Name: Preparazione dei test di Drosophila Larval e Pupal per lanalisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Impara a preparare testicoli intatti da larve e pupae di Drosophila per l'analisi della divisione cellulare in vivo con microscopia a fluorescenza. Questo metodo preserva l'ambiente fisiologico nativo del tessuto.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avviamenti del Dipartimento della Difesa per J.T.S.

1. Preparare animali, strumenti e supporti per la dissezione
<ol><li>Attraversare mosche maschili e femminili per ottenere la progenie del genotipo desiderato. Indicatori transgenici utili per l'identificazione e la messa in scena di spermatociti meiotici includono GFP-tubulina per etichettare il mandrino meiotico e RFP-histone 2A per etichettare i cromosomi8. Utilizzare da cinque a dieci femmine per croce e mantenere le croci sul cibo a mosca standard nelle fiale in un'incubatrice di 25 gradi centigradi fino a quando le larve della terza stella iniziano a strisciare sui lati della fiala (4-5 giorni). Le prime pupe bianche inizieranno a formarsi un giorno dopo.</li>
	<li>Ottieni due paia dritte con punte fini. Assicurarsi che le punte siano nitide, anche in lunghezza e dritte (Figura 1A). Utilizzare queste pinze solo per le dissezioni e il tappo con punte di 10 l-pipette quando non sono in uso.</li>
	<li>
Preparare uno strumento bisturi.
	<ol>
<li>Inserire l'estremità smussata di un perno di insetto in acciaio anodizzato nero in un supporto perno e ruotare la vite del supporto per fissare il perno in posizione. Utilizzando una coppia di pinze e sotto un microscopio dissetante, afferrare il perno dell'insetto al centro e piegarlo per formare un angolo interno di 135 gradi (Figura 1B). L'estremità tagliente è per il taglio del tessuto, mentre il bordo viene utilizzato per il trasferimento di testicoli tra le gocce di supporti.</li>
		<li>Concappucciare con una punta di pipetta da 1.000 ll quando non è in uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavorando in una cappa di coltura tissutale, prepara 5 mL dei media di Schneider e conserva a 4 gradi centigradi fino al momento dell'uso dell'aliquota. Quando si è pronti per iniziare le dissezioni, scaldare uno da 5 mL di un'aliquota a temperatura ambiente. Trasferire quindi il supporto di dissezione riscaldato su una siringa da 10 mL e fissare un filtro per siringhe da 0,22 m.</li>
</ol>2. Dissezione dei testicoli da Larve e prime pupe
<ol><li>Utilizzare la siringa del filtro riempito dai supporti per espellere tre gocce di supporti (50 gradi l ciascuna) nella parte superiore, centrale e inferiore di uno scivolo di vetro.</li>
	<li>Utilizzare una sonda dissezionante per trasferire da cinque a dieci 3 3 larve instelle o pupe prime (pupe che sono ancora bianche o gialle) verso la goccia superiore. Agitare delicatamente le larve e le pupe nei media con la sonda di dissezione per rimuovere qualsiasi cibo o detriti.</li>
	<li>Al microscopio dissezioso, girare una singola larva o pupa su un lato con una sonda sezionata per identificare i due testicoli bilaterali se presenti, che appaiono come strutture traslucide a forma ovale nel terzo posteriore del corpo(Figura 2A, B). Gli animali privi di testicoli sono femmine e devono essere scartati.</li>
	<li>Quando viene trovata una larva o una pupa maschio ed è pulita, spostala alla seconda goccia di supporto. Ripetere fino a quando 3 o 4 larve maschili e/o pupe sono state trasferite alla seconda goccia di supporti.</li>
	<li>Lavorando nella seconda goccia di supporti, afferrare una singola larva maschio o pupa con un paio di pinze nella sua regione centrale, appena anteriore ai testicoli. Utilizzare il secondo paio di pinze per strappare delicatamente l'animale a metà.</li>
