גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo

DOI: 10.3791/1687

December 30, 2009

Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine,Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

טמוקסיפן הכנה נוהל Gavage שבעל פה (E8.5)

• הכן 20 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות של טמוקסיפן ידי המסת טמוקסיפן בשמן תירס מחומם מראש.
• דגירה הפתרון על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות nutator ו מערבולת לסירוגין.
• הגן המניות טמוקסיפן מהחנות אור, ב 4 ° C, ושימוש של עד חודש אחד.
• על הניסויים מיפוי גורל, להקים זוג לרבייה המורכב וובסטר שוויצרי הנשי (wildtype; שנרכשו Taconic) ואת זכר שניהם נושאת גן ספציפי קואל אלל ^T ו אלל הכתב. למטרות הדגמה, אנו משתמשים Wnt1 ^קואל-T; mGFP גברים (Ellisor 2009).
• בדוק שוויצרי נקבות וובסטר בכל בוקר להופעתו של תקע הנרתיק. ציין הבוקר (0900) של היום תוסף הנרתיק נתפסת 0.5 ימים שלאחר משגל ו לחשב את התאריך של הממשל טמוקסיפן מבוסס על נקודה זו ההתחלה. (לצורך ניסוי זה, יום עובריים 8.5 היה בשימוש).
• השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט חיה האכלה (20 גרם x 1-1/2) להכין 200 μl של הפתרון מניות טמוקסיפן (4 מ"ג טמוקסיפן).
• לרסן היטב את הנקבה בזמן בהריון שוויצרי וובסטר ידי אחיזה של העורף בצוואר ובגב כדי לשתק את הראש להתהפך כך את הצד הגחוני הוא פונה כלפי מעלה.
• החזק את הזנב בין האצבעות חופשי כדי לשמור על הגוף בקו ישר.
• מניחים את מחט האכלה לפינת הפה בעדינות מדריך את המחט לאורך הגג של הפה.
• סובב את המחט כך שהוא מקביל לגוף, תוך הטיית הראש לאחור בעת ובעונה אחת כדי לשמור על צוואר ישר.
• מדריך את המחט הוושט, אל הקיבה. היזהר שלא להזין את קנה הנשימה. אם יש התנגדות על המחט, רפלקס ההקאה של החיה עוסקת, או אם העכבר המאבקים, להסיר לאלתר את המחט ולנסות את gavage שוב.
• לאחר מחט האכלה הוא בבטן, לנהל את טמוקסיפן לתוך הקיבה להחזיר את הנקבה לכלוב בביתה עד למועד לנתיחה.

Craniotomy:

• Intracardially perfuse גורל מבוגר ממופה עכבר עם PFA 4% ולהסיר את הראש במספריים על ידי חיתוך דרך עמוד השדרה בדיוק מעל הכתפיים.
• הפעל אזמל לאורך קו האמצע הגבי של הראש (מקורי כדי הזנב) לחתוך דרך הקרקפת ולחשוף את לחתור.
• באמצעות אזמל, לגרד ממנו כל רקמת שריר עודפת או בצד ואת האחורי של הגולגולת.
• עם לנקב, מלקחיים את הגולגולת על קו האמצע מקורי רק הנורות חוש הריח וליצור חור קטן כדי להתאים את קצות מספריים בסדר.
• הכנס את המספריים מצוין לתוך החור הזה ולעשות חתך המדיאלי לאורך לרוחב של כ נורות חוש הריח. לחתוך זה ישבור את הגולגולת בצומת של עצם האף ועצמות חזיתית ולספק גישה טובה המספריים.
• גזור לאורך התפרים sagittal בגולגולת (קו האמצע הגבי) והקפד לשמור על טיפים מספריים בזווית אל המוח כדי למנוע פגיעה ברקמה הבסיסית.
• בעדינות לתפוס את הגולגולת עם מלקחיים לקלף העצם לאורך החתך המדיאלי לחשוף את המוח. הגולגולת עשויה שבב מעל לחתיכות קטנות או להתנתק בקטעים גדולים יותר. המשך באמצעות מלקחיים כדי להסיר את כל, עצמות חזיתית הקודקודית, interparietal, ואת העורף.
• לפצח את עצמות encasing paraflocculi (הממוקם בשולי לרוחב של המוח ברמה של המוח הקטן) על ידי צובט את העצמות כדורית בכל צד. משוך בעדינות את העצמות.
• סובבו את הראש הפוך (צד הגב למטה) ולהשתמש מלקחיים לנתק את עצבי הגולגולת ולשחרר את המוח מהגולגולת.

