מאמר שיטה

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

DOI:

10.3791/4378

⸱

19 באוקטובר 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Louisville School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתחנו assay איחוי תאים שמכמת אירועי איחוי המלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האינטראקציות של מלכודת (גורם oluble N-ethylmaleimide רגיש ceptor מחדש חלבון ttachment ים) חלבונים על שלפוחית ​​(V-מלכודות) ועל קרומי היעד (t-מלכודות) לזרז איחוי שלפוחית ​​תאית 1-4. מבחנים הם חיוניים לכינון מחדש לנתח את מנגנון הוויסות של איחוי המלכודת בתיווך 5. בבדיקת איחוי תאי 6,7, חלבוני מלכודת מתבטאים ectopically בתא השטח. אלה "התהפכו" איחוי כונן מלכודת חלבוני תאי תאים, הוכחה כי מלכודות מספיקות לאיחוי קרום תא. בגלל assay איחוי התאים מתבסס על ניתוח מיקרוסקופי, הוא פחות יעיל כאשר משתמשים בו כדי לנתח מרובה v-ואינטראקציות t-Snare כמותית.

כאן אנו מתארים בדיקה חדשה 8 שמכמתת אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז. שניםמרכיבים של מערכת ביטוי גני ט הכבויה 9 משמשים כמערכת readout: טטרציקלין המבוקר transactivator (tta) וכתב פלסמיד שמקודד גן LacZ תחת שליטה של אלמנט טטרציקלין-התגובה (TRE-LacZ). אנו transfect tta לCOS-7 תאים שהתהפכו מפורשים חלבוני v-Snare בתא השטח (V-תאים) וtransfect TRE-LacZ לCOS-7 תאים שהתהפכו מפורשים חלבוני t-Snare בתא השטח (T-תאים) . היתוך מלכודת תלויה של V-והתוצאות מתאי T בכריכה של tta לTRE, הפעלת התעתיק של LacZ והביטוי של β-גלקטוזידאז. הפעילות של β-גלקטוזידאז היא לכמת בשיטת colorimetric על ידי ספיגה ב420 ננומטר.

חלבוני קרום שלפוחית ​​הקשורים (VAMPs) הם V-מלכודות שנמצאות בתאים שונים לאחר Golgi שלפוחי 10-15. על ידי בעת 1 VAMPs, 3, 4, 5, 7 ו 8 באותה הרמה, אנו משווים איחויםפעילות באמצעות assay איחוי התאים האנזימטית. מבוסס על מדידת spectrometric, assay זה מציע גישה כמותית לניתוח איחוי מלכודת בתיווך ועל מחקרי תפוקה גבוהה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תא תרבות וTransfection

  1. COS-7 תאים בתרבית הבינונית של Dulbecco שינוי הנשר (DMEM) בתוספת 4.5 גר '/ הליטר וגלוקוז בסרום שור עוברי (10% FBS).
  2. transfection פלסמיד נעשה עם Lipofectamine על פי הוראות היצרן (Invitrogen).

2. ניתוח מיקרוסקופי קרינה של ביטוי מלכודת תא שטח

  1. היום לפני transfection, 3 × 10 4 COS-7 תאי הזרע בcoverslips סטריליים 12-מ"מ הזכוכית (הפישר סיינטיפיק) הכלול בצלחות 24 כן.
  2. לV-תאים בכל אחד, 0.25 מיקרוגרם היטב של פלסמיד המקודד tta (pTet-Off, CLONTECH) הוא cotransfected עם 0.25 מיקרוגרם של פלסמיד שהתהפך VAMPs מפורש.
  3. לתאי ה-T בכל באר, 0.25 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) הוא cotransfected עם 0.25 מיקרוגרם כל אחד מפלסמידים שהתהפכו מפורשים SNAP-25 וsyntaxins 1 או 4.
  4. 24 שעות לאחר transfection, תאים קבועים עם paraformaldehyde 4% ב PBS + + (PBS בתוספת 0.1 גר '/ ליטר CaCl 2 ו -0.1 ג'/ ליטר MgCl 2) למשך 10 דקות, ולאחר מכן חסם ב10% FBS ב PBS + + למשך 30 דקות.
  5. התאים מודגרת עבור 1.5 שעות עם 9E10 נוגדנים אנטי-myc (supernatant תרבות היברידומה המסודר).
  6. אחרי ארבע כביסות עם PBS + +, התאים מודגרת לשעה 1 עם נוגדני FITC-מצומדות משניים (מעבדות ג'קסון Immunoresearch) בדילול של 1:500.
  7. אחרי ארבע כביסות עם PBS + +, תאי שהכותרת הם רכובים בהארכה מגיבה antifade זהב (Invitrogen).
  8. תמונות confocal נאספות על מיקרוסקופ confocal סריקת ליזר אולימפוס. הדימויים מעובדים בתוכנת Photoshop Adobe.

3. ניתוח FACS של ביטוי מלכודת תא שטח

  1. היום לפני transfection, 2 × 10 5 COS-7 תאי זרע בכל באר של צלחות 6-כן.
  2. 24 שעות לאחר transfection עם התהפך מלכודת, pTet-Off ופלסמידים PBI-G, תאים קבועים עם paraformaldehyde 1% בPBS + + במשך 15 דקות, ולאחר מכן חסמו ב10% FBS ב PBS + + במשך 15 דקות.
  3. התאים מודגרת עם 9E10 הנוגדנים אנטי-myc עבור 60 דקות.
  4. לאחר שלוש כביסות עם PBS + +, התאים מסומנים עם נוגדנים משניים FITC-מצומדות (1:200 דילול) עבור 45 דקות.
  5. לאחר שלוש כביסות עם PBS + +, התאים לגרד את הצלחות עם מגרד תא.
  6. 15,000 תאים מנותחים באמצעות cytometer זרימת FACSCalibur (BD Biosciences). עוצמת הקרינה הממוצעת של כל דגימה מתקבלת באמצעות תוכנת Pro CellQuest.

