectif de microscope (40x ou 60x) dans l’huile jusqu’à ce qu’il soit juste en dessous des testicules. Utilisez la lumière transmise pour trouver un testicule unique et la mettre au point.</li>
	<li>Tout en capturant des images rapides avec le confocal, déplacez les testicules autour d’examiner l’organisation des cellules. Une extrémité des testicules aura beaucoup de petites cellules densément emballées. Cette extrémité contient les cellules souches germinales et la spermatogonie. Se déplaçant vers l’autre extrémité de l’organe, identifier les cellules progressivement plus grandes organisées en grappes discrètes ou kystes. Ces grandes cellules sont les spermatocytes(figure 3A).</li>
	<li>Si l’imagerie GFP-tubulin, identifier les spermatocytes qui commenceront la méiose dans les 30-60 min par la présence de deux asters microtubule lumineux (c.-à-d., centrosomes) situés au cortex de la cellule(figure 3B, C).</li>
	<li>Une fois qu’un kyste de spermatocytes méiotiques a été identifié, configurez des paramètres d’acquisition pour capturer des z-stacks d’images au fil du temps. Typiquement, l’acquisition de 15-20 images espacées de 1,5 m dans la dimension z est suffisante pour capturer le volume complet de plusieurs spermatocytes dans le même kyste.</li>
	<li>Acquérir des z-stacks complets toutes les 2 minutes si l’imagerie de toute la première division méiotique, qui prend environ 1,5 heures. Il est possible d’utiliser des taux d’acquisition plus rapides, surtout si seulement un événement spécifique de méiose doit être analysé. Cependant, prenez soin de ne pas causer de photoblaching ou de photodamage en raison de l’exposition répétée de l’échantillon à l’excitation laser.</li>
	<li>Utilisez un système de commande de mise au point automatique et continu pour prévenir la dérive focale au cours de la longue période d’acquisition. Le contrôle de température de l’échantillon au stade du microscope n’est généralement pas nécessaire, en supposant une température ambiante d’environ 22 à 23 oC. Si un contrôle de la température est disponible, maintenez l’échantillon à 25 oC au stade du microscope.</li>
	<li>Si les spermatocytes méiotiques ne sont pas trouvés, conservez l’échantillon pendant plusieurs heures ou toute la nuit dans un incubateur et une image de 25 oC.</li>
</ol>5. Fixation et immunostachation
<ol><li>De l’étape 2.10 ci-dessus, utilisez une pipette Pasteur en verre pour transférer les testicules dans un puits dans un plat de dissectage en verre de 9 puits contenant 0,5 mL de paraformaldéhyde de 8% dans PBSTx (phosphate tamponné saline avec 0,3% Triton X-100). Assurez-vous que les testicules sont posés sur le fond du plat. REMARQUE: Le paraformaldéhyde est toxique et doit être manipulé avec des gants dans une hotte à fumée.</li>
	<li>Fixer les testicules pendant 20 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Transférer les testicules dans un puits contenant 0,5 mL PBSTx. Laver pendant 5 min avec une agitation douce. Répétez l’étape de lavage dans de nouveaux puits avec PBSTx frais deux fois de plus.</li>
	<li>Diluer l’anticorps primaire à la concentration désirée dans 0.5 mL PBSTx contenant 5% d’albumin de sérum bovin (BSA) dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL. Transférer les testicules du plat de dissectage en verre de 9 puits au tube d’anticorps primaire dilué et incuber toute la nuit à 4 oC avec une légère berçage ou une noix.</li>
	<li>Laver les testicules dans 0,5 ml de PBSTx pendant 5 minutes dans un puits d’un plat de dissection en verre de 9 puits. Répétez l’étape de lavage avec PBSTx frais deux fois de plus.</li>
	<li>Diluer l’anticorps secondaire dans 250 l 'L de PBSTx contenant 5% BSA et distribuer dans un puits propre d’un plat de dissection de verre 9-bien. Si désiré, ajouter DAPI à tacher l’ADN. Transférer les testicules vers le puits contenant des anticorps secondaires, couvrir d’une pellicule plastique et incuber dans l’obscurité avec une agitation douce pendant 4 heures à température ambiante.</li>
	<li>Transférer les testicules à un puits propre rempli de 0,5 ml de PBSTx. Laver avec PBSTx frais deux fois pendant 5 min et une troisième fois pendant 30 min.</li>
</ol>6. Montage des testicules fixes
<ol><li>Transférer les testicules du dernier lavage sur une glissière en verre à l’aide d’une pipette Pasteur. Si nécessaire, utilisez le bord de l’outil scalpel pour pousser les testicules vers le bas sur la surface de la glissière.</li>
	<li>Utilisez le coin d’une tâche délicate essuyer pour éventer l’excès de liquide des testicules. Retirer autant de liquide que possible.</li>
	<li>Appliquer une goutte de microscopie de 30 à 50 l de mioscopie à la vitesse des testicules.</li>
	<li>Placez un housse de 22 mm sur la goutte de support de montage et laissez reposer le coverlip et le support de montage pour se propager sous le coverlip. Appliquer une légère pression sur le coverlip si nécessaire pour presser l’excès de support de montage et permettre au coverlip de se reposer sur la surface des testicules.</li>
	<li>Utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords du coverlip.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons décrit un protocole pour la préparation des testicules larvaires ou précoces de Drosophila, optimisé pour la formation image vivante à long terme de la division de cellules de spermatocyte. Il s’agit d’une méthode puissante pour l’analyse de la division cellulaire dans le contexte physiologique du tissu intact. La puissance de cette méthode est encore élargie lorsqu’elle est combinée avec des outils génétiques Drosophila, tels que des mutations génétiques spécifiques, la suppression tissu-spé...

