הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הסתיידות של לתאי השריר החלק בכלי הדם והדמיה של אבי העורקים הסתיידות ודלקת

20.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54017

⸱

31 במאי 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הסתיידות כלי הדם היא מנבא חשוב ותורם למחלות לב וכלי דם בבני אדם. פרוטוקול זה מתאר שיטות להשראת הסתיידות של תאי שריר חלק בכלי הדם הראשוניים המתורבתים ולכימות הסתיידות ועומס מקרופאגים באבי העורקים של בעלי חיים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום.

תקציר

מחלות לב וכלי דם הן הגורם המוביל לתחלואה ותמותה בעולם. פלאק טרשת עורקים, המורכב ממקרופאגים עמוסי שומנים והסתיידות, מתפתח בעורקים הכליליים, במסתם אבי העורקים, באבי העורקים ובעורקי הצינור ההיקפיים ומהווים את סימן ההיכר של מחלות לב וכלי דם. בבני אדם, הדמיה עם טומוגרפיה ממוחשבת מאפשרת כימות של הסתיידות כלי הדם; נוכחות של הסתיידות כלי דם היא מנבא חזק לאירועים קרדיווסקולריים עתידיים. פיתוח טיפולים חדשניים במחלות לב וכלי דם מסתמך באופן קריטי על שיפור ההבנה שלנו של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של טרשת עורקים. קידום הידע שלנו על מנגנונים טרשת עורקים מסתמך על מודלים מבוססי עכברים ותאים. כאן, מפורטת שיטה להדמיית הסתיידות אבי העורקים וחדירת מקרופאגים באמצעות שתי בדיקות הדמיה פלואורסצנטיות קרובות לאינפרא אדום נפרדות מבחינה ספקטרלית. הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום מאפשרת כימות ex vivo של הסתיידות והצטברות מקרופאגים בכל אבי העורקים וניתן להשתמש בה כדי לקדם את הבנתנו את הקשר המכניסטי בין דלקת להסתיידות בטרשת עורקים. בנוסף, מתוארת שיטה לבידוד וטיפוח תאי שריר חלק בכלי הדם של אבי העורקים של בעלי חיים ופרוטוקול להשראת הסתיידות בתאי שריר חלק מתורבתים מאבי העורקים של העכברים או מעורקים כליליים אנושיים. ניתן להשתמש בשיטה זו של מידול הסתיידות כלי דם כדי לזהות ולאפיין את מסלולי האיתות החשובים ככל הנראה להתפתחות מחלות כלי דם, בתקווה לגלות מטרות חדשות לטיפול.

מבוא

מחלות לב וכלי דם הוא הגורם לתחלואה ותמותה המובילות בעולם, כולל ארצות הברית, שם היא מהווה מעל 780,000 מקרי מוות בשנה. 1 הסתיידות עורקים כליליים הסתיידות העורקים הם מסימני ההיכר של טרשת עורקים ולשמש מנבאים חזקים של אירועים קרדיווסקולריים. 2- 4 שני סוגים עיקריים של הסתיידות כלי הדם דווחו במבוגרים: הסתיידות intimal, הקשורים טרשת עורקים, המדיאלי (הידוע גם בשם Mönckeberg) הסתיידות, הקשורים למחלת כליות כרונית וסוכרת 5 הסתיידות intimal מתרחשת על רקע של הצטברות שומנים מקרופאג. החדרתם בדפנות כלי הדם. 5,6 הסתיידות הקיר המדיאלי מתרחשת באופן עצמאי של הסתיידות intimal, לוקליזציה לסיבי האלסטין או תאי שריר חלק, והוא לא קשור בתצהיר השומנים או חדירה מקרופאג. 5,7,8 מחקרים על המנגנונים המולקולריים שלהסתיידות כלי דם יש לסמוך על מערכות מודל מבוססי תאים ובבעלי חיים. מודלים מכרסמים למחלת atherocalcific כוללים עכברים חסר או אפוליפופרוטאין E (APOE) 9,10 או קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLR) 11 שקיבלו תזונה עשירה בשומן, בעוד מודלים הסתיידות המדיאלי כוללים עכברים עם חלבון מטריקס GLA (MGP) חסר 12 או חולדות לפתח uremia באמצעות כריתת כליה כמעט מוחלטת (מודל כריתת הכליה 5/6) או על ידי חשיפת דיאטה עתירה אדנין. 13

