Protocole chirurgical pour une grande fenêtre crânienne refermable permettant des enregistrements électrophysiologiques longitudinaux et multimodaux du réseau en mode par défaut de la souris

Le Réseau de Mode Par Défaut, ou DMN, est un réseau crucial et à grande échelle, impliqué dans un ensemble de fonctions cognitives et de troubles neuropsychiatriques tels que la dépression. L’étude des dynamiques complexes du DMN dans les modèles animaux offre des informations précieuses sur son fonctionnement dans des états sains et pathologiques. Cependant, un défi important a été de réaliser des enregistrements électrophysiologiques stables, à long terme et à grande échelle à partir des multiples nœuds profonds et distribués, le DMN, chez des souris éveillées et comportées.

Ici, nous présentons un protocole chirurgical novateur en deux phases développé dans le laboratoire d’Eero Castren. Cette technique crée une grande fenêtre crânienne durable, refermable permettant des enregistrements longitudinaux répétés à partir de plus de 1 000 canaux d’électrodes simultanément. Cela est réalisé en combinant la micro-électrocorticographie de surface, micro-ECoG, avec deux sondes Neuropixels, permettant un accès sans précédent au Réseau de Mode Par Défaut.

Cette vidéo fournira un guide étape par étape de cette procédure chirurgicale robuste, de la préparation animale et l’implantation de la plaque frontale à la création de la fenêtre crânienne chronique, garantissant une acquisition de données de haute qualité et à long terme pour la recherche en neurosciences en réseau. Toutes les procédures présentées ont été approuvées par le Conseil national des expériences en Finlande et sont conformes à la directive européenne de protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Phase 1, Préparation animale et implantation de plaque frontale.

Pour réaliser cette procédure, commencez par préparer tout le matériel et équipement chirurgical nécessaire. Anesthésiez la souris avec 4 % d’isoflurane et maintenez une anesthésie de 1,5 à 2,5 % avec un débit d’oxygène de 0,5 litre par minute. Rachez le poil du sommet de la tête et placez l’animal sur une bouillotte contrôlée équipée d’un capteur de température interne calibré pour maintenir la température corporelle à 37 degrés Celsius tout au long de la procédure.

Appliquez une pommade oculaire carbomère pour éviter le dessèchement cornéen. Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique afin que le crâne soit plat et administrez des analgésiques préopératoires et des agents anti-inflammatoires par injections sous-cutanées, Carprofène, Buprénorphine et Dexaméthasone. Désinfectez la zone rasée avec une solution de povidone-iode et injectez une solution de lidocaïne-épinéphrine comme anesthésique local sous la peau du cuir chevelu.

Réaliser une petite incision transversale à la ligne de l’oreille et agrandir progressivement l’incision pour exposer complètement le dessus du crâne. Nettoyez soigneusement le crâne exposé avec de l’acétone jusqu’à ce que tout périoste visible ait été retiré afin d’assurer une forte adhérence de l’implant. Utilisez une lame de scalpel émoussée et circulaire pour enlever les fragments résiduels de tissu périosté et conjonctif que le lavage à l’acétone n’a pas complètement dissipés.

Avec le dispositif stéréotaxique, on marque une zone rectangulaire de 4 millimètres sur 7,6 millimètres sur le crâne par rapport à la brèche. Le rectangle doit s’étendre de deux millimètres latéralement depuis le bregma de chaque côté, trois millimètres rostralement et 4,6 millimètres caudalement. Ensuite, marquez les deux sites d’insertion intracrâniennes de la sonde sur l’hémisphère droit.

Marquez le site de sonde rostral à 1,66 millimètre avant et 1,95 millimètre latéral du bregme, et le site de la sonde caudale à 2,2 millimètres postérieur et 1,9 millimètre latéral du bregme. Ensuite, gravez un motif en croisement sur toutes les surfaces osseuses exposées à l’extérieur de la zone fenêtre désignée à l’aide d’une lame chirurgicale numéro 11, et créez des rainures peu profondes mais définies d’environ 0,2 à 0,4 millimètre de profondeur pour former une grille uniforme d’environ un millimètre par un millimètre de carré. Créez un applicateur de colle fine en fixant une aiguille stérile de 30G sur la pointe d’un coton-tige-coton, puis pliez l’aiguille en forme de V.