	<li>Tenere l'estremità posteriore della larva o della pupa sullo scivolo di vetro con un paio di pinze. Partendo proprio accanto alle pinze, spingere verso il basso sulla cuticola utilizzando il bordo dello strumento bisturi e spostare il bisturi verso l'estremità tagliata dell'animale. Questo espellerà gli organi interni dell'animale, che includono le budella, i corpi grassi e i testicoli.</li>
	<li>Prendere in giro delicatamente i testicoli dal resto degli organi. I testicoli sono chiari, organi a forma ovale incorporati in nastri del corpo grasso (Figura 2C).</li>
	<li>Trasferire i testicoli uno alla volta alla terza goccia di supporti. Per raggiungere questo obiettivo, inserire il bordo del bisturi sotto il corpo grasso, sollevare il tessuto dal supporto e spostarlo rapidamente alla terza goccia.</li>
	<li>In alternativa, se non c'è abbastanza corpo grasso ancora attaccato ai testicoli per sollevare con successo il tessuto, trasferire delicatamente il tessuto utilizzando una pipetta Pasteur di vetro che è stata pre-bagnata con supporti di dissezione.</li>
	<li>Utilizzare l'estremità tagliente dello strumento bisturi per tagliare delicatamente via il corpo grasso in eccesso dai testicoli, lasciando solo un piccolo bordo di corpo grasso intorno ai bordi (Figura 2C). Non è necessario rimuovere tutto il corpo grasso, e il tentativo di farlo probabilmente si tradurrà in danneggiare o rottura dei testicoli.</li>
	<li>Ripetere i passaggi precedenti per tutte le larve maschili sullo scivolo di vetro.</li>
	<li>Procedere al passaggio 3 o 5.</li>
</ol>3. Test di montaggio per l'imaging microscopico dal vivo
 NOT:</</c0> Questa procedura di montaggio è stata adattata da un protocollo recentemente pubblicato per l'imaging di neuroblasti cerebrali larghi della Drosophila 20. Ulteriori dettagli sono disponibili in questo riferimento.
<ol><li>Utilizzare la siringa per filtrare per depositare una singola goccia di supporti di Schneider (circa 30 gradi centigradi) al centro di un piatto di coltura permeabile a gas da 50 mm.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta Pasteur pre-bagnata per trasferire i testicoli preparati alla goccia sul piatto a gas permeabile. I testicoli generalmente galleggiano sulla superficie della caduta.</li>
	<li>Utilizzare lo strumento bisturi per spingere delicatamente i testicoli verso il basso sulla membrana permeabile al gas. Fare attenzione a non rompersi la membrana permeabile al gas con il punto acuto del bisturi. Spingere tutti i testicoli al centro della caduta.</li>
	<li>Utilizzare una siringa da 1 mL ripiena di olio di alocarbonio per fare quattro gocce di olio, circa 30 ll, sulla membrana permeabile a gas. Distanziale le gocce d'olio intorno alla goccia di supporti contenenti i testicoli in modo che corrispondano ai quattro angoli di una vetrina di vetro da 22 mm.</li>
	<li>Allineare gli angoli di un coperchio di vetro da 22 mm con le quattro gocce di olio di alocarbonio e abbassare delicatamente il coperchio sui supporti e sull'olio. Lasciare che il coperchio si accontenti e che i supporti contenenti i testicoli si diffondano tra le gocce di olio.</li>
	<li>Rimuovere i supporti in eccesso per consentire al coperchio di depositarsi sulla superficie dei testicoli. Osservando i testicoli al microscopio dissezioso, inserire l'angolo di un delicato compito pulire nel supporto sotto il coperchio per spazzare via una piccola quantità di liquido. Wick via abbastanza supporti fino a quando il vetro coverslip solo entra in contatto con la superficie del più grande testis. È fondamentale non rimuovere troppo i supporti e abbassare troppo lo scivolo, in quanto ciò eserciterà pressione sui testicoli e li farà rompersi (vedi Figura 5).</li>
</ol>4. Live Imaging di spermatociti meiotici
 NOT:</</c0> Gli spermatociti possono essere immagini utilizzando un microscopio confocale a scansione laser o rotante del disco. Il sistema deve avere velocità e sensibilità adeguate per evitare il fotosbiancamento di proteine fluorescenti o i fotodanni del tessuto.