La division cellulaire est souvent étudiée à l’aide de lignées cellulaires cultivées dans la culture1. Bien que nous ayons acquis une richesse de perspicacité inestimable et la compréhension des mécanismes fondamentaux de ces études2, les cellules cultivées dans la culture ne peuvent pas entièrement récapituler la physiologie de la division cellulaire comme il se produit dans intact, tissu vivant. Par exemple, dans les tissus et les organes intacts, les cellules doivent se diviser au bon endroit et au bon moment afin que les cellules progénitrices soient correctement situées dans le tissu, de sorte qu’elles puissent subir une différenciation appropriée ou des programmes fonctionnels, et de sorte que la prolifération cellulaire soit correctement coordonnée avec la croissance des tissus ou l’homéostasie3. Pour les cellules cultivées en culture d’autre part, la division cellulaire est généralement réglementée par des facteurs de croissance dans le milieu de la culture4, et donc nous ne pouvons pas apprendre de ces cellules comment in vivo facteurs environnementaux tels que l’architecture tissulaire ou la signalisation développementale influencent le processus de division. Il est également important de noter que beaucoup de lignées cellulaires utilisées pour étudier la division cellulaire, telles que Les cellules HeLa et U2OS, ont été dérivées de tumeurs métastatiques5. Par conséquent, de nombreux aspects de la physiologie de base de ces cellules cancéreuses, tels que les mécanismes de régulation du cycle cellulaire et la stabilité chromosomique, ont probablement été modifiés par rapport aux cellules saines. La compréhension complète de la physiologie de division cellulaire dépend donc de notre capacité à étudier les cellules de division dans leurs environnements indigènes in vivo qui préservent les mécanismes physiologiques de régulation et l’architecture tissulaire.
Les progrès dans la compréhension du fonctionnement de la division cellulaire dans les tissus et les organes intacts sont entravés par des difficultés inhérentes à l’analyse in vivo ou ex vivo. Tout d’abord, il peut être difficile ou impossible d’accéder à des cellules de division pour une analyse microscopique dans de grands organes ou des tissus épais. Deuxièmement, il est souvent difficile de prédire quand les cellules individuelles se divisent in vivo. Troisièmement, la physiologie tissulaire peut rapidement se détériorer pendant la culture ex vivo. Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes facilement accessibles pour l’analyse vivante et fixe des spermatocytes de mélanogaster de Drosophila pendant qu’ils subissent des divisions méiotiques de cellules dans des testicules entièrement intacts. Ces cellules sont idéales pour l’analyse vivante et ex vivo parce qu’elles sont facilement accessibles avec des méthodes optiques standard telles que la microscopie confocienne, elles se divisent à des moments et des endroits prévisibles, et les testicules intacts peuvent être maintenus dans la culture ex vivo jusqu’à environ 24 h. En outre, les spermatocytes Drosophila sont de grandes cellules rondes (environ 20 à 30 m de diamètre) qui ne changent pas de forme lorsqu’elles se divisent, ce qui les rend idéales pour l’imagerie à haute résolution et en time-lapse des composants cellulaires tels que l’appareil fuseau et les organites cytoplasmiques. Bien que ces cellules subissent la méiose par opposition à la mitose, beaucoup des processus essentiels de division cellulaire sont très semblables entre ces deux mécanismes de division cellulaire6. Ces avantages, combinés avec de puissants outils génétiques Drosophila, ont fait des spermatocytes Drosophila un modèle largement utilisé pour l’analyse ex vivo des processus essentiels de division cellulaire, y compris la formation et la régulation des fuseaux, la cytokinésie, et le remodelage et le cloison d’organelle7,8,9,10,11.