4. Assay איחוי תאים האנזימטית

  1. היום לפני transfection, 1.2 × 10 6 COS-7 התאים זרע בכל צלחת תרבית רקמה 100-מ"מ, ו2 × 10 5 COS-7 תאי זרע בכל באר של צלחות 6-כן.
  2. עבור v-תאים, 0.5-5 ק"ג כל אחד מflippעורך נצלן פלסמיד הוא cotransfected עם 5 מיקרוגרם של-Off pTet לתוך התאים בכל מנת התרבות 100-מ"מ. תאי בקרה cotransfected עם pcDNA3.1 הריק וקטור (+) וpTet-Off. כדי למנוע את N-glycosylation של 1 VAMPs, 4, 5, 7 ו 8, tunicamycin (10 מיקרוגרם / מ"ל) כלול במדיום תרבות תא במהלך transfection.
  3. עבור T-תאים בכל באר של הצלחות 6-כן, מיקרוגרם 1 מתוך התהפך SNAP-25 פלסמיד וPBI-G הוא cotransfected עם 0.5 מיקרוגרם של התהפך מיקרוגרם syntaxin1 פלסמיד או 0.05 של התהפך syntaxin4 פלסמיד.
  4. 24 שעות לאחר transfection, V-תאים מנותקים ממנות התרבות עם תא דיסוציאציה מאגר אנזימים חינם (Invitrogen). תאים משפחתיים נספרים עם hemacytometer וresuspended בHEPES-נאגר DMEM בתוספת 10% FBS, 6.7 מיקרוגרם / המ"ל tunicamycin וDTT mM 0.67.
  5. 4.8 × 10 5 resuspended V-תאים נוספים לכל גם כבר מכיל את תאי ה-T.
  6. לאחר חולדת 6, 12 או 24 שעות 37 מעלות צלזיוס בCO 2 5% , הביטוי של β-גלקטוזידאז נמדד באמצעות מערכת Assay אנזים β-גלקטוזידאז במאגר תמוגה כתב בהתאם להוראות היצרן (Promega). בקצרה, התאים נשטפו פעמים עם PBS, ולאחר מכן lysed במאגר תמוגה הכתב. lysates הסלולרי מעורבב עם נפח שווה של חיץ × Assay 2. כשלט ריק, מאגר תמוגה הכתב מעורבב עם הצפת Assay × 2.
  7. לאחר 90 דקות, תגובת colorimetric הוא נעצר על ידי הוספת סודיום קרבונט M 1.
  8. ספיגה ב420 ננומטר נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר 100-40 HITACHI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפתח assay איחוי תאי כמותיים, אנו מנצלים את הפעלת השעתוק החזקה על ידי הכריכה של tta לTRE. בהעדר tta, השעתוק של גן LacZ בTRE-LacZ שותק. כאשר tta קיים, הוא נקשר לTRE ומפעיל את השעתוק של LacZ. איור 1 מציג תרשים זרימה של assay איחוי התאים האנזימטית. tta הוא transfected לתוך V-תאים שחלבונים המפורש v-מוקש בתא השטח, וTRE-LacZ הם transfected לתוך תאי T שחלבונים מפורשים t-מוקש בתא השטח. היתוך של V-והתוצאות מתאי T בכריכה של tta לTRE, הפעלת התעתיק ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay איחוי התאים המקורי 6 קובע אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן אנו מתארים assay חדשני המכמת אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז ומדידת spectrometric. שימוש assay זה, אנו שגרתי לנתח 15-20-V ו-T-Snare שילובים יחיד בניסוי. באמצעות cytometry זרימה למדוד ביטוי מלכודת בתא השטח, אנו כיל את רמות הביטוי של VAMPs ולהשוות יכולות האיחוי שלהם (איורים 2, 4). יתר על כן, באמצעות איחוי התאים assay אנזימטי, קבע את התלות של פ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי קרני הפעלה מהאוניברסיטה לואיוויל וCA135123 מהמכונים הלאומיים לבריאות (לCH).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שמו של מגיב וציוד חברה מספר קטלוגים
DMEM Invitrogen 12800-017
COS-7 תאים ATCC CRL-1651
tunicamycin סיגמה אולדריץ T7765-5mg
pTet-Off Clontech K1620-
PBI-G Clontech 6150-1
lipofectamine Invitrogen 18324-012
פתרון דיסוציאציה תא אנזים חינם Invitrogen 13151-014
ארנב נוגדן אנטי polyclonal ט repressor Millipore AB3541
אנטי עכבר FITC מצומדות החמור IgG (H + L) JacImmunoResearch kson 715-095-150
confocal מיקרוסקופ סריקת ליזר אולימפוס FV1000
cytometer הזרימה FACSCalibur BD Biosciences
מערכת Assay אנזים β-גלקטוזידאז במאגר תמוגה כתב Promega E2000
הדגם 100-40 ספקטרופוטומטר UV-VIS היטאצ'י C740843

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
  5. Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  6. Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
  7. Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
  8. Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238(2010).
  9. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
  10. Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
  11. McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
  12. Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
  13. Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
  14. Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
  15. Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Tet OffVAMPSyntaxinCOS 7

מאמרים קשורים