<ol><li>Mettere una goccia di olio di immersione sulla copertura di vetro appena sopra i testicoli. Capovolgere il piatto e posizionarlo sullo stadio del microscopio e spostare l'obiettivo del microscopio (40x o 60x) nell'olio fino a quando non è appena sotto i testicoli. Utilizzare la luce trasmessa per trovare un singolo testicolo e metterlo a fuoco.</li>
	<li>Durante l'acquisizione di immagini veloci con il confocale, spostare i testicoli intorno per esaminare l'organizzazione delle cellule. Un'estremità del testicolo avrà molte piccole cellule densamente imballate. Questo finale contiene le cellule staminali germinali e la spermatogonia. Spostandosi verso l'altra estremità dell'organo, identificare cellule progressivamente più grandi organizzate in ammassi discreti o cisti. Queste grandi cellule sono gli spermatociti (Figura 3A).</li>
	<li>Se si fa l'imaging di GFP-tubulina, identificare gli spermatociti che inizieranno la meiosi entro 30-60 min dalla presenza di due astri di microtubuli luminosi (cioè centroni) situati alla corteccia della cellula (Figura 3B, C).</li>
	<li>Una volta identificata una cisti di spermatociti meiotici, impostare i parametri di acquisizione per catturare z-stack di immagini nel tempo. In genere, l'acquisizione di 15-20 immagini distanziate di 1,5 m nella dimensione z è sufficiente per catturare l'intero volume di diversi spermatociti all'interno della stessa cisti.</li>
	<li>Acquisire z-stack completi ogni 2 min se l'imaging dell'intera prima divisione meiotica, che dura circa 1,5 ore. È possibile utilizzare tassi di acquisizione più rapidi, in particolare se si vuole analizzare solo un evento specifico di meiosi. Tuttavia, fare attenzione a non causare fotosbiancamento o danni fotografici a causa dell'esposizione ripetuta del campione all'eccitazione laser.</li>
	<li>Utilizzare un sistema di controllo della messa a fuoco continuo e automatico per evitare la deriva focale nel lungo periodo di acquisizione. Il controllo della temperatura del campione sullo stadio del microscopio generalmente non è necessario, supponendo una temperatura ambiente di circa 22-23 gradi centigradi. Se il controllo della temperatura è disponibile, mantenere il campione a 25 gradi centigradi sullo stadio del microscopio.</li>
	<li>Se gli spermatociti meiotici non vengono trovati, conservare il campione per diverse ore o peruna durante la notte in un'incubatrice e in un'immagine a 25 gradi centigradi.</li>
</ol>5. Fissaggio e immunostaining
<ol><li>Dal passo 2.10 sopra, utilizzare una pipetta di pasteur di vetro per trasferire i testicoli in un pozzo in un piatto di seziono di vetro 9-po ' contenente 0,5 mL di paraformaldeide 8% in PBSTx (fosfato bufferizzato salina con 0.3% Triton X-100). Assicurarsi che i testicoli siano posati sul fondo del piatto. NOT:</</c0> La paraformaldeide è tossica e deve essere maneggiata con i guanti in una cappa di fumi.</li>
	<li>Fissare i testicoli per 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire i testicoli in un pozzo contenente 0,5 mL PBSTx. Lavaggio per 5 min con agitazione delicata. Ripetere il passaggio di lavaggio in nuovi pozzi con PBSTx fresco altre due volte.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo primario alla concentrazione desiderata in PBSTx da 0,5 mL contenente il 5% di albumina del siero bovino (BSA) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Trasferire i testicoli dal piatto di seziono di vetro a 9 pozzetti al tubo di anticorpo primario diluito e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi con dondolo delicato o nutazione.</li>
	<li>Lavare i testicoli in 0,5 mL di PBSTx per 5 min in un pozzo di un piatto di sedizione in vetro di 9 pozzetti. Ripetere il passo di lavaggio con PBSTx fresco altre due volte.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo secondario in 250 gradi l di PBSTx contenente il 5% di BSA e dispensare in un pozzo pulito di un piatto di sedizione in vetro 9-well. Se lo si desidera, aggiungere DAPI al DNA macchia. Trasferire i testicoli nel pozzo contenente anticorpi secondari, coprire con involucro di plastica, e incubare al buio con agitazione delicata per 4 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire i testicoli in un pozzo pulito riempito con 0,5 mL di PBSTx. Lavare con PBSTx fresco due volte per 5 min e una terza volta per 30 min.</li>
</ol>6. Montaggio teste fissi
<ol><li>Trasferire i testicoli dall'ultimo lavaggio su uno scivolo di microscopia in vetro utilizzando una pipetta Pasteur. Se necessario, utilizzare il bordo dello strumento bisturi per spingere le testicoli verso il basso sulla superficie del vetrino.</li>
	<li>Utilizzare l'angolo di una delicata pulizia del compito per eliminare il liquido in eccesso dai testicoli. Rimuovere il più liquido possibile.</li>
	<li>Applicare una goccia di 30-50 gradi del supporto di montaggio della microscopia ai testicoli.</li>
	<li>Posizionare un coperchio di 22 mm sulla goccia del supporto di montaggio e lasciare che il coperchio si stabilizzi e il supporto di montaggio per diffondersi sotto il coperchio. Applicare una leggera pressione sul coperchio se necessario per spremere il supporto di montaggio in eccesso e lasciare che il coperchio poggia sulla superficie dei testicoli.</li>
	<li>Utilizzare smalto per sigillare i bordi del coverslip.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo descritto un protocollo per la preparazione di testicoli della Drosophila larvale o pupilla precoce, ottimizzato per l'imaging live a lungo termine della divisione delle cellule di spermatocite. Questo è un metodo potente per l'analisi della divisione cellulare nel contesto fisiologico del tessuto intatto. Il potere di questo metodo è ulteriormente ampliato se combinato con strumenti genetici della Drosophila, come specifiche mutazioni genetiche, soppressione mediata dall'RNAi specifici dei tess...

