אנו מתארים שיטה לניתוח שינוי של N-linked glycans דרך חיים המוקדם של גליקופרוטאינים לאחר ביוסינתזה שלהם בתאי יונקים. זו מושגת על ידי ניתוח הדופק מרדף של glycans שכותרתו מטבולית, לשחרר האנזימטית של גליקופרוטאינים ובחינה על ידי HPLC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים
במאמר זה
סיכום
תקציר
קובץ מצורף של Glc
פרוטוקול
הפרוטוקול הבא מיועד לניתוח של שרשראות סוכר של גליקופרוטאינים או סך של גליקופרוטאין ספציפי של עניין. הליך זה בעצם אותו דבר עבור שניהם מקרים עם שינויים מעטים כאמור בכל פרוטוקול.
- עבור תיוג המטבולית של N-linked glycans אחד צריך להשתמש תרבות subconfluent של בתאי יונקים בוגרים לילה בצלחת 90 מ"מ עבור כל דגימה (דגימות עשוי לייצג נקודות זמן שונות או טיפולים). פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור תאים NIH 3T3.
- להרעיב את התאים גלוקוז על ידי הדגירה ב 5 מ"ל של מדיום מראש התחמם (37 ° C) גלוקוז ללא המוכן....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ניתוח הדופק מרדף של glycans בתאים חיים עם הפרדה HPLC מספק שיטה ללמוד את הדינמיקה של שינויים מבניים oligosaccharide לאורך החיים של גליקופרוטאין. יש ראיות הולכות ומצטברות כי שינויים כאלה הם מעורבים בייצור אותות לקיפול ER, בקרת איכות ומערכות 2-5 סחר. השיטה יכול להיות מיושם לא רק עבור גליקופרוטאין ספציפי של עניין, אלא גם לנתח את הדינמיקה של מבנה גליקופרוטאינים הכולל, כפי שנדגים במאמר זה, שבו השווינו את גורל מנוגדים של מצע ERAD ספציפיים כי הבריכה גליקופרוטאין הסלולר . טכניקת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מודים זהבית פרנקל סנדרה Tolchinsky לקבלת סיוע טכני. מחקר הקשורים לעבודה זו נתמכת על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (1229-1207) ואת גרמניה פרויקט שיתוף פעולה ישראלי (DIP-DFG).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בקר של מערכת אספקת ריבוי-ממסים 600E | Waters | WAT062710 | |
| אצטוניטריל LiChrosolv (בדרגת gradient לכרומטוגרפיה נוזלית) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K או Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 או 4208 | |
| מרכז ריכוז (Concentrator) 5301, כולל רוטור בזווית קבועה ל-48 מבחנות בנפח 1.5 / 2.0 מ"ל | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| F דיאלייזה–סרום עגל טאטלי (Fetal Calf Serum) | תעשיות ביולוגיות | 04-011-1A | |
| דאלבקו’mEagle המוסף (Modified Eagle)’מצע גידול | GIBCO, מבית Life Technologies | 41965039 | |
| דלבקו’Modified Eagle’מצע - ללא גלוקוז | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| דולבקו’מלח סריפוספט מקוצץ (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA disodium salt(Titriplex Iii) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| ערכה של Endo Hf (1,000,000 יחידות/מ"ל) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–סרום עגל עוברי (FCS) | תעשיות ביולוגיות | 04-001-1A | |
| סופר-שברים Frac-100 | Amersham | 18-1000-77 | |
| מערכות ספירה בצילום נצנוץ נוזלי LS 6500 | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| מנוז, D-[2-3H(N)]- (פעילות סגולית: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glycosidase F (1000 יחידות/מ"ל) | קבוצת Roche | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| תאי NIH 3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| תמיסת חומצה זרחית (49-51%, עבור HPLC) | Fluka | 79607 | |
| תערובת מעכבי פרוטאז (Protease Inhibitor Cocktail) | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| חרוזי Protein A-Sepharose | Repligen | IPA300 | |
| נוגדן פוליקלונלי לארנב נגד הקצה הקרבוקסילי של H2 6 | |||
| סודיום דאוסיכולאט | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| סודיום דודציל סולפט | Bio-Rad | 161-0301 | |
| נתרן פוספט | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| תמיסת נתרים פירובט (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| עמודת Spherisorb NH2, 5 μמ', 4.6 x 250 מ"מ | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| מעבדי אולטרה-סאונד Vibra-Cell VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| <חזק>בופר A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v סודיום דאוקסיכולאט (sodium deoxycholate), תערובת מעכבי פרוטאז (Protease inhibitor cocktail) בריכוז 2% v/v ב-PBS | |||
| <חזק>בופר B: 0.5% w/v SDS, תערובת מעכבי פרוטאז 2% v/v ב-PBS | |||
| <חזק>בופר C: בופר תגובה ל-N-glycosidase F: Na 200mM3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | |||
| תאי NIH 3T3 המבטאים באופן יציב H2a 6 | |||
| <חזק>בופר D: 0.5% Triton X-100, 0.25% משקל/נפח נתרק דאוסיכולאט, 0.5% משקל/נפח SDS, תערובת מעכבי פרוטאז 2% נפח/נפח ב-PBS | |||
| <חזק>בופר E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol–אתנול, תערובת מעכבי פרוטאז 2% נפח/נפח ב-PBS | |||
| 2-מרקפטו–אתנול | Sigma-Aldrich | M3148 |
מקורות
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