מיקרוסקופית שלמות הר: המוח למבוגרים

• העריכו את המוח הבוגר עבור GFP סימון באמצעות היקף הניתוחים ניאון.
• העברת המוח בצלחת פטרי המכילות PBS ולצלם באמצעות PictureFrame או תוכנה מתאימה אחרת.

מיקרוסקופית שלמות הר: E12.5 עוברים

• הערכת עוברים הר שלם GFP סימון באמצעות היקף הניתוחים ניאון.
• העברה אלה GFP חיובית על ידי הר שלם כדי בצלחת פטרי המכילות PBS ולצלם באמצעות PictureFrame או תוכנה מתאימה אחרת.
• שימוש במלקחיים לצבוט חתיכה קטנה של הזנב מעובר אחד, כל פיסת מקום בצינור PCR ו גנוטיפ רקמות באמצעות PCR (Ellisor 2009) עבור שני אללים לאשר לראות תוצאות באמצעות ניתוח הר שלם.

Micro-לנתיחה והכנת explant של mesencephalon הגחון מ E12.5 עוברים

• בעקבות לנתיחה משרשרת id הרחםentification הגורל ממופה עוברים על ידי כל הר פלואורסצנטי, עוברי העברה קר כקרח סטרילי PBS בצלחת תרבית תאים.
• בעזרת מספריים בסדר, להסיר את החלק הראש של העובר קיצוץ רוחבי, הזנב כדי rhombomere 1.
• בשלב הבא, להסיר את החלק מקורי של הראש עם חתך דרך העטרה diencephalon. זה יחשוף את מבנה דמוי צינור שבו החדר 4 באמצעות הטופס שלפוחית ​​mesencephalic צינור בין רקמות הגבי ו הגחון.
• בזהירות להוסיף את הטיפים מספריים לתוך החדר 4, ו - חיתוך לאורך קו האמצע הגב, הזנב אל מקורי, מלא פתיחת צינור, יצירת "ספר פתוח" הכנה. Mesencephalon הגחון עכשיו יהיה חשוף מדיאלית, בעוד שני חצאי הגבי של mesencephalon יהיה להתגורר רוחבית.
• הסר את כל רקמה הנותרת ללא עצביים מתחת mesencephalon הגחון על מנת הרקמה להניח יותר בפשטות. אם יהיה צורך, לעשות חריצים בהיבטים מקורי ואת הזנב כך הגבי "כנפיים" של explant יהיה שכב גם כן. Explant אמור כעת דומה "פרפר, בו mesencephalon הגב מייצג את הכנפיים, ואת rhombomere 1 הזנב.
• כדי להמשיך לבודד את mesencephalon הגחון לניתוח FACS או תרבות ניסויים התא, להסיר את לרוחב (היבטים הגבי) של הרקמה.

נציג תוצאות:

בניסוי זה GIFM, Wnt1-להביע את התאים לצמיתות ומסומן heritably ידי מתן טמוקסיפן ב-E8.5 עד Wnt1 CreERT במהלך embryogenesis; עוברים mGFP. כתוצאה מכך, התאים האלה מסומנים הם דמיינו באמצעות פלואורסצנציה הר שלם אימונוהיסטוכימיה סעיף כדי לקבוע כיצד Wnt1 הנגזרות תאים לתרום מבנים עצביים לאורך הפיתוח. שלמה הר הקרינה מסתמך על מרכיב מחויב GFP הממברנה של הכתב mGFP ולכן מספק מידע סלולריים וכן להציג העל של Wnt1 הנגזרות תחזיות עצביים. לדוגמה, עם הממשל טמוקסיפן ב E8.5, Wnt1-CreERTmGFP עוברים על הקרינה E12.5 התערוכה GFP בעיקר המוח התיכון, למוח האחורי האחורי ואת חוט השדרה (איור 1A). בהגדלה גבוהה, תחזיות עצבי עדין נראים innervating המוח התיכון, קיר הגוף, איבר, ובאזור craniofacial. בשלב זה התפתחותי, העובר הוא שקוף וסימון GFP הפנימי להבחין בקלות. עם זאת, כמו המוח מתפתח, את צפיפות רקמת בוגרת מטשטש GFP הקרינה הנובעת מבנים מוחיים פנימיים. לכן, עם הממשל טמוקסיפן ב E8.5, רק תיוג GFP קטין הוא ציין colliculi מעולה של המבוגר על ידי כל הר פלואורסצנטי (תרשים 1C, הבלעה). בנוסף, התחזיות כמה axonal נראים שזרמו על פני השטח של הגחון למוח האחורי (לא מוצג). לעומת זאת, כאשר טמוקסיפן ניתנת על E9.5, תיוג GFP משמעותית מתרחשת ברחבי colliculi הנחות כולה (איור 1B, הבלעה). עלייה זו הקרינה הר שלם עשוי להצביע על כך Wnt1-לבטא בתאי ב E9.5 לתרום באופן משמעותי יותר שטחיים באזורים של המוח התיכון הגבי או להאריך את התהליכים יותר בתוך האזור הזה מאשר Wnt1 תאים להביע מ E8.5. בכל מקרה, זה כל ההבדל הר הקרינה משקף את הדינאמיות של הביטוי Wnt1 במהלך הפיתוח GIFM מדגים כיצד ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר אוכלוסיות תאים נבדלים העובר לתוך המבוגר בוגרת.