La divisione cellulare è spesso studiata utilizzando linee cellulari coltivate nella coltura1. Mentre abbiamo acquisito una ricchezza di informazioni e comprensione inestimabili dei meccanismi fondamentali da questi studi2, le cellule coltivate in coltura non possono ricapitolare completamente la fisiologia della divisione cellulare come si verifica in tessuto intatto e vivente. Ad esempio, nei tessuti e negli organi intatti, le cellule devono dividersi nel posto giusto e al momento giusto in modo che le cellule progenie siano correttamente posizionate all'interno del tessuto, in modo che possano sottoporsi a opportune differenziazioni o programmi funzionali, e in modo che la proliferazione cellulare sia adeguatamente coordinata con la crescita del tessuto o l'omeostasi3 . Per le cellule cresciute nella coltura d'altra parte, la divisione cellulare è generalmente regolata da fattori di crescita nel mezzo di coltura4, e quindi non possiamo imparare da queste cellule come fattori ambientali in vivo come l'architettura dei tessuti o la segnalazione dello sviluppo influenzano il processo di divisione. È anche importante notare che molte delle linee cellulari utilizzate per studiare la divisione cellulare, come le cellule HeLa e U2OS, sono state derivate da tumori metastatici5. Pertanto, molti aspetti della fisiologia di base di queste cellule tumorali, come i meccanismi regolatori del ciclo cellulare e la stabilità cromosomica, sono stati probabilmente alterati rispetto alle cellule sane. La comprensione completa della fisiologia della divisione cellulare, quindi, dipende dalla nostra capacità di studiare le cellule divisorie nei loro ambienti nativi in vivo che preservano i meccanismi regolatori fisiologici e l'architettura dei tessuti.
I progressi nella comprensione del funzionamento della divisione cellulare all'interno di tessuti e organi intatti sono ostacolati da difficoltà inerenti all'analisi in vivo o ex vivo. In primo luogo, può essere difficile o impossibile accedere alle cellule divisorie per l'analisi microscopica all'interno di grandi organi o tessuti spessi. In secondo luogo, è spesso difficile prevedere quando le singole cellule si dividono in vivo. In terzo luogo, la fisiologia dei tessuti può deteriorarsi rapidamente durante la coltura ex vivo. In questo protocollo, descriviamo metodi facilmente accessibili per l'analisi live e fissa degli spermatociti della Drosophila melanogaster mentre vengono sottoposti a divisioni cellulari meiotiche all'interno di testicoli completamente intatti. Queste cellule sono ideali per l'analisi live, ex vivo perché sono facilmente accessibili con metodi ottici standard come la microscopia confocale, si dividono in tempi e luoghi prevedibili e i teste intatti possono essere mantenuti nella coltura ex vivo fino a circa 24 h. Inoltre, gli spermatociti della Drosophila sono grandi cellule rotonde (circa 20-30 m di diametro) che non cambiano forma quando si dividono, il che le rende ideali per l'imaging ad alta risoluzione e time-lapse di componenti cellulari come l'apparato del mandrino e gli organelli citoplasmici. Anche se queste cellule subiscono la meiosi al contrario della mitosi, molti dei processi di divisione cellulare essenziali sono molto simili tra questi meccanismi di divisione delle due cellule6. Questi vantaggi, combinati con potenti strumenti genetici della Drosophila, hanno reso gli spermatociti della Drosophila un modello ampiamente utilizzato per l'analisi ex vivo di processi di divisione cellulare essenziali, tra cui la formazione e la regolazione del mandrino, la citochina e il rimodellamento delle orgenelle e la partizionamentodi 7,8,9,10,11.
