בסרטון הזה אנחנו מדגימים את הטכניקה של ליתוגרפיה רך עם polydimethyl siloxane (PDMS) שבו אנו משתמשים כדי farbricate מכשיר microfluidic עבור נוירונים culturing.
מאמר שיטה
המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים
במאמר זה
סיכום
תקציר
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקה של ליתוגרפיה רך עם polydimethyl siloxane (PDMS) שבו אנו משתמשים כדי להמציא מכשיר microfluidic עבור נוירונים culturing. בעבר, היה פרוסות סיליקון בדוגמת עם העיצוב של המכשיר נוירון microfluidic באמצעות SU-8 ו photolithography ליצור עובש מאסטר, או מה שאנו מכנים בפשטות "אמן". בשלב הבא, אנחנו יוצקים פולימר סיליקון PDMS על גבי האדון אשר הוא נרפא לאחר מכן על ידי חימום PDMS עד 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. PDMS יוצר תבנית שלילית של המכשיר. PDMS הוא אז לחתוך בזהירות והרים מן האדון. חורים הם אגרוף שבו מאגרי יהיה ואת PDMS עודף גזוז מן המכשיר. חנקן משמש לסלק כל פסולת עודף מהמכשיר. בשלב זה שני המכשירים נמצאים כעת מוכן לשימוש וניתן ערובה או זכוכית קורנינג לכסות מס '1 עם מעקר פלזמה / מנקה או יכול להיות מחויב הפיך לזכוכית לכסות פשוט על ידי הנחת המכשיר על גבי זכוכית המכסה. מליטה הפיך של המכשיר כדי זכוכית מכוסה וידאו נפרד דורש הראשונה את המכשיר לעקר או אתנול עם 70% או מעוקר. פלזמה בטיפול sterilizes המכשירים כך שאין טיפול נוסף הוא הכרחי. היא, לעומת זאת, חשוב, כאשר פלזמה בטיפול התקנים, כדי להוסיף נוזל המכשירים בתוך 10 דקות של טיפול פלזמה בעוד משטחים עדיין הידרופילי. מחכים יותר מ 10 דקות להוסיף נוזל למכשיר מקשה על הנוזל להזין את המכשיר. המכשירים נוירון הם בדרך כלל פלזמה חייב לכסות זכוכית 0.5 מ"ג / מ"ל poly-L-ליזין (PLL) במאגר borate 8.5 pH הוא הוסיף מיד למכשיר. לאחר מינימום של 3 שעות דוגרים עם PLL, המכשירים נשטפים במים dH2O מינימום של 3 פעמים עם 15 דקות לפחות בין כל לשטוף. לאחר מכן, המים יוסר התקשורת טריים הוא הוסיף למכשיר. בשלב זה המכשיר מוכן לשימוש. חשוב לזכור בשלב זה לא להוציא את כל המדיה מהמכשיר. תמיד להשאיר את התקשורת בערוץ הראשי.
פרוטוקול
חלק 1: הכנת התקן נוירון microfluidic
- 3 "פרוסות סיליקון עם דפוס עשוי SU-8 על ידי photolithography משמש להטיל את התבנית (PDMS) polydimethylsiloxane microfluidic. אנו מתייחסים רקיק SU-8 תבניות סיליקון בדוגמת כמו הורים, או" מאסטרים ".
- PDMS מעורבב עם סוכן ריפוי ביחס aw / w של 10:01, כלומר, עבור 10 גרם של PDMS, 1 גרם של סוכן ריפוי מתווסף אליו.
- PDMS הוא מעורב אז גם ושפך על גבי פרוסות סיליקון. פרוסות סיליקון הכלול בתוך צלחת פטרי 10 ס"מ קלקר. זה לוקח בערך 12 גרם עד 15 גרם של PDMS לכיסוי הורים עם עובי של כ 4 מ"מ.
- האדון עם PDMS ממוקם אז dessicator ואקום עם מכסה את צלחת פטרי, ואקום מוחל. זה נעשה כדי לסייע להסיר בועות אוויר מן PDMS שהוצגו במהלך תזוזה של הסוכן ריפוי. זה לוקח בערך 15 דקות את בועות האוויר כדי להסירו.
