Name: Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Découvrez une méthode pour générer des tissus conjonctifs anisotropes à partir de fibroblastes humains sous conditions mécaniques définies. Ce protocole permet de comparer jusqu'à 48 conditions en parallèle pour le dépistage de médicaments antifibrotiques.

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Ce travail a été soutenu par la Société allemande de cardiologie (bourse de recherche DGK pour GLS) et par la Fondation allemande pour la recherche (DFG à travers le projet IRTG 1816 pour GLS et AD; DFG 417880571 et DFG TI 956/1-1 pour MT; SFB 1002 TP C04 pour MT et WHZ; SFB 1002 TP S01 pour WHZ; et EXC 2067/1-390729940J pour WHZ). WHZ est soutenu par le ministère fédéral allemand de la Science et de l’Éducation (BMBF à travers le projet IndiHEART) et la Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ et SL sont soutenus par le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK).

GLS et SL ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont contribué à l’élaboration du protocole et ont édité le manuscrit. TM, MT et WHZ sont les conseillers scientifiques de myriamed GmbH. WHZ est le fondateur et actionnaire de myriamed GmbH.

Le protocole présenté décrit la génération d’ECT à partir de la mucoviscidose humaine primaire, ce qui permet d’étudier l’impact mécanique de ces cellules sur leur environnement de matrice extracellulaire et vice versa.
Les fibroblastes doivent être élargis pour produire suffisamment de cellules pour les expériences ECT prévues (0,75 x 106 cellules / ECT). Pour une meilleure reproductibilité, il est conseillé de pré-cultiver des fibroblastes congelés ou dérivés de tissus en culture ...