Gli spermatociti sono cellule che sono allo stadio meiotico della spermatogenesi. In Drosophila,la spermatogenesi inizia con un gruppo di cellule staminali germinali che si trovano in una piccola regione o "hub" in un polo del testicolo12,13. Queste cellule si dividono per una mitosi asimmetrica, dando origine a un singolo spermatogonio differenziato. La Spermatogonia viene quindi sottoposta a quattro mitosi sincroni per produrre un gruppo di 16 celle che rimangono strettamente associate all'interno di una singola cisti. In questa fase, le cellule passano da un mitotico a un ciclo cellulare meiotico e sono indicate come spermatociti. Gli spermatociti trascorrono circa due o tre giorni in una fase G2 estesa del ciclo cellulare, durante i quali crescono drammaticamente e subiscono cambiamenti citologici in preparazione per le due divisioni meiotiche e la successiva spermiogenesi13,14. L'intero gruppo di 16 spermatociti all'interno di una singola cisti entra quindi nella prima divisione meiotica allo stesso tempo. Così, diversi spermatociti meiotici possono essere immagine contemporaneamente mentre procedono attraverso la divisione cellulare. La prima divisione meiotica procede per circa 1,5 h ed è seguita quasi immediatamente dalla seconda divisione meiotica, producendo 64 spermatidi totali che si differenziano in spermatozoi maturi.
Un vantaggio unico dell'utilizzo di spermatociti per studiare la divisione cellulare nel tessuto vivo e intatto è che gruppi o cisti di cellule progrediscono costantemente attraverso le diverse fasi della spermatogenesi, e le cellule in tutte le fasi della spermatogenesi di solito possono essere identificate in qualsiasi testicolo dato (vedi Figura 3A). Pertanto, è relativamente facile trovare cellule meiotiche in testicoli interi. Generalmente concentriamo le nostre analisi sulla prima anziché sulla seconda meiosi perché queste cellule sono molto più grandi e più suscettibili all'imaging ad alta risoluzione, ma l'intero processo che comprende entrambe le divisioni meiotiche può essere immaginato con successo. Va anche notato che il protocollo generale per la preparazione e la coltura dei testicoli può essere utilizzato per analizzare anche altri processi di spermatogenesi, come le precedenti cellule staminali mitotiche o divisioni spermatogoniche o i cambiamenti citologici che si verificano quando gli spermatidi maturano in spermatozoi15. Molti di questi aspetti della spermatogenesi sono altamente conservati tra la Drosophila e gli esseri umani16.
Gli spermatociti della Drosophila iniziano a raggiungere la fase meiotica della spermatogenesi durante la terza fase larvale instar dello sviluppo della Drosophila 13. Pertanto, i testicoli isolati dalle fasi del ciclo di vita a partire da larve instelle e tra cui pupe e adulti possono essere utilizzati per l'analisi di spermatociti divisori. Diversi protocolli eccellenti sono disponibili per l'estrazione di testicoli da mosche maschili adulte per l'analisi live e fissa della spermatogenesi17,18,19. Questi protocolli possono essere preferibili per studiare le fasi tardive della spermatogenesi o se devono essere utilizzati marcatori genetici che sono visibili solo negli adulti. Il protocollo si concentra invece sulla preparazione dei testicoli da larve e pupe prime, perché i testicoli in queste fasi hanno diversi vantaggi che sono specificamente pertinenti all'analisi della divisione cellulare mediante microscopia ad alta risoluzione e time-lapse. In primo luogo, i testicoli di larve e pupe sono più piccoli di quelli degli adulti e le cellule all'interno dell'organo sono meno affollate. Per questo motivo, la divisione degli spermatociti può spesso essere vista vicino alla superficie esterna dei testicoli larve, senza dover penetrare attraverso più strati di tessuto di dispersione della luce. In secondo luogo, i testicoli adulti si muovono ritmicamente a causa delle contrazioni degli organi accessori collegati, e questi movimenti rendono difficile l'imaging time-lapse di singole cellule. E terzo, i testicoli larvali sono vantaggiosi quando si studiano le mutazioni genetiche che causano la letalità pupa o adulto. I nostri metodi sono ottimizzati per la coltura a lungo termine di testicoli sullo stadio del microscopio, consentendo l'imaging di più cicli di divisione cellulare o la progressione di singole cellule attraverso più fasi di spermatogenesi nella stessa preparazione. Descriviamo anche un protocollo per la fissazione e l'immunostaining di interi teste. Nel complesso, i nostri protocolli sono particolarmente utili per coloro che sono interessati a studiare la divisione cellulare nel tessuto intatto, e la capacità di combinare l'analisi dello spermatocito con strumenti genetici della Drosophila altamente trattabili lo rende un approccio particolarmente potente.