Les spermatocytes sont des cellules qui sont au stade méiotique de la spermatogénèse. Dans Drosophila, la spermatogénèse commence par un groupe de cellules souches germinales qui sont situés dans une petite région ou "hub" à un pôle des testis12,13. Ces cellules se divisent par une mitose asymétrique, donnant lieu à un spermatogonium différencié unique. Spermatogonia subit alors quatre mitoses synchrones pour produire un groupe de 16 cellules qui restent étroitement associées dans un seul kyste. À ce stade, les cellules passent d’un cycle mitotique à un cycle de cellules méiotiques et sont appelées spermatocytes. Les spermatocytes passent environ deux à trois jours dans une étape étendue du cycle G2 de la cellule, au cours de laquelle ils se développent de façon spectaculaire et subissent des changements cytologiques en préparation pour les deux divisions méiotiques et la spermiogénèse suivante13,14. Le groupe entier de 16 spermatocytes dans un seul kyste entrent alors dans la première division méiotique en même temps. Ainsi, plusieurs spermatocytes méiotiques peuvent être photographiés simultanément pendant qu’ils procèdent par division cellulaire. La première division méiotique se poursuit pour environ 1,5 h et est suivie presque immédiatement par la deuxième division méiotique, donnant 64 spermiatdés totaux qui continuent à se différencier en spermatozoïde mature.
Un avantage unique de l’utilisation de spermatocytes pour étudier la division cellulaire dans les tissus vivants et intacts est que les groupes ou les kystes des cellules progressent constamment à travers les différents stades de spermatogénèse, et les cellules à tous les stades de la spermatogénèse peuvent généralement être identifiés dans n’importe quel testicule donné (voir la figure 3A). Par conséquent, il est relativement facile de trouver des cellules méiotiques dans des testicules entiers. Nous concentrons généralement nos analyses sur la première par opposition à la méiose seconde parce que ces cellules sont beaucoup plus grandes et plus agréables à l’imagerie à haute résolution, mais l’ensemble du processus englobant les deux divisions méiotiques peut être photographié avec succès. Il convient également de noter que le protocole général pour la préparation et la culture des testicules peut être utilisé pour analyser d’autres processus de spermatogénèse ainsi, tels que les divisions antérieures de cellules souches mitotiques ou spermatogonial ou les changements cytologiques qui se produisent pendant que les spermatotines mûrissent dans spermatozoa15. Beaucoup de ces aspects de la spermatogénèse sont fortement conservés entre Drosophila et les humains16.
Les spermatocytes de Drosophila commencent à atteindre la phase méiotique de spermatogénèse pendant le troisième stade larvaire instar du développement de Drosophila 13. Par conséquent, les testicules isolés des stades du cycle de vie en commençant par les larves de troisième étoile et y compris les pupes et les adultes peuvent être utilisés pour l’analyse de la division des spermatocytes. Plusieurs protocoles excellents sont disponibles pour l’extraction des testicules de mouches mâles adultes pour l’analyse vivante et fixe de la spermatogénèse17,18,19. Ces protocoles peuvent être préférables pour étudier les stades avancés de la spermatogénèse ou si les marqueurs génétiques qui ne sont visibles que chez les adultes doivent être utilisés. Le protocole se concentre plutôt sur la préparation des testicules à partir de larves et de pupes précoces, car les testicules à ces stades ont plusieurs avantages qui sont spécifiquement pertinents pour l’analyse de division cellulaire par haute résolution, microscopie time-lapse. Tout d’abord, les testicules des larves et des pupes sont plus petits que ceux des adultes, et les cellules à l’intérieur de l’organe sont moins encombrées. Pour cette raison, la division des spermatocytes peut souvent être imagené près de la surface extérieure des testicules larvaires, sans avoir à pénétrer à travers de multiples couches de tissu de diffusion de la lumière. Deuxièmement, les testicules adultes se déplacent rythmiquement en raison des contractions des organes accessoires attachés, et ces mouvements rendent la formation image en time-lapse des cellules individuelles difficile. Et troisièmement, les testicules larvaires sont avantageux lorsqu’ils étudient les mutations génétiques qui causent la létalité pupale ou adulte. Nos méthodes sont optimisées pour la culture à long terme des testicules au stade du microscope, permettant l’imagerie de plusieurs cycles de division cellulaire ou la progression des cellules individuelles à travers de multiples stades de spermatogénèse dans la même préparation. Nous décrivons également un protocole pour la fixation et l’immunostaining des testicules entiers. Dans l’ensemble, nos protocoles sont particulièrement utiles pour ceux qui s’intéressent à l’étude de la division cellulaire dans les tissus intacts, et la capacité de combiner l’analyse de spermatocytes avec des outils génétiques très tractables Drosophila en fait une approche particulièrement puissante.