כאן, המודל של הסתיידות כלי דם המדיאלי הקשורים מחסור MGP מתמקד. MGP הוא חלבון תאיים המעכבת הסתיידות עורקים. 12 מוטציות בגן MGP זוהו תסמונת Keutel, למחלה אנושית נדירה המאופיינת הסתיידות הסחוס מפוזר בנוסף brachytelephalangy, אובדן שמיעה, היצרות ריאתי הפריפריה. 14-18 למרות שלא לעתים קרובות ציינו, 19הסתיידות קונצנטריים של העורקים מרובים תוארה תסמונת Keutel. 20 פולימורפיזם Common בגן MGP אדם קשורים לסיכון מוגבר הסתיידות עורקים כליליים, 21-23 בעוד שרמות במחזור גבוה של uncarboxylated, MGP פעיל ביולוגית לחזות התמותה ממחלת לב כלילית. 24 בניגוד לבני אדם עם תסמונת Keutel, עכברים MGP מחסר לפתח פנוטיפ כלי הדם חמורה המורכב הסתיידות עורקים נפוצה ספונטנית החל שבועיים של להזדקן ולמות 6-8 שבועות לאחר הלידה עקב קרע באבי העורקים. 12

בניגוד ApoE - / - ו LDLR - / - עכברים שקיבלו תזונה עשירה בשומן, אשר לפתח הסתיידות כלי הדם intimal עם דלקת מקרופאג הנגרמת הקשורים, MGP - / -. עכברים לפתח הסתיידות כלי הדם המדיאלי בהעדר חדירה מקרופאג 11,25 למרות ממצאים אלה מראים גירויים בסיסיים שונים עבור intimאל ו הסתיידות המדיאלי, קיימת חפיפה במנגנוני איתות כי לתווך שתי צורות של הסתיידות. 26 מסלולי איתות מרובים זוהו שתורמים הסתיידות כלי הדם כולל מתווכים דלקתיים כגון-α גורם נמק הגידול ו- IL-1 וגורמים פרו-osteogenic כגון Notch, Wnt, וחלבון העצם המוךפו"גנטי שהולך (BMP) איתות. 27,28 מסלולי איתות אלו להגדיל הביטוי של גורמי שעתוק גורם שעתוק הקשורות גמד 2 (Runx2) ו osterix, אשר בתורו להגדיל ביטוי של חלבונים הקשורים העצם ( . למשל, osteocalcin, sclerostin, ו phosphatase אלקליין) בכלי הדם אשר מתווכים הסתיידות 28-30 אנו ואחרים הוכיחו כי הסתיידות כלי הדם שנצפתה ApoE - / - ו LDLR - / - עכברים שקיבלו תזונה עשירה בשומן ואת ספונטנית הסתיידות כלי הדם שנצפתה MGP - / - עכברים הכל תלוי חלבון המוךפו"גנטי שהולך העצם (BMP) סיgnaling, וזה מסלול זה כי הוא התמקד כאן. 11,25,31 BMPs גורמי osteogenic חזקים הנדרשים היווצרות עצם ידוע להפגין ביטוי מוגבר טרשת עורקי אדם. 32-34 במבחנה יש מעורב איתות BMP בויסות הביטוי של גורמים osteogenic כגון Runx2. 35-37 התבטאות יתר של ליגנד BMP, BMP-2, מאיצה את הפיתוח של הסתיידות כלי הדם בעכברים ApoE לקוי שקיבלו תזונה שומן גבוה. 38 יתר על כן, השימוש הספציפי BMP איתות מעכבי כזה כמו LDN-193,189 (LDN) 39,40 ו / או ALK3-Fc מונע התפתחות של הסתיידות כלי הדם בשני LDLR - / - עכברים שקיבלו תזונה עשירה בשומן ועכברים MGP מחסר 11,25.

