Transformation efficace basée sur la régénération médiée par Agrobacterium d’une espèce amphibie asexuée de Brassicacées, Rorippa aquatica

Nous répondons au manque d’un pipeline simple et évolutif de transformation des agrobactéries pour les plantes asexuées, permettant des analyses moléculaires des fonctions génétiques. Récemment, des études sur le génome entier et l’expression génique physiologique ont introduit rorippa aquatica comme modèle pour l’hétérophilie. Il est utile pour étudier la base moléculaire de l’adaptation de la terre à l’eau.

Pour commencer, sélectionnez des plants de deux mois qui présentent des feuilles saines avec des marges entières. Préparez un plateau de propagation de plantes de 20 par 30 centimètres, avec deux couches d’essuie-tout autoclave. Pliez soigneusement les essuie-tout et imbibez-les d’eau stérile jusqu’à ce qu’une fine couche d’eau reste à la surface.

Assurez-vous que le banc de laboratoire est équipé de 100 à 500 millilitres d’eau double distillée, de contenants stériles adaptés au volume anticipé d’inoculum en suspension réintégré, d’une micropipette et de pointes de pipette appropriées. Maintenant, retirez rapidement 10 feuilles à la base des pétales des plantes de stock sélectionnées à l’aide de ciseaux, puis placez-les dans une boîte de Petri contenant de l’eau stérile. Après 2,5 heures, pipettez 50 microlitres de tensioactif par litre de solution de resuspension pour atteindre une concentration de surfactant de 0,005 %.

Faites doucement tourner la fiole pour mélanger la solution et assurez-vous qu’un plateau de propagation préparé soit accessible pour le placement de l’explant après l’inoculation. Placez maintenant une feuille avec le côté de l’abaxile vers le haut. À l’aide d’un scalpel, coupez perpendiculairement le long de la côte médiane de la feuille en morceaux d’un centimètre de long, puis placez-les dans un tube de 50 millilitres adapté à un mélangeur rotatif pour servir d’explants d’inoculation.

Verser l’inoculum agrobacterium dans le tube à un volume suffisant pour saturer complètement tout le matériau explanté. Placez le tube sur un mélangeur rotatif et agitez à température ambiante pendant 10 minutes pour effectuer l’inoculation. Ensuite, à l’aide de pinces, retirez tous les explants de feuilles inoculés de la solution et placez-les directement dans le plateau de propagation préparé.

Séparez et étalez les explants trempés uniformément afin qu’ils soient partiellement immergés mais pas complètement immergés dans la fine couche d’eau au-dessus des essuie-tout imbibés. Ensuite, scellez le plateau de propagation avec du film plastique. Placez les plateaux dans un environnement sombre et incubez à une température ambiante de 22 degrés Celsius pendant trois jours.

Après la fin de la période d’incubation sombre, vérifiez que les gouttières restent scellées avec du film plastique transparent. Ensuite, ajoutez de l’eau distillée double dans les plateaux selon les besoins pour maintenir le niveau d’humidité. Transférez les gouttières d’inoculation dans une chambre de croissance et maintenez-les en conditions de propagation végétative.

Inspectez visuellement les plants de rosettes régénérées pour vérifier leur adéquation à la transplantation. Identifiez l’idéal en confirmant la présence d’une goulotte intacte avec plusieurs feuilles et racines mesurant au moins deux à trois millimètres de long. Ensuite, exciser les plantes rosettes transgéniques intactes à l’aide de pinces.

Transplantez les plantes excisées dans les mêmes conditions que pour les régénérations clonales de type sauvage. Retirez une plante à rosette allumée en évitant soigneusement le contact avec toute feuille transgénique. Taillez l’excès de feuillage immédiatement autour de la feuille transgénique et transplantez une plante par pot.

Après avoir fertilisé chaque plante transplantée, arrosez-les soigneusement, vaporisez le feuillage et placez les plantes dans les conditions appropriées. Enfin, retournez l’explant contenant des transformants dépourvus de pousses et de racines ou qui semblent trop petits pour être transplantés sur le plateau de propagation. Continuez à cribler ces explantes et transplantez-les une fois qu’elles auront suffisamment grandi.

La majorité de nos jeunes jeunes d’un mois, un seul T, présentaient des motifs d’expression chimériques rubis, tandis qu’un petit nombre montraient des feuilles exprimant entièrement en rubis. Maintenue mature de six mois, nos semis de 1 Tone affichaient une expression rubis chimérique. Les secteurs foliaires pigmentés en rubis chimériques, retirés de nos semis de One Tone, étaient capables de se propager de façon asexuée.

Les fragments de feuilles chimériques excisées se sont régénérés en forme de rubis ou chimériques, nos plantules à une rosette en T et une dans les deux à quatre semaines suivant l’excision, avec une formation visible de racines lors de la régénération. Après un mois, la plupart de nos deux semis de T-one présentaient principalement des feuilles rubis. Notre protocole contourne les étapes de culture tissulaire stérile et fournit un pipeline de régénération de transformation pour les plantes asexuées propagées de façon végétative, dépourvues de graines ou de fleurs.

Nos études sur l’activation des voies de l’éthylène chez Rorippa aquatica en immersion fournissent des informations clés sur les réponses terrestres à la submersance. Notre méthode ouvre la porte à l’étude de la manière dont les voies lumineuses et hormonales permettent à cette plante amphibie de se métamorphoser sous l’eau.