<table><tbody><tr><td>Sonde de dissection 5</td> » <td>Fisher</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en verre 5,75</td> » <td>Fisher</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Forcepts droits à pointes fines</td></tr><tr><td>Lames de microscope givrées</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td>Lames pour le montage de tissus fixes, avec surface d’écriture givrée</td></tr><tr><td>Huile d’halocarbure 700</td><td>Sigma</td><td>H8898-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Lumox Dish 50</td><td>Sarstedt</td><td>SAR946077410</td><td>Boîte de culture tissulaire perméable aux gaz</td></tr><tr><td>Couvercle de microscope Verre</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>22 mm x 22 mm, lamelle en verre #1.5</td></tr><tr><td>Goupilles Minutien Pins</td> Outils <td>scientifiques fins</td><td>26002-15</td><td>Épingles à insectes utilisées pour fabriquer Outil de scalpel</td></tr><tr><td>Porte-goupille nickelé</td><td>Outils de sciences fines</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 32 % Solution, EM Grade</td><td>Microsocopie électronique Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Plan Lames de microscope à bord biseauté</td><td>Fisher</td><td>12-549-5</td><td>Lames utilisées pour les dissections</td></tr><tr><td>Plaques de spot PYREX</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>Plat</td></tr> <tr><td>de dissection en verre à 9 puitsSchneider’s Drosophila moyen</td><td>Fisher</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue, 0,22 & micro ; m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Support de montage pour microscopie</td></tr></tbody></table>

préparation de drosophila larval et pupal testes pour l’analyse de la division cellulaire en direct, tissu intact

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

L’analyse expérimentale des cellules se divisant dans les tissus et les organes vivants et intacts est essentielle à notre compréhension de la façon dont la division cellulaire s’intègre au développement, à l’homéostasie tissulaire et aux processus de la maladie. Les spermatocytes de Drosophila subissant la méiose sont idéaux pour cette analyse parce que (1) les testicules entiers de Drosophila contenant des spermatocytes sont relativement faciles à préparer pour la microscopie, (2) la grande taille des spermatocytes les rend bien adaptés pour l’imagerie à haute résolution, et (3) les outils génétiques puissants de Drosophila peuvent être intégrés avec l’analyse in vivo. Ici, nous présentons un protocole facilement accessible pour la préparation de testicules entiers de Drosophila troisième larves instar et pupes précoces. Nous décrivons comment identifier les spermatocytes méiotiques dans les testicules entiers préparés et comment les imager en direct par microscopie en time-lapse. Des protocoles de fixation et d’immunostaining de testicules entiers sont également fournis. L’utilisation des testicules larvaires présente plusieurs avantages par rapport aux protocoles disponibles qui utilisent des testicules adultes pour l’analyse des spermatocytes. Plus important encore, les testicules larvaires sont plus petits et moins encombrés avec des cellules que les testicules adultes, ce qui facilite grandement l’imagerie à haute résolution des spermatocytes. Pour démontrer ces avantages et les applications des protocoles, nous présentons des résultats montrant la redistribution du réticulum endoplasmique en ce qui concerne les microtubules fuseaux pendant la division cellulaire dans un spermatocyte simple photographié par microscopie confocale en time-lapse. Les protocoles peuvent être combinés avec l’expression d’un certain nombre de protéines marquées fluorescentes ou marqueurs d’organelle, ainsi que des mutations génétiques et d’autres outils génétiques, ce qui rend cette approche particulièrement puissante pour l’analyse des mécanismes de division cellulaire dans le contexte physiologique des tissus entiers et des organes.

