Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

Présenté ici est un protocole pour générer des tissus conjonctifs modifiés pour une culture parallèle de 48 tissus dans une plaque multi-puits avec des doubles pôles, adapté aux études mécanistes, à la modélisation des maladies et aux applications de dépistage. Le protocole est compatible avec les fibroblastes de différents organes et espèces et est illustré ici avec les fibroblastes cardiaques primaires humains.

Ce protocole permet aux fibroblastes de construire et d’organiser leur propre environnement dans des conditions mécaniques définies. Il en résulte des tissus anisotropes avec une rigidité et des compositions matricielles comparables à l’environnement naturel de la cellule. Cette méthode permet de comparer jusqu’à 48 conditions en parallèle.

Il est flexible en ce qui concerne le type de cellule utilisé et les conditions de culture. En n’utilisant que quelques composants bien définis, il est reproductible entre laboratoires. En appliquant des facteurs pro-fibrotiques ou des médicaments antifibrotiques, ce protocole peut être utilisé pour étudier les processus sous-jacents et les thérapies des maladies fibrotiques de toute nature.

Alisa Degrave, doctorante de notre laboratoire, et moi-même feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, décongelez les fibroblastes cardiaques cryoconservés dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant environ deux minutes jusqu’à ce que le flacon ne reste qu’une petite quantité de glace. Ensuite, transférez la suspension cellulaire goutte à goutte à l’aide d’une pipette sérologique de deux millilitres dans un tube de centrifugeuse stérile approprié contenant 10 millilitres de milieu de croissance des fibroblastes.

Pour une récupération optimale des cellules, rincez le cryo-flacon avec un millilitre de MGF et transférez-le dans le tube de centrifugeuse. Remettez doucement les cellules en suspension et transférez-les dans une fiole de culture cellulaire. Reconstituer les MGF tous les deux jours pendant cinq jours ou jusqu’à ce que les cellules aient atteint 80% de confluence.

Après avoir aspiré le milieu des cellules cultivées, lavez les cellules avec six millilitres de PBS et aspirez, puis ajoutez six millilitres du réactif de dissociation cellulaire aux cellules et incubez jusqu’à ce que le détachement cellulaire soit visible. Neutralisez l’activité enzymatique en ajoutant six à 12 millilitres de MGF aux cellules délogées dans le réactif d’association cellulaire. Pipettez doucement de haut en bas quatre à huit fois à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres pour assurer une suspension à cellule unique et transférez les cellules dans un tube de collecte frais de 50 millilitres.

Vérifiez le rendement à l’aide d’un compteur de cellules automatisé conformément aux instructions du fabricant et abattez les cellules. Après la centrifugation, aspirer le surnageant, faire glisser le tube pour déloger la pastille et remettre en suspension les cellules dans les MGF. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire maillée de 40 micromètres, puis à l’aide d’un compteur de cellules automatisé, évaluez le nombre de cellules et la viabilité par exclusion de courant électrique pour assurer un nombre de cellules fiable avant de procéder à des tissus conjonctifs modifiés ou à la préparation d’ECT.

Pour vous préparer à l’ECT, ajustez la suspension cellulaire aux 8,9 millions de cellules par millilitre à 20 à 25 degrés Celsius en ajoutant des MGF et gardez les cellules sur la glace. Transférer tous les autres tubes contenant les composants individuels du mélange d’hydrogel ECT sur de la glace et pré-refroidir un tube de centrifugeuse vide de 50 millilitres pour préparer le mélange. Commencez à préparer le mélange d’hydrogel ECT en ajoutant les composants décrits dans le texte au tube de centrifugeuse pré-refroidi de 50 millilitres en évitant la formation de bulles d’air.

Tout d’abord, pipettez l’hydrogel de collagène soluble dans l’acide de type I dans une pipette sérologique avec une pointe d’alésage large. Ajustez la teneur en sel de la solution de collagène en ajoutant le DMEM tout en faisant tourbillonner doucement le tube pour un mélange approprié. Pour neutraliser le pH, ajoutez 0,2 hydroxyde de sodium molaire tout en faisant tourbillonner le tube et confirmez la neutralisation en observant la couleur rouge de l’indicateur rouge phénol.

Ajoutez ensuite la suspension de la cellule goutte à goutte tout en faisant doucement tourbillonner le tube. Mélangez la suspension en ne canalisant doucement qu’une seule fois à l’aide d’une pipette sérologique avec une pointe d’alésage large pour éviter la formation de bulles et minimiser la contrainte de cisaillement. Faites tourbillonner doucement le tube 10 fois pour un mélange complet.

Conservez le tube de centrifugeuse contenant le mélange d’hydrogel ECT sur de la glace tout au long du processus de coulée. Mouillez une pointe de pipette d’un millilitre dans un mélange d’hydrogel ECT, puis répartissez 180 microlitres de mélange d’hydrogel uniformément dans chaque moule de la plaque de coulée à 48 puits en évitant les forces de cisaillement excessives qui peuvent affecter l’intégrité de l’assemblage de la matrice de collagène et en veillant à ce que la plaque entière se termine en 15 à 20 minutes. Assurez-vous qu’une boucle complète se forme dans le moule car la distribution discontinue du mélange ECT empêchera la formation d’un anneau ECT complet.