Un obstacle majeur dans l’étude des maladies fibrotiques est le manque de modèles de tissus 3D humains représentatifs qui fournissent un aperçu du comportement des fibroblastes et de leurs dérivés pathologiques. Pour étudier les processus fibrotiques, les systèmes de culture 2D standard sont sous-optimaux puisque les fibroblastes isolés se transdifférencient rapidement en myofibroblastes exprimant l’actine musculaire α lisse (SMA) lorsqu’ils sont cultivés sur des substrats 2D non conformes1,2,3. Ainsi, les fibroblastes de la culture 2D standard ne reflètent pas un phénotype tissulaire « sain » régulier3,4,5,6. Des cultures sur substrats souples ont été introduites pour simuler des environnements tissulaires non fibrotiques (10 kPa) et fibrotiques (35 kPa)7, mais ceux-ci n’ont pas la troisième dimension, ce qui est très important en ce qui concerne la physiopathologie. L’ingénierie tissulaire offre la possibilité de surmonter cette limitation en permettant la culture de fibroblastes dans un contexte défini et expérimentalement accordable de matrice extracellulaire (ECM), par exemple, par des altérations de la cellularité, de la composition ecm et de la concentration ECM, qui peuvent toutes déterminer la biomécanique tissulaire.
Divers modèles 3D ont été générés à l’aide de fibroblastes. Les disques flottants et les microsphères ont été parmi les premiers et démontrent que le collagène est remodelé et compacté en fonction du temps. Les fibroblastes exercent des forces de traction sur les fibrilles de collagène, un processus qui peut être facilité par l’ajout d’agents pro-fibrotiques tels que le facteur de croissance transformant bêta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Cependant, les cultures flottant librement ne permettent pas la charge externe contrôlée et constituent donc des modèles de rétrécissement ou de compactage continus. Les tissus modifiés en forme de feuille ont ouvert la possibilité d’étudier la régulation homéostatique des propriétés biomécaniques des tissus, notamment par des tests de déformation uni, bi, multiaxiale ou cyclique.17,18,19,20. Ces modèles ont été utilisés, par exemple, pour démontrer l’influence du nombre de cellules sur la rigidité tissulaire, qui s’est avérée être en corrélation positive avec l’intégrité du cytosquelette et la contractilité du cytosquelette d’actomyosine.18,19. Cependant, il est important de noter que les conversions force-déformation sont compliquées par la déformation tissulaire non uniforme autour des points de serrage des transducteurs de force et des points d’ancrage. Cette limitation inhérente peut être contournée par des tissus en forme d’os de chien ou d’anneau, offrant une certaine application tissulaire aux points d’ancrage.21,22,23. Les tissus en forme d’anneau peuvent être préparés en distribuant un hydrogel de collagène cellulaire dans des moules en forme d’anneau. Au fur et à mesure que l’hydrogel se compacte, un tissu se forme autour de la tige interne incompressible du moule, ce qui offre une résistance à la contraction ultérieure des tissus.24,25,26,27. Après un compactage initial et généralement maximal, les tissus peuvent également être transférés à des entretoises réglables pour restreindre davantage l’ECT circulaire à une longueur de tissu définie.3,24,25,26,27,28,29,30. Les propriétés biophysiques peuvent être évaluées dans des dispositifs de contrainte de déformation horizontaux ou verticaux standard avec des capteurs de pesage appropriés sous déformation unidirectionnelle ou dynamique3. Comme les tissus ont une structure circulaire largement uniforme et peuvent être maintenus sur des barres / crochets (points d’ancrage et / ou transducteurs de force), bien que ceux-ci puissent encore entourer des zones de compression autour des barres de chargement, ce format permet une variation de déformation plus uniforme par rapport au serrage3. De plus, les tissus ancrés provoquent une forme de cellule bipolaire, et les cellules s’adaptent aux forces tissulaires en s’allongeant le long des lignes de force favorisant la traction anisotrope31,32,33,34,35,36. Nous avons déjà appliqué de l’ECT en forme d’anneau à partir de fibroblastes cardiaques (FK) de rats et d’humains autour d’un seul pôle rigide dans des expériences de contrainte fonctionnelle et effectué des études de gain et de perte de fonction en utilisant des fibroblastes transductés viralement24,25,26 et études pharmacologiques37. De plus, nous avons pu identifier les différences entre les sexes dans la fibrose médiée par la mucoviscidose dans le modèle ECT27.
Le protocole suivant pour la génération d’ECT humain, illustré par la mucoviscidose humaine primaire obtenue sous forme de mucoviscidose cryoconservée auprès de fournisseurs commerciaux (voir Tableau des matériaux), combine les avantages des tissus en forme d’anneau avec un moyen simple et rapide de produire des tissus macroscopiques pour une plate-forme de 48 puits conçue pour des tests parallèles à haute teneur.
Il est important de noter que le modèle ECT ne se limite pas à un type spécifique de fibroblastes, avec l’utilisation documentée dans l’étude d’autres fibroblastes, par exemple les fibroblastes de la peau38,39. De plus, les fibroblastes issus des biopsies des patients fonctionnent tout aussi bien, et le choix des fibroblastes dépend en fin de compte de la question scientifique à aborder.