<table><tbody><tr><td>Sonda da dissezione da 5"</td><td>Fisher</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>5,75" Vetro Pasteur Pipet</td><td>Fisher</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>11252-20</td><td>Forcetti dritti con punte fini</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio smerigliati</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td>Vetrini per il montaggio di tessuti fissi, con superficie di scrittura smerigliata</td></tr><tr><td>Olio di alocarbonio 700</td><td>Sigma</td><td>H8898-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Piatto Lumox 50</td><td>Sarstedt</td><td>SAR946077410</td><td>Piatto per coltura tissutale permeabile ai gas</td></tr><tr><td>Coperchio del microscopio Vetro</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>22 mm x 22 mm, vetrino coprioggetti #1,5</td></tr><tr><td>Perni per minuzie Strumenti di</td><td>scienza</td> fine <td>26002-15</td><td>Perni per insetti utilizzati per realizzare strumento per bisturi</td></tr><tr><td>Portaspilli nichelato</td> Strumenti per <td>scienze fini</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide al 32%,</td><td>microscopia elettronica</td> di grado EM Scienze <td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio con bordo smussato in piano</td><td>Fisher</td><td>12-549-5</td><td>Vetrini utilizzati per le dissezioni</td></tr><tr><td>Piastre spot in PYREX</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>Piatto</td></tr> <tr><td>da dissezione in vetro a 9 pozzetti Fisher 13-748BSchneider's Drosophila medium</td><td>Fisher</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa, 0,22 &; m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Mezzo di montaggio per microscopia</td></tr></tbody></table>

preparazione dei test di drosophila larval e pupal per l'analisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

L'analisi sperimentale delle cellule che si dividono in tessuti e organi vivi e intatti è essenziale per la nostra comprensione di come la divisione cellulare si integra con lo sviluppo, l'omeostasi dei tessuti e i processi della malattia. Gli spermatociti di Drosophila sottoposti a meiosi sono ideali per questa analisi perché (1) testiti di Drosophila interi contenenti spermatociti sono relativamente facili da preparare per la microscopia, (2) le grandi dimensioni degli spermatociti li rendono adatti per l'imaging ad alta risoluzione e (3) potenti strumenti genetici della Drosophila possono essere integrati con l'analisi in vivo. Qui, presentiamo un protocollo facilmente accessibile per la preparazione di interi testicoli da Drosophila terza larve instar e pupe prime. Descriviamo come identificare gli spermatociti meiotici in teste interi preparati e come immaginerli dal vivo per microscopia time-lapse. Vengono inoltre forniti protocolli per la fissazione e l'immunostaining dei teste interi. L'uso di testicoli larvali ha diversi vantaggi rispetto ai protocolli disponibili che utilizzano testicoli adulti per l'analisi dello spermatocite. Ancora più importante, i testicoli larvali sono più piccoli e meno affollati di cellule rispetto ai testicoli adulti, e questo facilita notevolmente l'imaging ad alta risoluzione degli spermatociti. Per dimostrare questi vantaggi e le applicazioni dei protocolli, presentiamo risultati che mostrano la ridistribuzione del reticolo endoplasmico rispetto ai microtubuli del mandrino durante la divisione cellulare in un unico spermatocito immagine di microscopia confocale time-lapse. I protocolli possono essere combinati con l'espressione di qualsiasi numero di proteine fluorescenti o marcatori di orgelli, così come mutazioni genetiche e altri strumenti genetici, rendendo questo approccio particolarmente potente per l'analisi dei meccanismi di divisione cellulare nel contesto fisiologico di interi tessuti e organi.