תאי דם שריר חלק (VSMCs) יש תפקיד קריטי בהתפתחות של הסתיידות כלי דם. 30,41,42 הסתיידות כלי הדם המדיאלי שמתפתחת MGP מחסר עכברים הוא characterized ידי transdifferentiation של VSMCs כדי פנוטיפ osteogenic. הפסד של תוצאות MGP בביטוי ירידה של סמנים VSMC כולל myocardin אקטין שריר חלק אלפא, עם עלייה מקבילה סמנים osteogenic כגון Runx2 ו osteopontin. שינויים אלה עולים בקנה אחד עם הפיתוח של הסתיידות כלי דם. 25,43,44

הסתיידות ודלקת אבי העורקים בעכברים מוערכים בדרך כלל תוך שימוש בטכניקות histochemical כגון פעילות phosphatase אלקליין עבור הסתיידות מוקדם ופעילות osteogenic, פון Kossa ו Alizarin מכתים אדום עבור הסתיידות מאוחר, ופרוטוקולים immunohistochemical כי למקד סמנים חלבוניים מקרופאג (למשל., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 עם זאת, שיטות הדמיה סטנדרטיות אלו דורשים עיבוד של רקמות העורקים לתוך חתכים, מה שגוזל זמן רב ולא מושלם בשל דגימה מוטה, ו מוגבלים שלהם היכולת לכמת דלקת calcificatיון באבי העורקים כולו. פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי לחזות ולכמת הסתיידות עורקים אבי העורקים ובינוניים כולו וצבירת מקרופאג ניצול פלורסנט קרוב אינפרא אדום (ניר) הדמיה מולקולרית vivo לשעבר. גם סיפק היא שיטה להכנת זרעים culturing VSMCs אבי העורקים הראשי מעכברים זירוז הסתיידות של murine ו VSMCs אדם במבחנה כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הסתיידות כלי הדם. טכניקות אלה מספקים את החוקר עם הן in vivo ו בשיטות במבחנה לחקר מחלת atherocalcific.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים שנעשו בעכברים בוצעו בהתאם קפדנית עם ההמלצות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. שיכון כל הנהלים הקשורים עכברים המתוארים במחקר זה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש ועדות של החולים הכללי במסצ'וסטס (ועדת המשנה על מחקר טיפול בבעלי חיים). כל הנהלים בוצעו בזהירות כדי למזער את הסבל.

1. הכנת ריאגנטים

  1. קרוב אינפרא אדום קרינת הדמיה של פריטי Aortas
    הערה:. A-נגזר בביספוספונטים, קרוב אינפרא אדום בדיקת דימות פלואורסצנטי ניתן להשתמש כדי לסמן פעילות osteogenic בכלי הדם באמצעות קשירת hydroxyapatite 46,47 בדיקת דימות פלואורסצנטי המופעל cathepsin יכולה לשמש כסמן פרוטאוליטים מקרופאג ופעילות elastolytic ב כלי הדם. 9 כדי לאפשר שימוש בו זמני של שתי בדיקות ניאון, חשובלהשתמש בדיקות שאינן ספקטרלית ברורים. הסידן בסימון NIR ישמש כדי לציין את ספציפיים ההסתיידות האינפרה-אדום קרוב חללית הדמית פלורסנט cathepsin NIR כדי לציין את הפעילות הספציפית cathepsin האינפרה-אדום קרוב חללית הדמית ניאון.
    1. הכן את הפתרונות של סידן ניר cathepsin NIR. על פי הפרוטוקולים של היצרן, להוסיף 1.2 מ"ל של בופר פוספט 1x (PBS) בקבוקון המכיל 24 nmol של סידן NIR או cathepsin NIR ולנער בעדינות.
      הערה: לדברי היצרן, פעם מחדש עם PBS, פתרונות Nir Nir סידן cathepsin להישאר במצב יציב למשך 14 ימים, כאשר הם מאוחסנים בחושך ב 2-8 מעלות צלזיוס.
  2. בידוד הסתיידות Murine אבי העורקים VSMCs
    1. אבי העורקים עיכול פתרון:
      1. הכן פתרון חדש (~ 3-5 מ"ל לכל האאורטה שנקטפו) עם תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) המכיל 175 U / ml סוג 2 collagenase ו -1.25 אלסטט U / ml. לעקר את הפתרון wה- i מערכת סינון מונחה ואקום 0.22 מיקרומטר ולשמור הפתרון על הקרח עד לשימוש.
    2. Cell Media:
      1. מוסף 500 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברית, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. מומלץ לחמם את התקשורת ל -37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    3. הסתיידות מדיה:
      1. הסתיידות Media A (NaPhos; בשימוש שורות תאי עכבר):
        1. מוסף 100-500 מ"ל של DMEM (נפח לפי הצורך) עם 10% בסרום שור עוברית, סודיום פוספט 2 מ"מ, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. מומלץ לחמם את התקשורת ל -37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