- האדון עם PDMS יוסר dessicator. אקדח אוויר עם מסנן 0.45 אממ משמש כדי להסיר בועות הנותרים.
- אמן ממוקם אז על צלחת 80 מעלות צלזיוס חם במשך שעה 1 כדי לרפא.
הערה: אם dessicator ואקום אינו זמין, האב ניתן להשאיר בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. בועות אוויר בסופו של דבר להפיג בכוחות עצמם. אם צלחת חמה אינו זמין, PDMS ירפא בטמפרטורת החדר לאחר 24 שעות.
הערה: חשוב גם לוודא כי האדון הוא ברמה במהלך תהליך ריפוי.
חלק 2: לחתוך את המכשיר microfluidic נוירון
- ברגע PDMS נרפא הבסיס, הוא נלקח אל מכסה המנוע נקי.
- שימוש בלהב כירורגי, עיגול הוא חתך מסביב המכשירים. כשאדם מכניס את הלהב לתוך PDMS, חשוב ליצור קשר עם פרוסות סיליקון, אבל לא לשים יותר מדי לחץ על פרוסות סיליקון, אחר המאסטר ייסדק.
- עם עיגול לחתוך את כל הדרך סביב המכשירים (יש 4 מכשירים לכל אחד מאסטר 3 הסיליקון "), PDMS הוא הרים בזהירות את המאסטר. זה יכול להיות נכתבו על ידי מסובב בעדינות את להב כירורגי כפי שהוא מוכנס לתוך לחתוך לפני .
- בשלב הבא, הם מאגרים אגרוף לתוך המכשיר באמצעות רקמות 8 מ"מ ביופסיה.
- התקנים הם לרבעים ואז PDMS עודף גזוז משם כך שהמכשיר יתאים בצורה מסודרת על כיסוי הזכוכית קורנינג (מס '1) 24 מ"מ x 40 מ"מ. חנקן באוויר משמש לסלק כל פסולת עודף. פסולת עיקש ניתן גם להסיר באמצעות 3M סקוטש 471 ברנד סרט ויניל.
חלק 3: פלזמה מליטה התקנים תלושי כיסוי זכוכית.
- מנקה פלזמה משמש האג"ח Harrick המכשירים נוירון את תלושי לכסות. בקצרה, המכשירים מוצבים שואב פלזמה משאבת ואקום משמש לפנות אוויר החדר.
- אחרי הלחץ ואקום הגיע 300 milliTorr, כוח מופעל על סליל חשמלי מוגדר גבוה.
- סליל חשמלי יוצר פלזמה "גז מיונן חלקית בהיקף של אלקטרונים, יונים או מולקולות אטומים נייטרלים" - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , מתוך מולקולות האוויר הנותר נשאר בחדר. פלזמה יוצר מינים תגובתי על פני השטח של הזכוכית את המכשיר, אשר כאשר מציבים יחד יהוו קשר קבוע. פלזמה גם הופך את משטחי הידרופילי, אשר מסייע להקל על תוספת של נוזלים. בנוסף, מנקה פלזמה sterilizes המכשירים.
פני השטח של המכשיר PDMS המכיל את המכשיר microfluidic ממוקם עם הפנים כלפי מעלה לתוך שואב פלזמה יחד עם שקופיות הזכוכית.
משטחים פלזמה טיפול של הזכוכית המכשיר microfluidic הם התאספו על קשר אחד עם השני על ספסל נקי, הניח אז 60 מנות סטרילי מ"מ. משטחים מטופלים ליצור קשר הדוק בלתי הפיך. - בתוך 10 דקות של פלזמה מליטה התקנים זכוכית, פולי-L-ליזין (PLL) מתווסף אל המכשיר. לאחר 10 דקות, hydrophilicity של המכשיר יקטין שהקשה על PLL כדי להזין את המכשיר.