Quando questo protocollo viene eseguito con successo, i testicoli rimarranno completamente intatti per l'imaging mediante microscopia confocale o altri metodi di microscopia a fluorescenza. Come si è visto nella Figura 3A, l'organizzazione cellulare dei testicoli è preservata e la progressione della differenziazione cellulare da un'estremità del testicolo all'altra, tra cui spermatogonia, spermatociti e spermatidi aploidi è visibile. GFP-tubulina è un marcatore utile per identificare la divi...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di analizzare la divisione cellulare nel tessuto intatto mediante microscopia cellulare viva e fissa utilizzando spermatociti meioticiti della Drosophila. Il protocollo dimostra come isolare i testicoli interi e intatti dalle larve di Drosophila e dalle prime pupe, e come elaborarli e montarli per la microscopia.

Preparazione dei test di Drosophila Larval e Pupal per l'analisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Questo protocollo può essere utilizzato per analizzare i meccanismi di divisione cellulare nel contesto di tessuti viventi e intatti utilizzando la microscopia a fluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli ambienti fisiologici nativi delle cellule sono preservati, consentendo al contempo l'imaging dal vivo per lunghi corsi di tempo. La parte più importante di questa tecnica è assicurarsi che i tester non siano danneggiati durante la dissezione o il montaggio.Questa è un'abilità che si acquisisce con un po 'di tempo e pratica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, perché mostra come identificare e isolare i tester e come montarli per l'imaging senza danneggiare il tessuto. Prepara animali, strumenti e media come descritto nel manoscritto.Prima di iniziare la dissezione, utilizzare la siringa filtrante riempita di supporto per espellere tre gocce di supporti ciascuno 50 microlitri nella parte superiore, centrale e inferiore di uno scivolo di vetro. Utilizzando una sonda di sezionazione, trasferire da cinque a 10 larve di instar o pupe precolari alla goccia superiore del supporto sullo scivolo. Agitare delicatamente le larve e le pupe nel supporto con la sonda di sezionazione per rimuovere qualsiasi cibo o detriti.Utilizzare la sonda di sezionazione per ruotare una singola larva o pupe su un lato. Cerca i due teste bilaterali che appaiono come strutture ovali traslucide sul terzo posteriore del corpo. Gli animali privi di teste sono femmine e dovrebbero essere scartati.Quando si trovano larve o pupe maschili ed è pulito, spostarlo alla seconda goccia di media. Ripetere fino a quando tre o quattro larve o pupe maschili sono state trasferite alla seconda goccia di media. Quindi lavorando nella seconda goccia di media, afferrare un singolo animale con un paio di forcep nella sua regione centrale, appena anteriore ai teste.Usa un secondo paio di forcep per strappare delicatamente l'animale a metà. Usando un paio di forcep, tenere l'estremità posteriore dell'animale giù sullo scivolo di vetro. Partendo proprio accanto alle forcep, spingere verso il basso sulla cuticola usando il bordo del bisturi.Spostare il bisturi verso l'estremità tagliata dell'animale. Questo espellerà gli organi interni dell'animale, che includono budella, corpi grassi e teste. I teste sono organi ovali incolori e quasi trasparenti incorporati in nastri di corpo grasso.Prendere delicatamente in giro i teste dal resto degli organi. Per trasferire i tester uno alla volta, inserire il bordo del bisturi sotto il corpo grasso, sollevare il tessuto dal supporto e spostarlo rapidamente alla terza goccia. Se non c'è abbastanza corpo grasso ancora attaccato ai teste per sollevare il tessuto con il bisturi utilizzare una pipetta Pasteur di vetro che è stata prewetted con mezzo di dissezione.Lavorando nella terza goccia di mezzo, utilizzare l'estremità affilata del bisturi per affettare delicatamente il corpo grasso in eccesso dai teste, lasciando solo un piccolo bordo di corpo grasso intorno ai bordi. In primo luogo, utilizzare la siringa filtrante per depositare una singola goccia del mezzo Schneider circa 30 microlitri al centro di un piatto di coltura permeabile al gas da 50 millimetri. Utilizzando lo strumento bisturi o una pipetta Pasteur prerivolta trasferire fino a cinque dei tester preparati alla goccia sul piatto.Successivamente, utilizzare lo strumento bisturi per