Évitez de pipeter dans le puits intérieur et de former des bulles pendant le pipetage pour assurer une coulée d’hydrogel ECT uniforme pour une formation de tissu homogène et fonctionnelle. Placez soigneusement la plaque de coulée à 48 puits à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire pour reconstituer le mélange d’hydrogel ECT pendant 15 à 30 minutes. Après l’incubation, il apparaît comme un gel et opaque.

Ajouter doucement 600 microlitres de MGF chaudes de 37 degrés Celsius par puits le long du mur pour éviter le détachement ECT par le bas. Remplacez le milieu chaque jour par 500 microlitres de MGF jusqu’à l’analyse. Aux points temporels souhaités, utilisez un stéréomicroscope pour enregistrer des images microscopiques des vues supérieures et latérales de l’ECT.

Utilisez un programme de traitement d’image pour effectuer une analyse de balayage linéaire. Définissez une échelle et utilisez l’outil en ligne droite pour tracer et mesurer les diamètres ECT à un minimum de six positions par bras dans chaque plan d’imagerie. Imagez la plaque de coulée de 48 puits sous un appareil d’enregistrement avec une caméra de balayage de zone intégrée placée à une distance fixe équipée d’un capteur d’image monochrome haute résolution et d’une source de lumière proche UV.

Effectuer une détection automatisée des pointes des pôles contenant un colorant fluorescent pour maximiser le contraste. Mesurez la distance entre les pôles à partir des enregistrements quotidiens à l’aide d’une analyse automatisée en exécutant les images enregistrées sur un logiciel pour détecter les pixels lumineux à contraste élevé sur un fond sombre ou un programme de traitement d’image. Retirez l’ECT des pôles de retenue et insérez un crochet de transfert et une boucle ECT.

Transférez ensuite l’ECT sur deux crochets fixés au bras stationnaire et au bras du transducteur d’un riomètre mécanique dynamique d’extension équipé d’un bain d’orgue trempé de 37 degrés Celsius rempli de PBS. Appliquez une tension uniaxiale à une vitesse linéaire constante en réglant le riomètre à environ 1% de la distance initiale entre les crochets par seconde. Un taux d’étirement constant de 0,03 millimètre par seconde peut être utilisé avec des dimensions ECT typiques.

Déchirez la force du transducteur et initiez l’étirement. Continuez à enregistrer jusqu’au point de rupture de l’ECT après avoir normalisé la force mesurée par zone transversale et tracez la courbe contrainte-déformation en déterminant différents paramètres biomécaniques. Juste avant que le tissu ne commence la micro-fracturation, la limite supérieure de la région élastique correspond à la limite d’élasticité et sa déformation est une mesure de l’élasticité du tissu.

La région plastique se trouve entre la limite d’élasticité et le point de défaillance. Le point de défaillance correspond à une chute soudaine du stress due à la rupture du tissu, définissant la contrainte ultime qui est une mesure de l’extensibilité tissulaire. Le troisième point de mesure correspond à la force maximale définie par la contrainte la plus élevée que le tissu peut supporter sans se casser pendant l’étirement.

La résilience et la ténacité données par la zone sous la courbe correspondent à l’énergie absorbée par le tissu jusqu’au point d’élasticité et au point de défaillance respectivement. Pour chaque courbe obtenue, la pente de la partie linéaire de la région élastique correspond au module de Young, également appelé module élastique. C’est une propriété mécanique qui mesure la rigidité du tissu.

En utilisant ce protocole, le compactage et la contraction de l’ECT dans des conditions de contrôle et en présence de FCS ont suivi quelques heures après la coulée et ont considérablement augmenté jusqu’au cinquième jour. Lorsque l’ECT a été traité avec l’inhibiteur de polymérisation de l’actine Latrunculin A, le compactage de l’ECT a été réduit comme indiqué par la section transversale significativement plus élevée par rapport au contrôle. La contraction des tissus a été évaluée au cours des cinq jours de culture.

En l’absence de latrunculine A, la contraction a progressivement augmenté jusqu’au cinquième jour atteignant environ 40% de contraction. Cependant, la présence de latrunculine A a affecté la contraction des tissus, ce qui n’a entraîné qu’une contraction maximale d’environ 20%. L’inhibition de la polymérisation de l’actine a entraîné une réduction significative d’environ 50% de la rigidité tissulaire sur le contrôle.

Ces résultats démontrent que l’intégrité du cytosquelette de l’actine est essentielle au compactage, à la contraction et au raidissement de l’ECT. Il est important de choisir une solution de collagène fiable et de haute qualité et de s’assurer qu’une suspension unicellulaire à haute viabilité est utilisée pour reconstituer les tissus conjonctifs modifiés.