Agrobacterium-Transformation d’embryon immature médié des lignées consanguines de maïs récalcitrants utilisant des gènes morphogènes

La plupart des lignées consanguis de maïs ne peuvent pas être génétiquement transformées à l’aide de protocoles de transformation conventionnels. Ici, nous décrivons une méthode de transformation QuickCorn qui est rapide et moins dépendante du génotype. La méthode QuickCorn utilise les facteurs de transcription du maïs BABY BOOM et WUSCHEL.

Lorsqu’ils sont incorporés dans le système vectoriel de transformation, ces gènes fonctionnent en synergie pour stimuler la croissance embryogénique. Contrairement aux protocoles conventionnels de transformation du maïs, la méthode QuickCorn n’implique pas d’étape d’induction du callus pendant la transformation. La région T-ADN du vecteur binaire utilisé dans nos travaux contient trois composants clés, les gènes morphogéniques, les gènes marqueurs et le système de recombinaison cre/loxP.

Le système de recombinaison cre/loxP induit par la chaleur a été inclus dans l’ADN T pour enlever les gènes morphogéniques du génome du maïs afin de permettre la régénération normale du callus dans le développement des plantes. Environ deux à trois jours après l’apparition des soies et si le pollen sera disponible le lendemain, coupez les soies et l’enveloppe avec des ciseaux stérilisés à 70 %, à environ 2 1/2 centimètres au-dessous de l’extrémité des feuilles d’enveloppe, où les soies émergent, et recouvrez la soie d’un sac à pousses. Une fois que les anthères sortent d’un gland, recouvrez le gland d’un sac à glands et placez un trombone non dérapage à la base du sac autour de la tige.

Le matin après avoir placé le sac de gland, pliez doucement la plante, et appuyez sur le sac pour encourager le pollen à être libéré. Retirez ensuite le sac à glands et pliez le dessus du sac pour empêcher le pollen de s’échapper. Polliniser une plante bénéficiaire, exposer les soies et verser rapidement le pollen du sac de gland sur les soies.

Couvrez immédiatement l’oreille pollinée avec le sac de gland, et fixez la base du sac autour de la tige avec des agrafes. Pour vérifier la taille immature de l’embryon, neuf à 12 jours après la pollinisation, tirez doucement vers le bas de l’enveloppe pour exposer les grains à environ 1/3 à 1/4 de la circonférence de l’oreille et environ 1/3 de la distance vers le bas de l’oreille. Utilisez un scalpel pour couper le capuchon d’un seul noyau qui semble similaire à la majorité des autres grains en taille et en couleur, et utilisez une spatule avec une règle pour extraire l’embryon.

Ensuite, utilisez la règle ou un étrier pour mesurer la longueur de l’embryon. Dans un délai d’un à quatre jours après la récolte, retirez les enveloppes et les soies des oreilles récoltées et insérez une poignée appropriée dans le haut ou la base de chaque oreille. Submergez les oreilles dans un grand récipient de solution d’eau de Javel de désinfection dans un capot stérile d’écoulement laminaire avec la poignée orientée vers le haut.

Après 20 minutes, rincer les oreilles trois fois avec un volume généreux d’eau distillée stérile fraîche pendant cinq minutes par lavage avant de laisser sécher les oreilles pendant plusieurs minutes. Ensuite, remplissez un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres par oreille avec un milieu liquide de 700A, et utilisez un scalpel stérile pour enlever le haut d’un à deux millimètres de chaque couronne de noyau pour exposer l’endosperme de l’oreille. Localiser l’embryon immature dans le noyau sur le côté faisant face à la pointe de l’oreille, près de l’attache à l’épi.

Pour le maître-chien supérieur et les opérateurs droitiers, reposez l’oreille sur une grande boîte stérile de Petri, et insérez une micro spatule dans l’endosperme dans le péricarpe le plus éloigné de l’embryon. Tordez doucement vers le haut pour déloger l’endosperme et exposer l’embryon, et utilisez la spatule pour placer soigneusement l’embryon dans un tube de 700A milieu liquide. Pour les opérateurs de manutention de base tenant l’oreille avec la main gauche, insérez une micro spatule dans l’endosperme dans le péricarpe le plus éloigné de l’embryon, et tordez doucement vers le haut pour déloger l’endosperme.

Pour la culture des embryons dans une culture de suspension Agrobacterium, recueillir les bactéries d’une plaque de travail fraîchement préparée en 10 millilitres de 700A milieu liquide, et vortex pour suspendre complètement la culture des bactéries. Mesurez la densité optique à une longueur d’onde de 550 nanomètres et lavez les embryons avec un millilitre de milieu frais de 700A. Plongez les embryons dans un millilitre de suspension Agrobacterium et vortex sur un réglage bas pendant 30 secondes.