Distribuez de la colle cyanoacrylate dans un bateau de pesée en plastique jetable et trempez l’applicateur dans le réservoir de colle. Déposez de la colle sur chaque surface osseuse exposée et gravée, en appliquant un seul dépôt par site afin que la couverture soit complète mais jamais excessive. Laissez sécher la colle pendant sept minutes avant de continuer.

Pour implanter la cavité de référence, sélectionnez le site de forage au-dessus de la position du cervelet gauche afin d’éviter les vaisseaux superficiels visibles. Forez le trou pilote en rafales de cinq à dix secondes à l’aide d’une meule en acier ronde à 20 000 à 25 000 coups par minute jusqu’à ce que le trou devienne plus translucide, révélant une teinte rose pâle. Insérez la douille de référence plaquée or dans le trou pilote, fixez-la avec de la colle au cyanoacrylate, et renforcez la jonction avec du ciment dentaire polyvalent aux UV.

Durcez le ciment dentaire avec une lampe LED de durcissement pendant une minute. Ensuite, placez une petite quantité de ciment dentaire polyvalent aux UV sur l’apex de l’os rostral exposé et placez la plaque de tête sous le crâne de sorte qu’un bord repose sur l’échafaudage en ciment dentaire, durci autour de la cavité de référence, et le bord opposé reposant sur le tambage frais de ciment rostral. Assurez-vous que la plaque de direction est centrée et nivelée.

Renforcez la structure en appliquant du ciment dentaire autour de la base de la plaque de tête et en faisant tourner autour de l’os gravé et de la cavité de référence jusqu’à ce qu’un enclos continu et scellé soit formé autour du périmètre de la future fenêtre crânienne. Enfin, j’ai durci le ciment dentaire avec la lumière LED du stylo durcisseur pendant une minute. Une fois le ciment complètement durci, laissez la souris se réveiller de l’anesthésie.

La première phase est désormais terminée. Laissez la souris récupérer pendant au moins 48 heures avant de passer à la phase suivante. Phase 2, Création chronique de fenêtres crâniennes.

La deuxième phase nécessite les mêmes outils et médicaments que la première, sauf l’anesthésie locale. De plus, cette phase nécessite une membrane PDMS fine et stérile, du liquide céphalorachidien froid et artificiel conservé sur la glace, un scellant en silicone en élastomère et un bouchon protecteur imprimé en 3D sur mesure. Au moins 48 heures après la première opération, réanesthésiez la souris avec de l’isoflurane, placez-la sur la bouillotte du cadre stéréotaxique, et administrez les médicaments préopératoires comme lors de la première phase, à l’exception de l’anesthésique local lidocaïne-épinéphrine.

Commencez à affiner l’os avec la perceuse dentaire le long du contour rectangulaire indiqué en Phase 1, en commençant à 25 000 coups par minute avec le forage placé à un angle de 90 degrés par rapport à la surface osseuse, puis effectuez un ou deux passages légèrement plus profonds le long des bords rectangulaires pour établir une rainure de coupe initiale. Forez des rainures peu profondes dans l’os et le ciment dentaire adjacents à la fenêtre crânienne aux deux coordonnées d’insertion de la sonde. Ces sillons servent de repères visuels persistants qui restent visibles après le retrait du lambeau osseux et servent à repositionner les sondes intracrâniennes de manière reproductible lors des séances électrophysiologiques ultérieures.

Appliquez régulièrement du liquide cérébrorachidien artificiel stérile et glacé tout au long du forage afin d’éviter les dommages thermiques au cortex sous-jacent et de minimiser les saignements. Réduisez progressivement la vitesse de la foreuse à 20 000 coups par minute à mesure que l’os s’amincit. Continuez à percer le long du périmètre rectangulaire jusqu’à ce que l’os à l’intérieur du contour soit aminci à environ 90 %.