La plate-forme utilisée pour la génération d’ECT décrite dans ce protocole est une plaque de culture cellulaire/tissulaire 3D de 48 puits disponible dans le commerce (Figure 1A). Les méthodes de préparation, de culture et de surveillance de la formation et du fonctionnement de l’ECT sous une géométrie et une charge mécanique définies à l’aide de la plaque de 48 puits sont décrites. Les ECT formés sont maintenus par des poteaux flexibles intégrés et la charge mécanique peut être ajustée en fonction de l’objectif final en utilisant des poteaux de dureté différente (valeur Shore A 36-89), influençant leurs rigidités en flexion. Les poteaux avec un rivage Une valeur de 46 sont recommandés. Le protocole est, en outre, compatible avec un moule circulaire personnalisé décrit précédemment, où l’ECT est maintenu autour d’une seule tige rigide37. Les dimensions de ce moule sont données à la figure 1B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique des moules de coulée. (A) Dessin technique et dimensions d’un moule de coulée avec deux pôles flexibles. Le moule comprend une circonférence intérieure délimitée par une paroi courte qui maintient des doubles pôles de retenue au corps principal du moule. Les pôles flexibles ont une distance horizontale libre les uns par rapport aux autres et sont connectés à la base. Le moule permet un volume de coulée de 180 μL. Le puits de chaque moule permet une capacité de volume d’au moins 600 μL de milieux de culture. Différentes compositions de matériaux peuvent être utilisées pour produire des pôles avec des rigidités spécifiques (par exemple, TM5MED-TM9MED). (B) Dessin technique et dimensions d’un moule en forme d’anneau avec une seule tige rigide. Il s’agit d’un moule alternatif avec une géométrie et un environnement mécanique distincts, qui peut être utilisé avec le protocole de coulée ECT37. La méthode d’assemblage du moule en forme d’anneau a été adaptée à partir de formats plus grands publiés28,41. En bref, la méthode comprend (1) l’impression d’entretoises de moulage en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (8 mm de diamètre) dans du polydiméthylsiloxane (PDMS, silicone) versé dans des boîtes en verre (diamètre 60 mm), et (2) la fixation d’un support de poteau PDMS (1,5 mm de diamètre) concentriquement à l’intérieur de la cavité creuse formée, qui sert à (3) maintenir un pôle amovible (tube en silicone de 4 mm de diamètre). L’espace creux résultant permet 180 μL de volume de coulée. Chaque plat en verre peut contenir plusieurs moules imprimés (illustrés de manière exemplaire avec 5 moules) et a une capacité allant jusqu’à 5 mL de milieu de culture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Réactifs de culture cellulaire :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution d’accutase</td><td>Merk Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dissociation &ndash ; TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) en poudre, à haute teneur en glucose</td><td>Gibco</td><td>12100061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (DPBS), pH 7,2, -Ca2+, -Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>FBM&nbsp ; Croissance des fibroblastes Milieu basal</td><td>Lonza</td><td>CC-3131</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 Moyenne de croissance des fibroblastes-2 SingleQuots,&nbsp ; Suppléments et facteurs de croissance</td><td>Lonza</td><td>CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des fibroblastes 3 KIT</td><td>PromoCell</td><td>C-23130</td><td></td></tr><tr><td>Milieu basal des fibroblastes 3</td><td>PromoCell</td><td>C-23230</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance 3 SupplementPack</td><td>PromoCell</td><td>C-39350</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline (10000 U/mL)/ Streptomycine (10000 &mu ; L/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) 1,0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sources cellulaires :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes cardiaques humains normaux du ventricule (NHCF-V)</td><td>Lonza</td><td>CC-2904</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes cardiaques humains (HCF-c)</td><td>PromoCell</td><td>C-12375</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes cardiaques humains ( HCF-p)</td><td>PromoCell</td><td>C-12377</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes primaires du prépuce humain-1 (HFF-1)</td><td>ATCC</td><td>SCRC- 1041</td><td></td></tr><tr><td>Sources de</td><td></td><td></td><td></td> collagène</tr> :<tr><td>Collagène de type I (bovin) dans 0,01 M HCl</td><td>LLC Collagen Solutions</td><td>FS22024</td><td>6-7 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagène de type I (queue de rat) dans 0,02 M HCl</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>~4 mg/mL</td></tr><tr><td>Médicaments :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin-A (Lat-A)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td></td></tr><tr><td>Vaisselle en plastique :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaisselle en plastique de culture cellulaire</td><td>Sarstedt et Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Passoire à cellules maillées (Nylon, taille des pores 40 &mu ; m)</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>myrPlate-uniform</td><td>myriamed GmbH</td><td>TM5 med</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques à grande ouverture, stériles (10 mL)</td><td>Corning</td><td>07-200-619</td><td></td></tr><tr><td>Instruments spécifiques :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lentille bi-télécentrique CORE pour détecteurs 1/2&Prime ;</td><td>OptoEngineering</td><td>TCCR12096</td><td></td></tr><tr><td>Caméra à balayage matriciel Basler ace acA4024</td><td>Bâloise</td><td>107404</td><td></td></tr></tbody></table>

tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Les fibroblastes sont des cellules phénotypiquement très dynamiques, qui se transdifférencient rapidement en myofibroblastes en réponse à des stimuli biochimiques et biomécaniques. La compréhension actuelle des processus fibrotiques, y compris la fibrose cardiaque, reste médiocre, ce qui entrave le développement de nouvelles thérapies anti-fibrotiques. Des systèmes modèles humains contrôlables et fiables sont essentiels pour une meilleure compréhension de la pathologie de la fibrose. Il s’agit d’un protocole hautement reproductible et évolutif pour générer des tissus conjonctifs (ECT) dans une plaque de coulée de 48 puits afin de faciliter l’étude des fibroblastes et la physiopathologie du tissu fibrotique dans un environnement en 3 dimensions (3D). Les ECT sont générés autour des pôles avec une rigidité accordable, ce qui permet des études sous une charge biomécanique définie. Dans les conditions de charge définies, les adaptations phénotypiques contrôlées par les interactions cellule-matrice peuvent être étudiées. Les tests parallèles sont réalisables dans le format 48 puits avec la possibilité d’analyser le temps de plusieurs paramètres, tels que le compactage et la contraction des tissus par rapport à la charge. À partir de ces paramètres, des propriétés biomécaniques telles que la rigidité et l’élasticité des tissus peuvent être étudiées.