Régler les embryons sur le banc avec les tubes dans une orientation horizontale pendant cinq minutes avant de transférer l’ensemble du contenu de chaque tube sur des plaques individuelles de 562V milieu de co-culture. Faites tourbillonner doucement les plaques pour répartir uniformément les embryons et aspirez l’excès de suspension Agrobacterium. Orientez soigneusement les embryons avec le côté en forme de dôme face vers le haut, en prenant soin d’éviter d’endommager les embryons.

Placez ensuite les plaques dans des boîtes en plastique pour une incubation nocturne à 21 degrés Celsius dans l’obscurité. Le lendemain matin, transférez soigneusement les embryons infectés sur le milieu de repos 605T, placez environ 30 embryons par plaque, côté scutellum vers le haut, pour une incubation de quatre à dix jours à 26 degrés Celsius dans l’obscurité. Vers sept jours, le développement de l’embryon somatique peut être observé à la surface du scutellum zygotique.

À la fin de la période de repos, placer la boîte d’embryons dans un incubateur de 45 degrés Celsius avec une humidité relative de 70 % pendant deux heures, suivie d’une incubation d’une à deux heures à 26 degrés Celsius dans l’obscurité. À la fin de l’incubation, placer 10 à 15 embryons immatures choqués par la chaleur sur des plaques individuelles de milieu de formation de pousses complétées par 05 milligrammes par litre de l’herbicide imazapyr comme agent sélectif. Retirez soigneusement les coleoptiles au besoin et retournez les embryons dans l’incubateur sombre de 26 degrés Celsius pendant deux semaines.

À la fin de l’incubation, transférer environ huit morceaux de tissu par plaque sur des plaques moyennes d’enracinement pour une incubation d’une à deux semaines avec 16 heures de lumière et huit heures d’obscurité à 27 degrés Celsius. Au fur et à mesure que les plantules se développent, placez une plante plus forte contenant à la fois des pousses et des racines vigoureuses sur des plaques individuelles de milieu d’enracinement sous lumière pendant encore sept à 14 jours. Permettre aux pousses qui ne sont pas complètement développées d’être incubées sur le même milieu pendant encore une à deux semaines jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être déplacées vers le sol.

À mesure que la plante devient plus vigoureuse, rincer les racines à l’eau du robinet pour enlever l’agar. Transplantez ensuite les plantes individuelles dans des pots de trois pouces contenant un substrat sans sol pré-mouillé dans un plateau avec des trous de vidange, et placez le plateau dans une chambre de croissance avec ou sans dôme d’humidité en plastique. Neuf à 14 jours après le transfert du pot, transplantez chaque plantlet avec du sol dans un pot de 1,5 gallon.

Ajouter un engrais à libération contrôlée dans la casserole et maintenir les plantes dans la serre. Lorsque les pousses d’oreille commencent à émerger de la plante, utilisez un sac de shoot semi-transparent pour couvrir les pousses afin que les soies émergentes puissent être observées sans enlever le sac. Polliniser ensuite les plantes au stade approprié du développement tel que démontré.

Les épis de maïs sont généralement récoltés neuf à 12 jours après la pollinisation. Les embryons immatures dont la longueur se situe entre 1,5 et 2 millimètres sont les meilleures explants pour la transformation de ce protocole. Huit jours après l’infection, les embryons somatiques exprimant ZsGreen peuvent être visualisés par microscopie par fluorescence.

Le traitement thermique huit jours après l’infection induit l’expression cre recombinase, ayant pour résultat l’excision du gène morphogenic, cre, et des cassettes d’expression de ZsGreen flanquées entre les deux emplacements de loxP. Après trois à quatre semaines de culture sur le milieu de formation des pousses contenant de l’herbicide, on peut observer des tissus proliférants avec des embryons mûrissants ou des bourgeons de pousse résistants à l’herbicide. Certains tissus résistants aux herbicides peuvent être négatifs pour ZsGreen, ce qui suggère que l’excision cré-médiée s’est probablement produite dans ces tissus.

Après avoir fait passer les tissus à l’incubation moyenne et légère de l’enracinement, on peut récolter des pousses saines, vigoureuses et en croissance aux racines bien développées. Notez que certains tissus peuvent sembler avoir plusieurs pousses peut-être en raison de plantes clonales ayant des modèles d’intégration transgénique identiques. La méthode QuickCorn peut grandement améliorer l’efficacité de la transformation du maïs et élargir la liste des génotypes transformables.

Le protocole peut être reproduit avec succès par des chercheurs ayant une formation minimale sur la transformation du maïs. En utilisant la méthode QuickCorn, les plantes enracinées devraient être prêtes à être transférées dans le sol en seulement cinq à sept semaines après le jour de l’infection. Faites attention à la composition moyenne, au moment des sous-cultures et aux conditions de température et d’éclairage.

La qualité des matériaux de départ est également essentielle à la réussite de la transformation. Les produits chimiques, la solution d’eau de Javel et l’herbicide utilisés dans ce protocole sont biodangereux. S’il vous plaît assurez-vous de porter l’équipement de protection personnelle approprié pendant leur utilisation.