Lorsque ce protocole est exécuté avec succès, les testicules resteront entièrement intacts pour l’imagerie par microscopie confocienne ou d’autres méthodes de microscopie de fluorescence. Comme on le voit dans la figure 3A, l’organisation cellulaire des testicules est préservée, et la progression de la différenciation cellulaire d’une extrémité des testicules à l’autre, y compris la spermatogonie, les spermatocytes et les spermiatdés haploïdes est visible. GFP-tubulin est un marqueur utile p...

Le but de ce protocole est d’analyser la division cellulaire dans les tissus intacts par microscopie cellulaire vivante et fixe à l’aide de spermatocytes méiotiques Drosophila. Le protocole démontre comment isoler des testicules entiers et intacts des larves de Drosophila et des pupes précoces, et comment les traiter et les monter pour la microscopie.

Préparation de Drosophila Larval et Pupal Testes pour l’analyse de la division cellulaire en direct, Tissu intact

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Ce protocole peut être utilisé pour analyser les mécanismes de la division cellulaire dans le contexte des tissus vivants intacts à l’aide de microscopie de fluorescence. Le principal avantage de cette technique est que les environnements physiologiques indigènes des cellules sont préservés, tout en permettant l’imagerie en direct sur de longs cours de temps. La partie la plus importante de cette technique est de s’assurer que les testicules ne sont pas endommagés pendant la dissection ou le montage.C’est une compétence qui est acquise avec un peu de temps et de pratique. La démonstration visuelle de cette méthode est critique, car elle montre comment identifier et isoler les testicules, et comment les monter pour l’imagerie sans endommager le tissu. Préparez des animaux, des outils et des supports tels que décrits dans le manuscrit.Avant de commencer la dissection, utilisez la seringue de filtre remplie de médias pour expulser trois gouttes de médias chacun 50 microlitres en haut, au milieu et au bas d’une glissière en verre. À l’aide d’une sonde disséquante, transférer de cinq à dix larves de troisième stade ou des nymphes précoces vers la goutte supérieure des médias sur la lame. Agitez doucement les larves et les pupes dans les médias avec la sonde disséquante pour enlever toute nourriture ou débris.Utilisez la sonde disséquante pour tourner une seule larve ou une pupe sur le côté. Recherchez les deux testicules bilatéraux qui apparaissent comme des structures ovales translucides sur le tiers postérieur du corps. Les animaux qui n’ont pas de testicules sont des femelles et doivent être jetés.Lorsqu’une larve ou une pupe mâle est trouvée et propre, déplacez-la vers la deuxième goutte de médias. Répéter jusqu’à ce que trois ou quatre larves mâles ou pupes aient été transférées à la deuxième goutte de médias. Puis en travaillant dans la deuxième goutte de médias, saisir un seul animal avec une paire de forceps à sa mi-région, juste antérieur aux testicules.Utilisez une deuxième paire de forceps pour déchirer doucement l’animal en deux. À l’aide d’une paire de forceps, maintenez l’extrémité postérieure de l’animal vers le bas sur la glissière en verre. En commençant juste à côté des forceps, poussez vers le bas sur la cuticule en utilisant le bord du scalpel.Déplacez le scalpel vers l’extrémité coupée de l’animal. Ceci expulsera les organes internes de l’animal, qui incluent les tripes, les corps gras, et les testicules. Les testicules sont des organes ovales incolores et presque transparents intégrés dans des rubans de graisse corporelle.Taquiner doucement les testicules du reste des organes. Pour transférer les testicules un à la fois, insérez le bord du scalpel sous le corps gras, soulevez le tissu hors des médias, et déplacez-le rapidement à la troisième goutte. S’il n’y a pas assez de graisse corps encore attaché aux testicules pour soulever le tissu avec le scalpel utiliser une pipette pasteur en verre qui a été préwetted avec milieu de dissection.En travaillant dans la troisième goutte de milieu, utiliser l’extrémité pointue du scalpel pour couper doucement l’excès de graisse du corps des testicules, laissant juste un petit bord de gros corps autour des bords. Tout d’abord, utilisez la seringue filtrante pour déposer une seule goutte du milieu de Schneider d’environ 30 microlitres au centre d’un plat de culture perméable au gaz de 50 millimètres. À l’aide de l’outil scalpel ou d’une pipette Pasteur pré-préparée, transférer jusqu’à cinq des testicules préparés à