          אוֹ
      2. הסתיידות מדיה B (βGP / עולה / DEX; שימושית בשני עכבר או שורות תאים אנושיות):
        1. מוסף 100-500 מ"ל של DMEM (נפח לפי הצורך) עם 10% בסרום שור עוברית, 10 Disodium מ"מ β-glycerophosphate, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​חומצה L-אסקורבית, 10dexamethasone ננומטר, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. מומלץ לחמם את התקשורת ל -37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

הזרקת 2. זנב וריד

  1. לפני הזרקת זנב, לחמם את העכברים תחת מנורת חימום קלה למשך 5 דקות.
  2. לרסן את העכבר בבעל מכרסם צינור. לחטא את הזנב עם ספוגית אלכוהול.
  3. לנצל מחט 30 G עבור הזרקה לווריד הזנב. ורידי זנב ממוקמים רוחבי.
    1. למרוח כמות עדינה של לחץ קדימה על המזרק כמו המחט היא מתקדמת לתוך הזנב. הווריד הוא לגשת פעם התנגדות ההזרקה הוא כבר לא קיים.
    2. להזריק נפח של 100 μl של סידן NIR ו / או 100 μl של cathepsin NIR בקצב קבוע. בסוף הזריקה, לאחר הפסקה שנייה 5, לשלוף את המחט.
  4. קציר aortas (ראה סעיף 3) 3-24 שעות לאחר ההזרקה.

3. עכבר Dissection

  1. להרדים העכבר עם זריקה פנטוברביטול intraperitoneal 200 מ"ג / ק"ג.
  2. הנח את פרקדן חיה על קרש החיתוך ולייצב ידי מקליטה כל כפה ללוח. באמצעות מיקרוסקופ לנתח ומספריים קטנים, לעשות חתך קו אמצע המשתרעת הבטן התחתונה אל החזה העליון.
  3. לקלף את העור עם מלקחיים ולהסיר את הצפק, חושף את אברי הבטן. הסר את האיברים במערכת העיכול, נזהר שלא transect האאורטה.
  4. ביצוע חתך לרוחב הסרעפת הקדמית ולהמשיך את החתך לרוחב הבטן. בעזרת מספריים לנתיחה, לשחרר את בית החזה על ידי חיתוך דרך צידי הצלעות והסרת חסיד הרקמות הרכה לחלק המעולה של עצם החזה. הסר את בית החזה, חושף את הריאות.
  5. השאירו את הלב במקום בתחילה (לעזרתו בזיהוי לנתח את אבי העורקים הפרוקסימלי) ובזהירות להסיר את הריאות. הסר את התימוס, קנה הנשימה והוושט בזהירות, ensuring כי אב העורקים נותרו בשלמותה.
  6. שימוש ישר מלקחיים בסדר ומספריים לנתח-מיקרו, להסיר את הרקמות הרכות סביב האאורטה מ הסתעפות הכסל אל קשת אבי העורקים, תשומת לב קפדנית בעת הסרת שומן פרי-אבי העורקים (איור 1 א). הסר את רקמת שומן ורכה הנותרת סביב הסניפים הגדולים של קשת אב העורקים (כלומר, brachiocephalic, עורקי ראש ואת subclavian משותפים, איור 1B).
    הערה: חשוב להסיר את השומן מן האאורטה בגלל השומן יכול להגדיל את אות הרקע בעת ביצוע דימות פלואורסצנטי.
  7. הסר את הלב מחלל בית החזה, בזהירות ניתוק זה מן האאורטה הפרוקסימלית, וזורקים. Transect האאורטה דיסטלי ב הסתעפות הכסל. באמצעות מחט אינסולין, להזריק מלח רגיל לתוך אבי העורקים מן קשת אבי העורקים לשטוף את תאי הדם הנותרים. לנתק את אבי העורקים יחד עם כלי קשת אבי העורקים, לגמרי הסרתומהגוף.
  8. מניח את אב העורקים בתמיסת מלח רגיל על קרח עד מוכן הדמיה.