Les ECT atteignent environ 95 % de compactage par rapport au volume initial d’hydrogel de collagène cellulaire dans les 24 premières heures. Le compactage et la contraction des tissus dans des conditions de contrôle et en présence de FCS s’ensuivent quelques heures après la coulée et augmentent notablement jusqu’au jour 5 (Figure 5A). La déviation des pôles peut encore augmenter au cours des 15 jours suivants (20 jours ont été la plus longue période testée). L’ampleur de la déviation des pôl...

Présenté ici est un protocole pour générer des tissus conjonctifs modifiés pour une culture parallèle de 48 tissus dans une plaque multi-puits avec des doubles pôles, adapté aux études mécanistes, à la modélisation des maladies et aux applications de dépistage. Le protocole est compatible avec les fibroblastes de différents organes et espèces et est illustré ici avec les fibroblastes cardiaques primaires humains.

Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Ce protocole permet aux fibroblastes de construire et d’organiser leur propre environnement dans des conditions mécaniques définies. Il en résulte des tissus anisotropes avec une rigidité et des compositions matricielles comparables à l’environnement naturel de la cellule. Cette méthode permet de comparer jusqu’à 48 conditions en parallèle.Il est flexible en ce qui concerne le type de cellule utilisé et les conditions de culture. En n’utilisant que quelques composants bien définis, il est reproductible entre laboratoires. En appliquant des facteurs pro-fibrotiques ou des médicaments antifibrotiques, ce protocole peut être utilisé pour étudier les processus sous-jacents et les thérapies des maladies fibrotiques de toute nature.Alisa Degrave, doctorante de notre laboratoire, et moi-même feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, décongelez les fibroblastes cardiaques cryoconservés dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant environ deux minutes jusqu’à ce que le flacon ne reste qu’une petite quantité de glace. Ensuite, transférez la suspension cellulaire goutte à goutte à l’aide d’une pipette sérologique de deux millilitres dans un tube de centrifugeuse stérile approprié contenant 10 millilitres de milieu de croissance des fibroblastes.Pour une récupération optimale des cellules, rincez le cryo-flacon avec un millilitre de MGF et transférez-le dans le tube de centrifugeuse. Remettez doucement les cellules en suspension et transférez-les dans une fiole de culture cellulaire. Reconstituer les MGF tous les deux jours pendant cinq jours ou jusqu’à ce que les cellules aient atteint 80% de confluence.Après avoir aspiré le milieu des cellules cultivées, lavez les cellules avec six millilitres de PBS et aspirez, puis ajoutez six millilitres du réactif de dissociation cellulaire aux cellules et incubez jusqu’à ce que le détachement cellulaire soit visible. Neutralisez l’activité enzymatique en ajoutant six à 12 millilitres de MGF aux cellules délogées dans le réactif d’association cellulaire. Pipettez doucement de haut en bas quatre à huit fois à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres pour assurer une suspension à cellule unique et transférez les cellules dans un tube de collecte frais de 50 millilitres.Vérifiez le rendement à l’aide d’un compteur de cellules automatisé conformément aux instructions du fabricant et abattez les cellules. Après la centrifugation, aspirer le surnageant, faire glisser le tube pour déloger la pastille et remettre en suspension les cellules dans les MGF. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire maillée de 40 micromètres, puis à l’aide d’un compteur de cellules automatisé, évaluez le nombre de cellules et la viabilité par exclusion de courant électrique pour assurer un nombre de cellules fiable avant de procéder à des tissus conjonctifs modifiés ou à la préparation d’ECT.Pour vous préparer à l’ECT, ajustez la suspension cellulaire aux 8,9 millions de cellules par millilitre à 20 à 25 degrés Celsius en ajoutant des MGF et gardez les cellules sur la glace. Transférer tous les autres tubes contenant les composants individuels du mélange d’hydrogel ECT sur de la glace et pré-refroidir un tube de centrifugeuse vide de 50 millilitres pour préparer le mélange. Commencez à préparer le mélange d’hydrogel ECT en ajoutant les composants décrits dans le texte au tube de centrifugeuse pré-refroidi de 50 millilitres en évitant la formation de bulles d’air.Tout d’abord, pipettez l’hydrogel de collagène soluble dans l’acide de type I dans une pipette sérologique avec une pointe d’alésage large. Ajustez la teneur en sel de la solution de collagène en ajoutant le DMEM tout en faisant tourbillonner doucement le tube pour un mélange approprié. Pour neutraliser le pH, ajoutez 0,2 hydroxyde de sodium molaire tout en faisant tourbillonner le tube et confirmez la neutralisation en observant la couleur rouge de l’indicateur rouge phénol.Ajoutez ensuite la suspension de la cellule goutte à goutte tout en faisant doucement tourbillonner le tube. Mélangez la suspension en ne canalisant doucement qu’une seule fois à l’aide d’une pipette sérologique avec une pointe d’alésage large pour éviter la formation de bulles et minimiser la contrainte de cisaillement. Faites tourbillonner doucement le tube 10 fois pour un mélange complet.Conservez le tube de centrifugeuse contenant le mélange d’hydrogel ECT sur de la glace tout au long du processus de coulée. Mouillez une pointe de pipette d’un millilitre dans un mélange d’hydrogel ECT, puis répartissez 180 microlitres de mélange d’hydrogel uniformément dans chaque moule de la plaque de coulée à 48 puits en évitant les forces de cisaillement excessives qui peuvent affecter l’intégrité de l’assemblage de la matrice de collagène et en veillant à ce que la plaque entière se termine en 15 à 20 minutes. Assurez-vous qu’une boucle complète se forme dans le moule car la distribution discontinue du mélange ECT empêchera la formation d’un anneau ECT complet.