עם, אימונוהיסטוכימיה גורל סעיפים רקמות ממופה מן Wnt1-CreERT; חיות mGFP מנותחים ברמה התאית. נוגדנים נגד ה-GFP ו - β-galactosidase (β-gal) משמשים בשילוב עם מגוון רחב של סמנים ביולוגיים רקמות ספציפיות כדי לקבוע את היקף התרומה בסדר הסלולר של שושלת Wnt1 כדי מבנים עצביים סוגי תאים. עם הממשל טמוקסיפן ב E8.5 וניתוח רקמות בבית E12.5, תאים חיובי כפול (GFP + ו β-gal +) הם נצפו ברחבי המוח התיכון, ואל למוח האחורי עם תחזיות שזורמים המוח התיכון הגחון (איור 1B). במוח הבוגר, Wnt1-השושלת המסומנים ב E8.5 מעורר המוח התיכון מבנים רבים כולל הקוליקולוס העליון ונחות כמו גם בסביבה של אוכלוסיות תאים דופאמינרגיים באזור tegmental הגחון substantia nigra ו (איור 1D) (ראה גם Zervas 2004). לעומת זאת, Wnt1 השושלת מסומן ב-E9.5 מעורר colliculi נחות כמו גם נוירונים באזור אוכלוסיות תאים דופאמינרגיים (איור 1F).

איור 1 תוצאות נציג למיפוי Wnt1-גורל.:

דוגמאות של כל הר ואת התוצאות immunocytochemistry Wnt1 ב-CreERT; עוברים mGFP וגורלו מוחות בוגרים ממופה (מסומן) בשעה E8.5 (AD)ו E9.5 (EF). א Wnt 1-קואל; עוברים mGFP על הקרינה E12.5 התערוכה GFP בעיקר במוח התיכון (MB), למוח האחורי האחורי (המוגלובין) ואת חוט השדרה (SP). התאים מסומנים ב דמיינו ונותחו ברמה התאית על ידי אימונוהיסטוכימיה כפי שמוצג על סעיף 1-מיקרומטר זה אופטי עבה (אובייקטיבי 40X, Z-סדרת הרכישה). תיוג נוגדן גרעיני β-galactosidase (nβ גל) (אדום) וסימון GFP נוגדן (ירוק) עולה בגורל ממופה תאים שמוצג המוח התיכון הגחון. הנה, תאים recombined הן חיוביות כפול (nβ גל + /-GFP +) בגלל האופי של הכתב mGFP מותנה. ג Whole-Mount מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתפרחת מגלה GFP קלוש הקוליקולוס העליון (SC) של המבוגר (הבלעה). הערכת השושלת Wnt1 המסומנים ב E8.5 על סעיפים מבוגר עם בהגדלה נמוכה (5X) מיקרוסקופית מגלה כי השושלת Wnt1 מעורר מבנים המוח התיכון כולל מעולה (SC) ונחותים (IC) colliculi (C). ד 40X, 1 מ"מ סעיף אופטי שנלקחו המוח התיכון הגחון בסביבה של נוירונים דופאמינרגיים עם nβ גל תאים + ו-GFP עשיר + מקלעת axonal. א 'סימון על התוצאות E9.5 ב תיוג GFP ניכר כי הוא ציין בקלות colliculus הנחות של המוח התיכון כולו על ידי הר פלואורסצנטי (הבלעה). השושלת Wnt1 המסומנים ב E9.5 על סעיפים מבוגר (β-gal +, אדום) הוא מרוכז colliculus נחות (הגבי-האחורי המוח התיכון) כפי שהוא נראה במיקרוסקופ בהגדלה נמוכה עם (5X) (E). פ 40X, 1 מ"מ סעיף אופטי שנלקחו המוח התיכון הגחון בסביבה של נוירונים דופאמינרגיים עם nβ גל תאים + ו-GFP עשיר + מקלעת axonal. נוירונים Wnt1 הנגזרות המסומנים ב E8.5 E9.5 לעומת מוגבלים בהדרגה מן התורמים המוח התיכון הגבי, בעוד שושלת Wnt1 ממשיכה לתרום המוח התיכון הגחון.