4. הדמיה אבי העורקים

  1. Aortas תמונה vivo לשעבר מיד לאחר הקציר על ידי הדמיה ההחזרה הקרינה האינפרה-אדום הקרוב. 25
    1. הגדר את תרמי הקרינה בבית אורכי הגל רב המתאים לכמת עוצמות אות הקרינה מן aortas של סידן NIR ועכברים NIR-מוזרק cathepsin, כפי שתואר לעיל. 25 לדברי היצרן, NIR סידן יכול להיות נרגש על ידי ~ 650-678 ננומטר אור עם פליטה מקסימלי בטווח ~ 680-700 ננומטר. Cathepsin NIR יכול להיות נרגש על ידי ~ 745-750 ננומטר אור עם פליטה מרבית ב ~ 770 ננומטר.

בידוד 5. Murine ראשיים אבי העורקים וכלי דם שריר חלק תאים

  1. בצע שלבים 3.1-3.7 כמתואר לעיל.
  2. מניחים aortas בקור HBSS עד והניתוחים הושלמו. בזהירות לחתוך משם כל remaining שומן periaortic ורקמות רכות, עוזב את אבי העורקים בלבד.
  3. מתחת למכסה המנוע בתרבית רקמה סטרילי, להעביר את aortas אל פתרון העיכול אבי העורקים ב -35 מ"מ x 10 מ"מ צלחות בתרבית רקמה. מקום באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם נדנדה לסירוגין עדינה. לאחר העיכול, aortas להפגין מראה מתוח או בלוי.
  4. עם מיקרוסקופ לנתיחה ו מלקחיים סטרילית, להסיר את שכבת adventitial החיצונית של אב העורקים, תוך שמירה על שכבת המדיאלי ללא פגע. טכניקה אחת עבור הסרת adventitia היא לקלף את השכבה החיצונית של האאורטה בקצה אחד ולהסירו משכבה המדיאלי הבסיסית כמו גרב יכול להיות קלף והוסר.
  5. לאחר שכבת adventitial הוסר, למקם את אבי העורקים הנותרים לתוך צלחת בתרבית רקמה חדשה עם תרבית תאים התקשורת ולאחסן ב 37 ° C עם 5% CO 2 עבור 2-4 שעות.
  6. מתחת למכסה המנוע סטרילית באמצעות מספריים 3 מ"מ מיקרו לנתיחה סטרילי, לחתוך את אבי העורקים לתוך 1-2 מ"מ רחבטבעות.
  7. מניחים טבעות אלה בצלוחית בתרבית רקמה חדשה עם פתרון העיכול אבי העורקים ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה לסירוגין עדין עבור 120 דקות. פיפטה את הפתרון ומטה מספר פעמים במהלך הדגירה זה כדי resuspend תאים.
  8. הוסף 5 מ"ל של תרבית תאים התקשורת חם הפתרון לעיכול והעברת צינור חרוטי 15 מ"ל.
  9. צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 200 x ז.
  10. לשאוב תקשורת ותא resuspend בהיקף הרצוי של תקשורת תרבית תאים (למשל, 5 מיליליטר).
  11. פלייט את כל הסכום של תאים מבודדים מכל האאורטה בבקבוק תרבות 25 ס"מ 2 תאים ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הפץ תאים באמצעות טכניקות סטנדרטיות, כפי שתואר לעיל. 25,48 במהלך הדגירה 7-10 הימים הראשוניים, לשנות את התקשורת בכל 72-96 שעות. כאשר התאים להתקרב מפגש, לחדש תקשורת בתדירות גבוהה יותר (כל 48 שעות).
    הערה: זה עלול לקחת שבועות רבים לגדל קואה מספיקntity של תאים.
  12. לאחר ומחוברות, תאי המעבר עם טריפסין כי הוא חימם עד 37 מעלות צלזיוס.
    1. הוסף 0.5-1.0 מ"ל של טריפסין לכל בקבוק תרבות דגירה של 3-5 דק '; לטפוח בעדינות את הצד של הבקבוק כל 30-60 שניות לפי הצורך לנתק תאים מפני השטח.
    2. לאחר התאים להתנתק החלק התחתון של הבקבוק, להוסיף 10 מיליליטר של תא תקשורת התאים טריפסין. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב התקשורת טריפסין מן התא גלולה. Resuspend התאים את הכמות הרצויה של התקשורת תא טרי (למשל, 5-10 מ"ל) ולהעביר בבקבוק חדש (עם תאים מסוימים הועבר שקופית קאמרית).
  13. במעבר של תאים הראשון, לאשר את שושלת תא שריר חלק עם טכניקות immunocytochemistry סטנדרטיות, כפי שתואר לעיל, 49 באמצעות נוגדן המכוון נגד יקטין שריר α-חלקה.