Évitez de pipeter dans le puits intérieur et de former des bulles pendant le pipetage pour assurer une coulée d’hydrogel ECT uniforme pour une formation de tissu homogène et fonctionnelle. Placez soigneusement la plaque de coulée à 48 puits à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire pour reconstituer le mélange d’hydrogel ECT pendant 15 à 30 minutes. Après l’incubation, il apparaît comme un gel et opaque.Ajouter doucement 600 microlitres de MGF chaudes de 37 degrés Celsius par puits le long du mur pour éviter le détachement ECT par le bas. Remplacez le milieu chaque jour par 500 microlitres de MGF jusqu’à l’analyse. Aux points temporels souhaités, utilisez un stéréomicroscope pour enregistrer des images microscopiques des vues supérieures et latérales de l’ECT.Utilisez un programme de traitement d’image pour effectuer une analyse de balayage linéaire. Définissez une échelle et utilisez l’outil en ligne droite pour tracer et mesurer les diamètres ECT à un minimum de six positions par bras dans chaque plan d’imagerie. Imagez la plaque de coulée de 48 puits sous un appareil d’enregistrement avec une caméra de balayage de zone intégrée placée à une distance fixe équipée d’un capteur d’image monochrome haute résolution et d’une source de lumière proche UV.Effectuer une détection automatisée des pointes des pôles contenant un colorant fluorescent pour maximiser le contraste. Mesurez la distance entre les pôles à partir des enregistrements quotidiens à l’aide d’une analyse automatisée en exécutant les images enregistrées sur un logiciel pour détecter les pixels lumineux à contraste élevé sur un fond sombre ou un programme de traitement d’image. Retirez l’ECT des pôles de retenue et insérez un crochet de transfert et une boucle ECT.Transférez ensuite l’ECT sur deux crochets fixés au bras stationnaire et au bras du transducteur d’un riomètre mécanique dynamique d’extension équipé d’un bain d’orgue trempé de 37 degrés Celsius rempli de PBS. Appliquez une tension uniaxiale à une vitesse linéaire constante en réglant le riomètre à environ 1% de la distance initiale entre les crochets par seconde. Un taux d’étirement constant de 0,03 millimètre par seconde peut être utilisé avec des dimensions ECT typiques.Déchirez la force du transducteur et initiez l’étirement. Continuez à enregistrer jusqu’au point de rupture de l’ECT après avoir normalisé la force mesurée par zone transversale et tracez la courbe contrainte-déformation en déterminant différents paramètres biomécaniques. Juste avant que le tissu ne commence la micro-fracturation, la limite supérieure de la région élastique correspond à la limite d’élasticité et sa déformation est une mesure de l’élasticité du tissu.La région plastique se trouve entre la limite d’élasticité et le point de défaillance. Le point de défaillance correspond à une chute soudaine du stress due à la rupture du tissu, définissant la contrainte ultime qui est une mesure de l’extensibilité tissulaire. Le troisième point de mesure correspond à la force maximale définie par la contrainte la plus élevée que le tissu peut supporter sans se casser pendant l’étirement.La résilience et la ténacité données par la zone sous la courbe correspondent à l’énergie absorbée par le tissu jusqu’au point d’élasticité et au point de défaillance respectivement. Pour chaque courbe obtenue, la pente de la partie linéaire de la région élastique correspond au module de Young, également appelé module élastique. C’est une propriété mécanique qui mesure la rigidité du tissu.En utilisant ce protocole, le compactage et la contraction de l’ECT dans des conditions de contrôle et en présence de FCS ont suivi quelques heures après la coulée et ont considérablement augmenté jusqu’au cinquième jour. Lorsque l’ECT a été traité avec l’inhibiteur de polymérisation de l’actine Latrunculin A, le compactage de l’ECT a été réduit comme indiqué par la section transversale significativement plus élevée par rapport au contrôle. La contraction des tissus a été évaluée au cours des cinq jours de culture.En l’absence de latrunculine A, la contraction a progressivement augmenté jusqu’au cinquième jour atteignant environ 40% de contraction. Cependant, la présence de latrunculine A a affecté la contraction des tissus, ce qui n’a entraîné qu’une contraction maximale d’environ 20%. L’inhibition de la polymérisation de l’actine a entraîné une réduction significative d’environ 50% de la rigidité tissulaire sur le contrôle.Ces résultats démontrent que l’intégrité du cytosquelette de l’actine est essentielle au compactage, à la contraction et au raidissement de l’ECT. Il est important de choisir une solution de collagène fiable et de haute qualité et de s’assurer qu’une suspension unicellulaire à haute viabilité est utilisée pour reconstituer les tissus conjonctifs modifiés.

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Le protocole suivant présente une méthode d’extrusion basée sur le cisaillement pour la fabrication d’hydrogels de collagène avec des fibrilles à motifs nanométriques, qui peut être appliquée à un large éventail d’applications d’ingénierie tissulaire.

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Découvrez une méthode pour générer des tissus conjonctifs anisotropes à partir de fibroblastes humains sous conditions mécaniques définies. Ce protocole permet de comparer jusqu'à 48 conditions en parallèle pour le dépistage de médicaments antifibrotiques.

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