la goutte sur le plat.Ensuite, utilisez l’outil scalpel pour pousser doucement les testicules vers le bas sur la membrane perméable au gaz, et dans le centre de la goutte de milieu. À l’aide d’une seringue d’un millilitre, placez quatre gouttes d’huile d’halocarbone sur la membrane perméable au gaz entourant la chute du milieu. L’emplacement des gouttes doit correspondre aux quatre coins d’une couverture de classe de 22 millimètres.Alignez ensuite les coins d’un couvercle en verre de 22 millimètres avec les quatre gouttes d’huile d’halocarbone et abaissez doucement le coverslip sur le média et l’huile. Laissez le coverslip s’installer, et pour les supports contenant les testicules la propagation entre les gouttes d’huile. Placer le plat de culture sous un microscope disséquant.Pour éliminer l’excès de supports, insérez le coin d’un chiffon de tâche délicat sous le coverslip. Wick loin assez de médias pour le coverslip en verre pour juste entrer en contact avec la surface du plus grand testicules. N’enlevez pas trop de supports et abaissez trop le coverslip.Cela exercera une pression sur les testicules et peut les provoquer une rupture. Enfin, placez une goutte d’huile d’immersion sur le couvercle en verre juste au-dessus des testicules. Retournez le plat et placez-le au microscope.Déplacez l’objectif du microscope 40 ou 60 X dans l’huile jusqu’à ce qu’il soit juste en dessous des testicules. Utilisez la lumière transmise pour trouver un seul testicules et le mettre au point. Placer 0,5 millilitres de paraformaldéhyde de 8 % dans le PBSTx dans un puits d’un plat de neuf puits disséquant.Utilisez une pipette Pasteur en verre pour transférer jusqu’à 10 testicules au puits. Assurez-vous que les testicules sont couchés sur le fond du puits. Après 20 minutes, transférer les testicules dans un puits contenant 0,5 millilitres de PBSTx.Laver les testicules en agitant doucement pendant cinq minutes. Lavez-vous deux fois de plus dans de nouveaux puits avec du PBSTx frais. Préparez une dilution de l’anticorps primaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre tel que décrit dans le manuscrit.Ensuite, transférez les testicules des neuf puits en verre disséquant le plat au tube. Incuber le tube toute la nuit à quatre degrés Celsius avec un basculement doux ou nutation. La procédure de coloration des testicules avec l’anticorps secondaire est similaire.Voir le manuscrit pour plus de détails. Tout d’abord, à l’aide d’une pipette Pasteur, transférer les testicules de la plaque de neuf puits sur une toboggan en microscopie en verre. Si nécessaire, utilisez le bord du scalpel pour pousser les testicules vers le bas sur la surface de la glissière.Ensuite, utilisez le coin d’un chiffon tâche délicate pour évacue l’excès de liquide des testicules. Retirer le plus de liquide possible. Appliquez ensuite une goutte de 30 à 50 microlitres de support de montage de microscopie sur les testicules.Enfin, placez un coverslip de 22 millimètres sur la chute du milieu de montage. Laissez le coverslip s’installer, et le milieu de montage s’étendre sous le coverslip. Si nécessaire, appliquez une pression douce sur le coverslip pour presser l’excès de montage moyen et laisser le coverslip reposer sur la surface des testicules.Lorsque ce protocole est exécuté avec succès, l’organisation cellulaire des testicules est préservée, et la progression de la différenciation cellulaire d’une extrémité du testicules à l’autre est visible. Spermatocytes sur le point de commencer la méiose et ceux dans la métaphyse peuvent être identifiés. Dans les testicules préparés à l’aide de ce protocole, l’analyse d’imagerie en direct montre la réorganisation dynamique du réticulum endoplasmique et des micro tubules dans la division des spermatocytes.Comme décrit dans le protocole, il faut prendre grand soin de ne pas appliquer de pression qui provoque l’éclatement des testicules. Les kystes des spermatocytes s’écoulent rapidement d’un testicule rompu, rendant l’imagerie de laps de temps vivant difficile. Ce protocole est optimisé pour l’imagerie divisant les spermatocytes dans les tissus vivants et intacts.Par conséquent, il est essentiel que les testicules ne soient pas endommagés pendant la dissection ou le montage. Notre méthode devrait également convenir aux techniques d’imagerie à super résolution, telles que la microscopie d’éclairage structuré, fournissant de nouvelles informations sur les processus sous-cellulaires dynamiques qui régissent la division cellulaire.

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