Ne percez pas complètement le crâne. Passez au crochet duram fin et courbé. Insérez la pointe sous le bord de l’os fin avec une extrême prudence, puis faites glisser le crochet le long du périmètre de la fenêtre, en détachant soigneusement le lambeau osseux du crâne environnant et des tissus sous-jacents.

Soulevez délicatement le lambeau osseux détaché avec le dure-mère dans une direction postérieure à antérieure, à environ 35 degrés au-dessus de la surface du crâne. Saisis le bord soulevé avec la pince et balance-le doucement à gauche et à droite jusqu’à ce que la plaque se détache complètement. Nettoyez doucement la zone exposée du sang coagulé avec des lavages répétés d’ACSF glacé.

Placez une membrane préfabriquée stérile de PDMS directement sous la surface durale une fois le saignement diminué. Lorsqu’elle est correctement dimensionnée, elle couvre la fenêtre avec précision et adhère passivement à la dure-mère, la maintenant à plat contre le cerveau. Scellez la craniotomie en appliquant un scellant silicone.

Remplissez chaque crevasse entre l’enceinte en ciment dentaire et le bord intérieur de la plaque de tête, en entourant et en chevauchant complètement les bords de la membrane BDMS. Fixez un capuchon protecteur personnalisé imprimé en 3D sur la plaque de tête avec une petite quantité de colle au cyanoacrylate pour protéger la fenêtre entre les sessions d’enregistrement. La souris est désormais prête à être rétablie et doit être transférée dans sa cage d’origine pour un logement individuel afin d’éviter les dommages à l’implant.

Une chirurgie réussie se traduit par une fenêtre claire et transparente au-dessus du cortex, avec une vascularisation visible et des signes minimes d’inflammation ou d’infection. Cette clarté peut être maintenue pendant plus de 21 jours, permettant des études longitudinales à long terme. Les signaux électrophysiologiques bruts enregistrés à travers la fenêtre chronique conservaient une haute qualité sur la durée longitudinale.

Ici, des traces micro-ECoG à large bande représentatives échantillonnées d’une grille rétrospléniale postérieure et des traces de potentiel local de champ intracrânien simultanées échantillonnées à partir d’un canal cortical superficiel sont montrées côte à côte pour le premier jour d’enregistrement et 21 jours après. Les enregistrements du jour 21 présentent une amplitude du signal comparable, un contenu spectral, ainsi qu’une absence d’artefacts de mouvement et de bruit par rapport aux enregistrements du jour 0 du même animal, confirmant que ni la présence chronique de la membrane PDMS et du joint en silicone ni les perforations durales répétées n’introduisaient une dégradation détectable de la qualité du signal de surface ou de la sonde intracrânienne dans les couches corticales superficielles où la dégradation était attendue en premier. La validation principale de cette technique est l’acquisition de données électrophysiologiques multimodales stables et de haute qualité au fil du temps.

La fenêtre refermable permet l’insertion répétée de sondes pour enregistrer les mêmes populations neuronales sur plusieurs semaines. À travers la bande alpha, les matrices de valeurs de verrouillage de phase calculées à partir des canaux situés le long de la sonde d’électrode intracrânienne caudale à haute densité montrent une architecture fonctionnelle stable entre la base et la séance post-traitement du jour 21. Cela montre une réinsertion reproductible au même emplacement cortical, plutôt qu’une trace formelle des mêmes neurones individuels.

Bien qu’une translation d’intercession mineure de la tige exclue une revendication d’une même unité, la structure laminaire agrégée et régionale des interactions en bande alpha est préservée, ce qui soutient que la fenêtre chronique permet un échantillonnage longitudinal du même circuit fonctionnel. Pour vérifier directement que la fenêtre chronique supporte le ciblage laminaire reproductible des mêmes structures profondes à travers les sessions, des cartes de densité de source de courant ou CSD ont été calculées à partir des canaux LFP des sondes. Les profils CSD évoqués par stimulus montrent que les signatures attendues de la fonte de puits laminaire, y compris le cortex prélimbique et la zone cingulaire antérieure, sont préservées entre les séances.