הערה: חשוב לבדוק את בועות האוויר במכשיר לאחר תוספת של PLL. בועות האוויר בערוץ העיקריים הם רצויים, כפי שהם היו התאים לחמצן. שיטה קלה להסיר כל בועות האוויר הקיימות היא להשתמש pipet P200 מלא ul 150 של הנוזל (במקרה זה PLL), הצב את קצה ישירות בפתיחת הערוץ הראשי, לדכא בכוח P200. זה עלול צורך לחזור כמה פעמים אבל בסופו של דבר את הכוח מן pipet יניעו את הבועות החוצה. - המכשירים המכיל PLL מותר דגירה לילה בתרבות תקן רקמות החממה ב 37 ° C עם 5% CO 2.
- למחרת, דההחטאים הם שטפה פעמיים במהירות עם dH2O autoclaved. במהלך תהליך זה, נוזל לא יוסר לחלוטין מן הערוצים העיקריים, רק מתוך המאגרים. הסרת נוזל מן הערוצים העיקריים יציג בועות. אחרי 2 שטיפות מהיר, התקנים הם מלאים dH2O autoclaved והניח בחזרה מינימום של 3 שעות לתוך האינקובטור, או לילה.
- למחרת, התקנים הם שטפה שוב 2 פעמים מהר עם dH2O autoclaved. ואז, מדיה הבסיס העצבי, המכיל את התוספים הדרושים B27 ו glutamax עבור נוירונים culturing העיקרי עכברוש, הוא הוסיף את המכשירים. המכשירים מוצבים בחזרה לשימוש עתידי בחממה. המכשירים נמצאים כעת לקראת זריעה של נוירונים.
דיון
בסרטון זה אנו הדגימו כיצד לבצע ולהכין את מכשיר microfluidic PDMS שבו אנו משתמשים כדי נוירונים תרבות פנימה המכשיר מאפשר לנו להשיג שבריר axonal טהור מופרדות microgrooves מן התא המכיל תערובת של גופי התא, דנדריטים, ואת האקסונים . מכשירים אלה מאפשרים לחוקר לחקור את ההשפעות של טיפולים שונים, כמו גם לספק פלטפורמה לבצע פגיעה פיזית על האקסונים ולבחון מה ההשפעות טיפולים אלה על הנוירונים. המכשיר מספק גם רמת כדי נוירונים culturing המסייעת להקל על מחקרים התחבורה. בנוסף, microgrooves, אשר מפרידים בין תא תרבית תאים מתא האקסון, מאפשר בידוד fluidic בין שני תאים כך שניתן לטפל צד אחד של המכשיר ללא ולחולל את הצד השני של המכשיר ישירות עם הטיפול. תכונה זו מאפשרת לחוקר לבחון תופעות כגון התמרה האות התחבורה הנגרמות כתוצאה מהטיפול.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| PDMS | ריאגנט | Dow Corning | Sylgard 184 עם חומר מקשה. אנא פנו ל-Dow Corning כדי למצוא ספק בקרבתכם | |
| מנקה פלזמה | כלי | Harrick Scientific Products, Inc. | http://www.harrickplasma.com/ | |
| Neural Basal Media | ריאגנט | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media נרכש מ-Invitrogen תחת קו ריאגנטים לתרביות תאים של Gibco. |
| B27 | ריאגנט | Invitrogen | 17504-044 | B27 הוא תוסף קנייני הזמין דרך Invitrogen תחת קו ריאגנטים לתרביות תאים של Gibco. |
| Glutamax | ריאגנט | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax זמין דרך Invitrogen תחת קו ריאגנטים לתרביות תאים של Gibco. |
| זכוכית כיסוי Cornig No. 1 | זכוכית כיסוי | Corning | Corning No. X2935 244 | זמין דרך Fisher Scientific, מספר קטלוג Fisher 12-531D |
| צלחת פטרי 60 mm | כלי | Fisher Scientific | 08-757-13A | צלחות פטרי סטריליות מפוליסטירן בנפח 60 mm משמשות להצבת ההתקן המחובר לזכוכית. |
| מבחנת BD Falcon 50 ml | כלי | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | זמין דרך Fisher Scientific מספר קטלוג 14-959-49A |
| מבחנת BD Falcon 15 ml | כלי | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | זמין דרך Fisher Scientific מספר קטלוג 14-959-70C |
| Poly-L-Lysine | ריאגנט | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| פריט חדש |
מקורות
- Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
