Quantitation של גדיל הדנ"א הכפול נשבר על בסיס γH2AX מוקדים הפך כלי רב ערך, במיוחד בביולוגיה קרינה, להערכת radiosensitivity רקמות ההשפעות של תרכובות קרינה שינוי. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
גדיל הדנ"א הכפול הפסקות (DSBs) הם נגעים קטלני במיוחד genotoxic, כי יכול להיווצר גם על ידי תהליכים פנימיים (פיזיולוגי או פתולוגי) או על ידי גורמים חיצוניים, קרינה מייננת במיוחד ותרכובות radiomimetic. זירחון של הגרסה H2A היסטון, H2AX, על שאריות סרין-139, את מוטיב שמור ביותר SQEY בטרמינל C-, להרכיב γH2AX, היא תגובה מוקדמת הדנ"א הכפול גדיל הפסקות
פרוטוקול
רקמות
- רקמת הריאה, מוטבע בטמפרטורה תבניות חיתוך אופטימלי (אוקטובר) במתחם 4583, נותח (5 מיקרומטר) באמצעות CM לייקה 1950 cryostat ועלה על פולי-L-ליזין שקופיות.
דגימות קפואות התקבלו ד"ר סיימון רויס במכון המחקר ילדים מרדוק. רקמת הריאה התקבל Balb מטופל / עכברים c ומ במודל של עכברים של מחלה כרונית בדרכי הנשימה אלרגית אשר מציגה תכונות רבות פתולוגית של אסטמה אדם 6. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים מכון המחקר לילדים מרדוק הדוגלת קוד האוסטרלי עיסוק לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה למטרות מדעיות.
- מדורים הורשו אוויר יבש בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
Immunofluorescence מכתים
- מדורים תוקנו עם 2% (w / v) paraformaldehyde ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) במשך 20 דקות.
- מדורים היו equilibrated עם שתי שוטף ב PBS במשך 15 דקות כל אחד.
- מדורים טופלו אתנול 70% (מקוררת -20 ° C) למשך 20 דקות ואחריו שלושה שוטף ב PBS למשך 10 דקות כל אחד.
בנקודה זו שקופיות עשוי להיות מאוחסן במיכלים אטומים על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות.
- מדורים נשטפו שלוש פעמים עם PBS למשך 10 דקות כל אחד חסום אז עם 100μL מוכן טרי PBS המכיל BSA 8% PBS המכיל 0.5% Tween-20 ו - 0.1% Triton X-100 (PBS-TT) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר .
Incubations כל בוצעו שוקת מכתים humidified. - מדורים נשטפו עם PBS-TT במשך 5 דקות ו המערכת הידרופובי היה מסומן סביב הרקמה עם עט פאפ.
- חיץ עודף היה מוטה לסירוגין 100μl העיקרי של נוגדן ארנבת polyclonal אנטי γH2AX (מדולל 1:500, ב BSA 1% PBS; Millipore), נוספה עבור כל מקטע הדגירה 2 שעות בטמפרטורת החדר.
דגירה עם נוגדן ראשוני ניתן לבצע בן לילה ב -4 ° C.
לקבלת ראיות נוספות, כי מוקדי γH2AX מייצגים DSBs, נוגדן ראשוני לזהות חלבון תיקון DSB עשוי לשמש גם. לדוגמה, שיתוף לוקליזציה של γH2AX phospho ו-ATM הוא שילוב נפוץ. - מדורים נשטפו פעמיים ב PBS-TT במשך 5 דקות כל מודגרות עם 100μl של נוגדנים משני (אלקסה פלואוריד 488 עיזים נגד ארנב IgG מדולל 1:500, ב BSA 1%; Invitrogen) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר בחושך . (נוגדן מדולל הוחזק בחושך לאורך ההליך).
- מדורים נשטפו שלוש פעמים עם PBS-TT במשך 5 דקות כל מודגרות עם 0.5mg/mL RNAse במשך 30 דקות על 37 ° C.
- גרעיני counterstaining ואת הרכבה בוצע בינוני Vectashield המכילות יודיד propidium.
- מגלשות נחתמו עם לק ומאוחסנים בין לילה ° C בחושך לפני ניתוח בבית 4.
מיקרוסקופית / ניתוח
- מיקרוסקופ LSM510 Zeiss Meta Confocal שימש לרכוש תמונות באמצעות תקן ה-GFP (עבור γH2AX - Alexa פלואוריד 488 נגד ארנב עז IgG) ו PI (543 ננומטר) לייזרים.
תמונות שנרכשו דפוס Z-סדרה עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטר. במהלך הניתוח, מטוסים בודדים היו deconvoluted וערמה לייצר תמונה מוקרנת מרבי כדי לצמצם את החפיפה של מוקדים.