Les superpositions de profil de puissance laminaire entre les deux sessions sont très similaires entre les sessions, la corrélation de Pearson étant de 0,81. Les différences observées dans le cortex moteur secondaire sont probablement dues à des différences de mouvement entre les enregistrements. Parce que le tracé CSD transporte des informations anatomiques, il peut fournir une lecture non terminale en cours de séance des régions cérébrales que chaque sonde est actuellement échantillonnée, indépendamment des colorations tissulaires post-mortem.

La reproductibilité de la position de micro-ECoG en surface entre les séances est quantifiée indépendamment de la lecture intracrânienne de la CSD. Des cartes spatiales de puissance limitées en bande calculées à partir de la grille micro-ECoG les jours 0 et 21 sont superposées, et la corrélation pixel par pixel des deux cartes est calculée séparément pour les sous-grilles rostrale et caudale. Les corrélations des profils de sous-grille restent élevées et les codes-barres spatiaux des deux sessions ont visiblement co-localisé les mêmes points chauds de puissance corticale sur les moitiés rostral et caudale du réseau.

Une file d’alignement sinusoïdale visible à travers la grille translucide, accompagnée des rainures osseuses gravées aux coordonnées d’insertion de la sonde, soutient donc la reproductibilité millimétrique du placement micro-ECoG sur l’intervalle longitudinal de 21 jours. Pour valider davantage la technique, des colorations immunohistochimiques ont été réalisées pour GFAP et IBA1 dans des tranches cérébrales post-mortem environ quatre semaines après la chirurgie de craniotomie. Les GFAP sont exprimés par des astrocytes, qui sont surrégulés dans la gliose réactive comme les lésions cérébrales ou l’inflammation.

L’IBA1, en revanche, est exprimée par des microglies, qui sont plus actives lors des processus neuroinflammatoires. La cohorte de validation comprenait des animaux pour lesquels la chirurgie complète en deux phases a été réalisée et la fenêtre crânienne a ensuite été rouverte trois fois lors des jours postopératoires 0, 21 et 22. Cependant, aucune pose de micro-ECoG ni insertion de sonde intracrânienne n’a été réalisée dans cette cohorte.

La fenêtre était refermée entre les séances, comme lors d’un enregistrement électrophysiologique. Cette cohorte isole donc la contribution inflammatoire de la fenêtre chronique et de l’exposition durale répétée à toute lésion tissulaire induite par la sonde. Aucune différence significative n’a été observée dans les deux marqueurs entre le groupe témoin sans chirurgie et le groupe véhicule ayant subi une opération.

Ces micrographies représentatives ne montrent aucune preuve qualitative de gliose réactive ou d’activation microgliale dans la région directement sous-jacente à la fenêtre. Cependant, une légère augmentation de l’activation des microglies et des astrocytes a été observée à proximité de la trajectoire de la sonde et dans l’hémisphère de l’insertion de la sonde respectivement, ce qui pourrait probablement résulter d’une vitesse d’insertion trop élevée de la sonde intracrânienne. Une chirurgie réussie permet une fenêtre claire et transparente au-dessus du cortex avec une inflammation minimale.

Après la période de traitement chronique, un certain gonflement cérébral peut survenir. Cela peut être géré par une surveillance attentive et, si nécessaire, par administration d’analgésiques supplémentaires. Pour les enregistrements, il suffit de retirer le bouchon et le scellant, de placer les grilles micro-ECoG et des sondes Neuropixels, puis de commencer l’acquisition de données de l’animal éveillé et en pleine forme.

En résumé, ce protocole chirurgical en deux phases offre une méthode fiable et très efficace pour créer une grande fenêtre crânienne chronique chez la souris. Les principaux avantages de la procédure sont ses dommages minimes à la dure-mère et la grande exposition qu’elle procure, ce qui est essentiel pour le placement simultané des micro-grilles de surface et de multiples sondes neuropixels cérébrales profondes. Cette méthode permet une investigation longitudinale sans précédent de la dynamique électrophysiologique à l’échelle du réseau dans le DMN et d’autres circuits à grande échelle.

Elle ouvre la porte à des recherches plus approfondies sur les fondements neuronaux des comportements complexes et la physiopathologie des troubles cérébraux, contribuant finalement au développement de nouveaux traitements.