Génie génétique des organoïdes intestinaux de souris primaires utilisant les vecteurs viraux de transduction magnétique de nanoparticule pour la section congelée

Nous décrivons des instructions étape par étape à : 1) engineerly organoids intestinal utilisant des nanoparticules magnétiques pour la transduction lenti- ou rétroviral, et, 2) produisent des sections congelées des organoïdes machinés. Cette approche fournit un outil puissant pour modifier efficacement l'expression des gènes chez les organoïdes pour l'étude des effets en aval.

Puisque les organoïdes récapitulent l’organisation structurale indigène, aussi bien que beaucoup de dispositifs moléculaires de l’épithélium intestinal in vivo, cette technique nous permet d’étudier la biologie normale et les états de maladie dans le laboratoire. Le principal avantage de cette technique est la capacité de concevoir génétiquement organoïdes en utilisant une approche de transduction très efficace avec une faible cytotoxicité, permettant ainsi des études fonctionnelles de ces organoïdes génétiquement manipulés. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie pour la maladie intestinale parce que nous pouvons exposer des organoïdes intestinaux aux drogues et à d’autres agents ou interventions.

Cette méthode peut être appliquée pour étudier les processus développementaux et pathologiques dans d’autres systèmes favorables aux cultures organoïdes, comme les tissus mammaires ou pour les cellules qui poussent dans des conditions 2D standard. En général, les personnes nouvelles à cette méthode réussiront avec la transduction dans les organoïdes difficiles à concevoir ou d’autres cellules. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons rencontré des difficultés à traduire nos organoïdes et nos cellules souches.

La démonstration visuelle de cette méthode est critique car la perte structurale des organoïdes peut se produire si les échantillons ne sont pas correctement traités pendant le processus d’intégration dans la matrice du sous-sol pour la cryosection. Pour cultiver des organoïdes pour la transduction virale, les cultures de cellules organoïdes de graine avec 200 microlitres de milieu de transduction par puits dans une plaque de 48 puits, et d’incubation dans un incubateur standard de culture tissulaire. Décongeler les flacons de virus pour la transduction, ce qui permet environ 50 microlitres de virus concentrés pour la transduction de chaque puits dans des plaques de 48 puits.

Dans un tube de 1,5 millilitre, mélanger le virus avec 12 microlitres d’une solution de nanoparticules magnétiques et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, ajouter la solution de nanoparticule magnétique et le mélange de virus aux cellules à transduire. Placez la plaque de 48 puits sur une plaque magnétique et incubez dans un incubateur standard de culture tissulaire pendant au moins deux heures.

Lorsque la transfection virale est terminée, transférez les grappes de cellules organoïdes infectées et le milieu de transduction de chaque puits dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifugeuse à 500 fois g pendant cinq minutes. Jeter le supernatant avec aspiration douce, et refroidir les tubes contenant la pastille sur la glace pendant cinq minutes.

Ajouter 120 microlitres de matrice membranaire du sous-sol à chaque tube, et résuspendre la pastille en pipetting lentement de haut en bas. Graines 30-microlitres gouttes du mélange matrice-cellule dans une nouvelle plaque de 48 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq à 15 minutes jusqu’à ce que la matrice se solidifie.

Ajouter le milieu de transduction à chaque puits et incuber dans un incubateur standard de culture tissulaire pendant trois à quatre jours. Après trois à quatre jours, inspecter les cultures au microscope léger à 10 x grossissement pour assurer l’organisation des grappes cellulaires en structures organoïdes. Remplacez doucement le milieu de transduction dans chaque puits par 250 microlitres de culture organoïde ENR medium.

Remettre l’assiette à l’incubateur. Commencez cette procédure en enlevant le milieu ENR par aspiration douce, en prenant soin de ne pas perturber la matrice membranaire du sous-sol. Laver délicatement avec 500 microlitres de PBS.

Fixez les organoïdes en ajoutant un microlitre de solution de paraformaldéhyde de 4 % par puits et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Après 30 minutes, retirer la solution de paraformaldéhyde par aspiration. Ajouter délicatement un microlitre de PBS par puits, puis retirer le PBS par aspiration douce.

De cette façon, laver deux fois avec PBS. Retirez le PBS du deuxième lavage et ajoutez un microlitre de tampon de saccharose de 30 % à chaque échantillon. Incuber les organoïdes fixes dans le saccharose pendant une heure à quatre degrés Celsius pour déshydrater les échantillons.

Retirez le tampon saccharose par aspiration, et ajoutez juste assez de composé d’intégration pour couvrir la couche matricielle dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, placez les échantillons dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que le composé d’intégration soit solide et blanc.

Placez la plaque avec du composé d’intégration congelé à température ambiante pour permettre une fusion minimale du composé le long des bords. Utilisez un scalpel ou une spatule pour séparer le bloc des parois du puits. Travaillez rapidement pour éviter la fonte, en utilisant des forceps pour enlever la matrice intégrant le bloc composé, et placez-le dans un bloc de spécimens.

Remplissez complètement le moule avec du composé d’intégration. Congeler à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes avant d’utiliser le bloc pour la section. Ce protocole a été optimisé en transduisant d’abord des organoïdes intestinaux avec des vecteurs lentiviraux liés au GFP.

Le GFP a été visualisé à chaque étape du développement organoïde, y compris très tôt lorsque les cellules de crypte s’organisent en structures cystiques ou à des moments ultérieurs où les organoïdes forment des bourgeons. Avec succès les organoïdes intestinaux transduced ont été alors formalin-fixés, cryosectioned, et analysés par la formation image d’immunofluorescence. Dans cette image, les noyaux sont tachés de bleu, et le vert indique des molécules épithéliales d’adhérence cellulaire, qui délimite les bordures cellulaires.

Le rouge indique la coloration lysosome pour identifier les cellules de Paneth. Une fois maîtrisés, les organoïdes transducteurs peuvent être exécutés en environ trois heures, et l’intégration de crysection organoïdes peut être faite en environ 2 1/2 heures. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler de travailler sur la glace lors de la manipulation des reagents matricielles du sous-sol.

Après avoir terminé cette procédure, une analyse immunofluorescente et d’autres méthodes de détection des protéines ou des organites peuvent être effectuées pour évaluer la localisation ou l’abondance relative. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer la biologie normale et les états de la maladie in vitro et aussi pour les études in vivo si les organoïdes ou les cellules transduced peuvent être implantés dans des souris. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser des virus étiquetés magnétiquement aux organoïdes génétiquement modifiés pour la cryosection.

S’il vous plaît n’oubliez pas que le travail avec des virus peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port d’équipement de protection approprié doit toujours être entrepris lors de l’exécution de cette procédure.