6. התרמת הסתיידות של שריר חלק מתורבתתאים

  1. פלייט תאים המתקבל 5.12 במתכונת 6 באר. הערה: חל 1 x 10 5 תאים / טוב בנפח כולל של 2.0 מיליליטר של תקשורת תא לכל טוב מומלץ.
  2. אפשר לתאים לגדול ב קלציפיקציה Media A או B למשך 7 ימים לפחות במתכונת 6-גם צלחת. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  3. שינוי בתקשורת תא כל 48 שעות.

7. הערכת VSMC קלציפיקציה שימוש בשיטה פון Kossa מכתים

הערה:. שיטת Kossa פון למדידת הסתיידות תא מטריקס של רקמות או תאים בתרבית מבוססת על ההחלפה של יוני סידן הנכנס פוספט עם יוני כסף 50 בנוכחות תרכובות אור ואורגני, יוני הכסף מופחת ו מדמיין מתכתי כסף. כל כסף unreacted הוסר על ידי טיפול עם נתרן תיוסולפט 50 פרוטוקול מכתים פון Kossa הוא כדלקמן.:

  1. תקשורת לשאוב מ"ק תאצלחות lture.
  2. תקן תאים על ידי הצבתם 1 מ"ל של פורמלין 10% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  3. הסר את פורמלין לשטוף את התאים הקבועים עם מים מזוקקים במשך 5 דקות.
  4. דגירה התאים 1 מ"ל של תמיסת כסף חנקתי 5% מתחת לנורה W 60-100 במשך 1-2 שעות.
  5. לשאוב את תמיסת כסף חנקתי ולשטוף עם מים מזוקקים במשך 5 דקות.
  6. הסר כסף unreacted ידי הצבת התאים 1 מ"ל של נתרן תיוסולפט 5% (w / v) פתרון במים מזוקקים למשך 5 דקות.
  7. יש לשטוף את התאים עם מים מזוקקים במשך 5 דקות. 3x שטיפות חוזרות. כתם פון Kossa מוכן הדמיה עם מיקרוסקופ אור ההפוכה סטנדרטית.
  8. שלב אופציונלי: Counterstain עם 1ml של אדום מהיר גרעיני במשך 5 דקות. בצע את זה עם שלושה שוטף עם מים מזוקקים (5 דקות כל אחד).

אוֹ

8. הערכת קלציפיקציה VSMC עם קרוב אינפרא אדום דימות פלואורסצנטי

הערה: בדומה יכולתהלזהות הסתיידות בתוך aortas עכבר, סידן NIR נקשר שהופקדו מינרליים calcific בקלות על ידי תאים בתרבית. באמצעות טכניקה זו, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וקורא צלחת עם מסננים באורכי גל ארוכים יותר יכול תמונה ולכמת הסתיידות במבחנה, בהתאמה. הפליטה באורכי הגל הארוכה יותר של סידן NIR מאפשרת הניצול סימולטני של fluorophores פולטת באורך הגל נמוך כדי לזהות תכונות אחרות. הפרוטוקול מכתים סידן NIR הוא כדלקמן:

  1. כפי שתואר בסעיף 1.1.1, להוסיף 1.2 מ"ל של 1x PBS בקבוקון המכיל 24 nmol של סידן NIR.
  2. לדלל את הסידן NIR מניות 1: 100 בתקשורת ההסתיידות או בקרה הנאותה.
  3. תקשורת התא לשאוב תרבות צלחות ולהחליף עם סידן NIR המכיל תקשורת ותרבות.
  4. דגירת צלחות התרבות עם תקשורת NIR סידן הלילה ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. לשאוב התקשורת המבארת ולשטוף את הבארות פעם עם PBS.
    הערה: בשלב זה,ניתן להוסיף בתקשורת התרבות המקורית על הבארות, והתאים ניתן הדמיה חיה. אם לא, המשך לשלבים הבאים.
  6. תקן תאים על ידי הצבתם 1 מ"ל של פורמלין 10% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  7. הסר את פורמלין לשטוף את התאים הקבועים עם מים מזוקקים במשך 5 דקות. 3x שטיפות חוזרות.
  8. שלב אופציונלי:. בצע מכתים immunofluorescence או counterstains אחרים עבור חלבונים בעלי עניין 8,9
  9. תמונה או לזהות את כתם NIR סידן באמצעות אורכי גל עירור קרינה מתאימה (למשל, NIR סידן יכול להתרגש 650-678 אור ננומטר) ומסנן פליטה (~ 680-700 ננומטר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הסתיידות עורקים ב MGP - / - ו עכברי-בר נמדדה באמצעות הדמיה של קרינת NIR סידן. אין אות NIR סידן זוהתה aortas מעכברי wild-type, המציינת את עדר ההסתיידות (איור 2). אות NIR סידן חזקה זוהתה aortas מעכברי MGP המחסר, אשר עולה בקנה אחד עם הסתיידות כלי דם מתקדמת. קטעי aortas הרקמות של wild-type ו MGP - / - עכברים הוכתמו 25 אדום Alizarin (איור 3 א - ב), המאשר את הסתיידות כלי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הסתיידות העורקים היא גורם סיכון חשוב למחלות לב וכלי דם בבני אדם ועשויים לתרום ישירות בפתוגנזה של אירועים קרדיווסקולריים. 1,5,52 בתצהיר סידן intimal ב כיפה סיבית דקה של מחלת טרשת עורקים הוצע להגדיל מתח ביומכנית המקומי ולתרום קרע פלאק. 53,54 משפיע הסתיידות המדיאלי התוצאות הקליניות על ידי הגדלת קשיות העורקים, מה שיכול לגרום להיפרטרופיה לב להשפיע על תפקוד הלב. 55 לכן, הבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הסתיידות כלי הדם יספק תובנות חשובות מחלות אנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

בית החולים הכללי של מסצ'וסטס הגיש בקשה לפטנטים הקשורים למעכבי מולקולות קטנות של קולטני BMP מסוג I ויישום ALK3-Fc לטיפול בטרשת עורקים והסתיידות כלי דם, ו-MD, PBY, KDB ו-RM עשויים להיות זכאים לתמלוגים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן לחקר הלב וכלי הדם של סרנוף (MFB ו-TET), המכון הרפואי הווארד יוז (TM), פרס מלגת הזיכרון של לאדו מבית הספר לרפואה של הרווארד (DKR), תוכנית START של הפקולטה לרפואה ב-RWTH אאכן (MD), קרן המחקר הגרמנית (DE 1685/1-1, MD), המכון הלאומי לעיניים (R01EY022746, ESB), קרן לדוק (תוכנית רב-תחומית להבהרת תפקידו של איתות חלבון מורפוגנטי בעצם בפתוגנזה של מחלות כלי דם ריאתיות ומערכתיות, PBY, KDB ו-DBB), המכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור (R01AR057374, PBY), המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R01DK082971, KDB ו-DBB), פרס עמית לפקולטה של איגוד הלב האמריקאי #11FTF7290032 (RM), והמכון הלאומי ללב, ריאות ודם (R01HL114805 ו-R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור חרוטי 15 מ"לFalcon352096
30 גרם מחטBD305106
נוגדן אקטין שריר חלק אלפאסיגמאSAB2500963
שקופית תאNunc Lab-Tek154461
קולגנאז, סוג 2 וורת'ינגטוןLS004176
דקסמתזוןסיגמאD4902
Modified Eagle Medium Life Technologies של Dulbecco11965-084
תמיסת מלח פוספט חוצץ של Dulbecco, ללא סידןGibco14190-144
ElastaseSigmaE1250
סרום בקר עובריGibco16000-044
מלקחיים, מלקחיים RobozRS-4972
, עקומה מלאה משוננתRobozRS-5138
פורמלין (10%)Electron Microscopy Sciences15740
תמיסת המלח המאוזנת של האנקGibco14025-092
תאי שריר חלק בעורק הכלילי האנושיPromoCellC-12511
מזרק אינסולין עם מחטTerumoSS30M2913
חומצה L-אסקורביתSigmaA-7506
מספריים קפיציים מיקרו-חיתוך (13 מ"מ)RobozRS-5676
מספריים קפיציים מיקרו-חיתוך (3 מ"מ)RobozRS-5610
NIR, קטפסין (ProSense-750EX)Perkin ElmerNEV10001EX
NIRאוסטיאוגני (OsteoSense-680EX)פרקין אלמרNEV10020EX
תמיסת מלח רגילהHospira0409-4888-10
גרעינית מהירה אדוםSigma-AldrichN3020
OdysseyLi-CorOdyssey 3.0
פניצילין/סטרפטומיציןקורנינג30-001-CI
כסף חנקתי (5%)Ricca Chemical Company6828-16
נתרן פוספט דו-בסיסי הפטהידראטסיגמא-אולדריץ'S-9390
נתרן תיוסולפטסיגמאS-1648
ß-גליצרופוספט דיסודיום מלח הידרטסיגמאG9422
בקבוק תרבית רקמות, 25 ס"מ2Fal353108
תרבית רקמות צלחת (35 מ"מ x 10 מ"מ)פלקון353001
צלחת תרבית רקמות, שש בארותפלקון353046
טריפסיןקורנינג25-053-CI
מחזיק מכרסמיםKent ScientificRSTR551
מערכת סינון מונעת ואקוםMilliporeSCGP00525
עדין מערכת הדמיה con צינור