השיטה של יצירת הדימוי המוקרן המקסימלי לפני ספירת החלקיקים יש להשתמש רק בנסיבות בהן חלק דק (למשל 5μm) משמש והיכן מכתים הרקע הוא חסר משמעות. איפה הסעיפים עבה עם רקע משמעותי יש לנתח, ניתוח מורכב יותר כגון מונה אובייקט 3D כפי שתואר על ידי Bolte ו Cordelieres (2006) אמור לשמש 7.
- Metamorph (התקנים מולקולריים, ארה"ב) שימש ליצור הממוזגת (אדום וירוק) תמונות לכמת במספרים של מוקדים.
למרות Metamorph ניתן לכמת במספרים מוקדים, בדרך כלל בעת שימוש בסעיפים רקמות מוקדים נספרות באופן ידני (על ידי העין) לדיוק רב יותר.
סוגי תאים מסוימים של עניין ניתן לבחור עבור quantitation, עבור ריאות תאים למשל אפיתל. ניתן לעשות זאת על בסיס היסטולוגיה עם התייחסות בסעיפים haematoxylin ו eosin סדרתי מוכתם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לצורך הפגנה זו השתמשנו רקמת הריאה עכבר Balb מטופל / עכברים c ומ במודל של עכברים של מחלה כרונית בדרכי הנשימה אלרגית. אנו ונרשמת הבדלים במספר מוקדים לכל תא עם ממוצע גבוה מעט יותר נצפתה בריאה פגום לעומת חלקים לא מטופלים. באופן ספציפי, quantitation הצביעו 6.5 מוקדים לכל תא / ו -9.4 לכל מוקדי / תא (ספירה ידנית של 20 תאים לכל קטע), ברקמות מטופל ורקמות אלרגית כרונית בדרכי הנשימה המחלה, בהתאמה. עם זאת, השימוש של סוכן DSB וישכנע, כי הנפטלין לדוגמא, אשר ידועה לגרום DSBs במודל עכבר ריאות, תנ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). LM נתמך על ידי מלבורן מחקר (אוניברסיטת מלבורן) ו ביו הדמיה מלגות CRC משלים. התמיכה של מונש Micro Imaging (ד"ר סטיבן קודי ואת היתר קרמייקל) היה שלא יסולא בפז עבור עבודה זו. MMT הוא אסיר תודה על הסיוע מומחה ועצות ד"ר אולגה Sedelnikova מן המכונים הלאומיים לבריאות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| אלבומין מסרום בקר (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) משמש לחסימת קישור לא ספציפי של נוגדנים. נוגדנים ראשוניים ומשניים מדוללים ב-BSA. | |
| PBS (ללא Ca)2+ ו-Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| תרכובת Optimal Cutting Temperature (OCT) 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | שקופיות פולי-ליזין | מנזל-גלזר | SF41296SP | מושך באופן אלקטרוסטטי חתכים של רקמה קפואה ומפחית את הצורך בציפויים ובדבקים נוספים. |
| Tween 20 | ריאגנטים | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%) הוא דטרגנט המשמש להחדרת חומרים לתאים (permeabilisation). |
| Triton X-100 | ריאגנטים | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) שימש להחדרת חומרים לתאים (permeabilisation). |
| פרהפורמאלדהיד | ריאגנטים | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| אנטי-פוספו-γH2AX (נוגדן פוליקלונלי משפן) | נוגדן ראשוני | Upstate, Millipore | 07-164 | דילול של נוגדן ראשוני (1:500), ב-1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | נוגדן משני | Invitrogen | A-11008 | דילול של נוגדן משני (1:500), ב-1% BSA. |
| אתנול (70%) | .Thermo Fisher Scientific, Inc | BSPEL316 | ||
| RNAse A | ריאגנטים | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | ריאגנטים | Vector Laboratories | H-1300 | תווך הרכבה מבוסס גליצרין המכיל פרופידיום יודיד (צבע גרעיני אדום). יש להשתמש בתווך זה עם עדשה מבוססת שמן התואמת את מקדם השבירה שלו. הערה: צבע DNA הנפוץ בשימוש: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). ניתן להשתיו אך ורק עם מיקרוסקופים בעלי לייזר עירור מתאים. |
| עט Pap מיני | Invitrogen | 008877 | ||
| זכוכיות כיסוי (22x50 מ"מ) | מנזל-גלזר | CS2250100 | ||
| צנצנת קופלין, זכוכית | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| אמבטית צביעה | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 510 Meta | מיקרוסקופ קונפוקאלי | |||
| קריוסטט CM Leica 1950 | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | תוכנה לניתוח דימות | Molecular Devices |
מקורות
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