spingere delicatamente i testoli verso il basso sulla membrana permeabile al gas e al centro della goccia di mezzo. Utilizzando una siringa millilitro, posizionare quattro gocce di olio di alocarbonio sulla membrana permeabile al gas che circonda la goccia di mezzo. Le posizioni delle gocce dovrebbero corrispondere ai quattro angoli di una coverlip di classe di 22 millimetri.Quindi allineare gli angoli di un coverslip di vetro di 22 millimetri con le quattro gocce di olio di alocarbonio e abbassare delicatamente il coverslip sul supporto e sull'olio. Lasciare depositare il coperchio e per il supporto contenente i teste la diffusione tra le gocce di olio. Mettere il piatto della coltura al microscopio di sezionamento.Per rimuovere i supporti in eccesso, inserire l'angolo di una delicata salvietta dell'attività sotto il copriscivolo. Assorbi abbastanza supporti per la coverlip di vetro per direttamente a contatto con la superficie del testicolo più grande. Non rimuovere troppi supporti e abbassare troppo il coverslip.Ciò eserciterà pressione sui tester e potrebbe causarne la rottura. Infine, posizionare una goccia di olio ad immersione sul coperchio del vetro appena sopra i testelli. Girare il piatto e posizionarlo sul palco del microscopio.Spostare l'obiettivo del microscopio 40 o 60 X nell'olio fino a quando non è appena sotto i tester. Usa la luce trasmessa per trovare un singolo testicolo e rlo a fuoco. Posizionare 0,5 millilitri di paraformaldeide all'8% in PBSTx in un pozzo di un piatto da nove ben sezionando.Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per trasferire fino a 10 dei tester nel pozzo. Assicurarsi che i teste siano sdraiati sul fondo del pozzo. Dopo 20 minuti, trasferire i tester in un pozzo contenente 0,5 millilitri di PBSTx.Lavare i tester agitando delicatamente per cinque minuti. Lavare altre due volte in nuovi pozzi con PBSTx fresco. Preparare una diluizione dell'anticorpo primario in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri come descritto nel manoscritto.Quindi trasferire i tester dal piatto di sezionatura in vetro a nove pozzi al tubo. Incubare il tubo durante la notte a quattro gradi Celsius con dolce dondolo o nutazione. La procedura per la colorazione dei teste con l'anticorpo secondario è simile.Vedi il manoscritto per i dettagli. In primo luogo, utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire i tester dalla piastra dei nove pozzi su uno scivolo di microscopia in vetro. Se necessario, utilizzare il bordo del bisturi per spingere i tester verso il basso sulla superficie dello scivolo.Quindi, utilizzare l'angolo di una delicata salvietta per eliminare il liquido in eccesso dai teste. Rimuovere il più liquido possibile. Quindi applicare una goccia da 30 a 50 microliter di supporto di montaggio per microscopia ai tester.Infine, posizionare un coverslip di 22 millimetri sulla goccia del mezzo di montaggio. Lasciare depositare il coperchio e stendere il mezzo di montaggio sotto il coverslip. Se necessario, applicare una leggera pressione sul coperchio per spremere il mezzo di montaggio in eccesso e lasciare riposare il coperchio sulla superficie dei tester.Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, l'organizzazione cellulare dei testicoli viene preservata e la progressione della differenziazione cellulare da un'estremità all'altra del testicolo è visibile. Gli spermatociti che iniziano la meiosi e quelli in metafase possono essere identificati. Nei test preparati utilizzando questo protocollo, l'analisi dell'imaging dal vivo mostra la riorganizzazione dinamica del reticolo endoplasmatico e dei micro tubuli nella divisione degli spermatociti.Come descritto nel protocollo, occorre fare molta attenzione a non esercitare pressioni che provocano lo scoppio dei teste. Le cisti degli spermatociti scorrono rapidamente da un testicolo rotto, rendendo difficile l'imaging in tempo reale. Questo protocollo è ottimizzato per l'imaging che divide gli spermatociti nel tessuto vivente e intatto.Pertanto, è essenziale che i tester non siano danneggiati durante la dissezione o il montaggio. Il nostro metodo dovrebbe anche essere adatto per tecniche di imaging a super risoluzione, come la microscopia ad illuminazione strutturata, fornendo nuove informazioni sui processi subcellulari dinamici che governano la divisione cellulare.

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