מקורות

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
  3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
  4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291 (2), 210-215 (2004).
  5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 724-736 (2014).
  6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47 (8 Suppl), C13-C18 (2006).
  7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (6), 1599-1605 (2008).
  8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119 (13), 1785-1794 (2009).
  9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
  10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14 (9), 1480-1497 (1994).
  11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 613-622 (2012).
  12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386 (6620), 78-81 (1997).
  13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31 (6), 471-481 (2010).
  14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96 (43), 1676-1681 (1971).
  15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21 (1), 142-144 (1999).
  16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24 (2), 289-294 (1986).
  17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142 (3), 201-203 (1984).
  18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48 (4), 357-361 (2006).
  19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9 (6), 1225-1235 (2011).
  20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17 (3), 566-569 (2001).
  21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6 (3), 271-278 (2013).
  22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (3), 645-651 (2013).
  23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55 (1), 59-65 (2009).
  24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65 (2), 463-470 (2015).
  25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10 (1), e0117098(2015).
  26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 715-723 (2014).
  27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4 (3), 148-156 (2008).
  28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25 (4), 267-274 (2015).
  29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109 (5), 564-577 (2011).
  30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97 (2), 105-114 (2005).
  31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107 (4), 485-494 (2010).
  32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91 (4), 1800-1809 (1993).
  33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23 (4), 609-620 (2011).
  34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20 (23), 8783-8792 (2000).
  36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283 (43), 29119-29125 (2008).
  37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199 (2), 271-277 (2008).
  38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (10), 1908-1915 (2010).
  39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18 (15), 4388-4392 (2008).
  40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
  41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19 (4), 217-226 (2013).
  42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104 (6), 733-741 (2009).
  43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110 (4), 935-947 (2010).
  44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89 (12), 1147-1154 (2001).
  45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67 (6), 2488-2493 (2005).
  46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19 (12), 1148-1154 (2001).
  47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115 (3), 377-386 (2007).
  48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889(2013).
  49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
  50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56 (3-4), 177-185 (1978).
  51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350 (2), 177-185 (2006).
  52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99 (10), 1044-1059 (2006).
  53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14678-14683 (2006).
  54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (5), H619-H628 (2012).
  55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12 (5), 500-509 (2007).
  56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39 (4), 264-270 (2011).
  57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312 (17), 1764-1771 (2014).
  58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368 (6), 503-512 (2013).
  59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90 (2), 844-853 (1994).
  60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108 (11), 1381-1391 (2011).
  61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (7), 1017-1024 (2009).
  62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101 (5), 1087-1096 (2007).
  63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
  64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59 (1), 1-61 (1979).
  65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308 (1-2), 25-33 (2008).
  66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19 (9), 2112-2118 (1999).
  67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
  68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49 (5-6), 365-373 (2012).
  69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
  70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
  71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104 (6), 710-711 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימות הסתיידות של אבי העורקיםדימות פלואורסצנציה בבליקים אינפרא-אדומיםתאי שריר חלק של אבי העורקים של עכבריםהשראה באמצעות מדיום הסתיידותצביעת Von Kossaהזרקה לווריד הזנבתמיסת עיכול של אבי העורקיםהערכת חדירת מקרופאגיםכימות באמצעות ImageJ
הסתיידות של לתאי השריר החלק בכלי הדם והדמיה של אבי העורקים הסתיידות ודלקת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.