האסיפה והיישום של 'טבעות Shear': מודל האנדותל חדשני Orbital, חד-כיוונית תקופתית נוזלי זרימת מתח שאר

סיכום

ידוע כי רמות ודפוסים שונים של גזירה נוזלית מווסתים את ביטוי הגנים האנדותליים, הפנוטיפ והרגישות למחלות. אנו דנים בהרכבה ושימוש ב'טבעות גזירה': מודל המייצר דפוסי מתח גזירה חד-כיווניים ותקופתיים. טבעות גזירה פשוטות להרכבה, חסכוניות ויכולות לייצר תשואות תאים גבוהות.

תקציר

סטיות רמות ודפוסים נורמלי של תפקידים חשובים לשחק גזירה נוזל וסקולרית בפיזיולוגיה וסקולרית והפתופיזיולוגיה ידי גרימת אדפטיבית וכן שינויים פתולוגיים פנוטיפ האנדותל ביטוי גנים. בפרט, תופעות הסתגלותי של מאמץ גזירה תקופתי, חד כיוון זרימה מושרה יכולות להפעיל מגוון של השפעות על תאי מסווגים מספר כלי דם, במיוחד בתאי האנדותל. בעוד ידי חברה תא אנדותל ממוצאים אנטומיים מגוונים היווה תרבותי, ניתוחים מעמיקים של תגובותיהם גזירה נוזלת כבר הקשו על ידי המורכבות היחסית של מודלי גזירה (למשל, תא זרימת צלחת במקביל, חרוט מודל תזרים צלחת). בעוד אלה מייצגים גישות מעולות, מודלים כאלה הם מסובכים מבחינה טכנית סובלים חסרונות כוללים זמן הכנה ממושך יחסית ומורכב, שטח פנים נמוך, דרישות עבור משאבות לחץ קבוע אשר לעתים קרובות דורשות איטום אטמים, יצירת אתגרים בוטתחזוקת h של עקרות וחוסר יכולת לנהל ניסויים מרובים. עם זאת, אם תימצא בה דמויות תפוקה גבוהות יותר של זרימת גזירה היו זמינות, יותר התקדמות על תגובות גזירה האנדותל של כלי דם, במיוחד מחקר גזירה תקופתי ברמה המולקולרית, עשוי להיות מתקדם במהירות רבה יותר. כאן, אנו מתארים את הבנייה ושימוש טבעות גזירה: רומן, פשוט להרכיב, ודגם בתרבית רקמה זול עם שטח פנים גדול יחסית המאפשר בקלות עבור מספר גבוה של משכפל ניסיוני חד כיווני, מחקרי מתח תקופתי גזירה על תאי האנדותל.

מבוא

מאמץ גזירה נוזל הוכח לווסת תוכניות גן אנדותל ^{1 - 5} באמצעות הפעלת אלמנטים ציס-רגולטוריות פעילות acetyltransferase ^6, היסטון ⁷ ואלמנטי תגובת לחץ גזירה (SSRE) ^8. גזירת שפעות לחץ תרומות אנדותל כלפי קרישה על ידי ויסות רקמות גורם ⁹ ו activator plasminogen רקמות (tPA) ביטוי ^10. גזירת לחץ משפיע גם שליטת אנגיוגנזה ¹¹ שיפוץ כלי ידי ויסות סינתזת PDGF-B והיענות ^8. אנדותל, שנגזרה adrenomedullin מתווכים vasoactive, אנדותלין -1, urotensin השנייה relaxin מוסדרים גם על ידי ¹² גזירה. תמלול של ייצור synthase תחמוצת חנקן אנדותל ייצור תחמוצת חנקן הם ¹⁰ תלויות הגזירה. שאר שולט גם ביטוי ICAM-1 האנדותל ^13. מאמץ גזירה נגרם זרימה יכול ולכן powerfully להשפיע מגוון רחב של תגובות האנדותל. חשוב לציין, פעימות לב וכלי דם עכשיו מופיעות גם למלא תפקידים חשובים בפתופיזיולוגיה של שני הזדקנות כלי הדם הנורמלית וצורות של דמנציה וסקולרית ¹⁴ ואף עלולה לתרום מחלות ניווניות אחרות, כגון טרשת נפוצה ^15.

ורידים ותאי האנדותל עורקים נחשפים מטבעו תבניות זרימה המודינמי מגוונות in vivo, ורבי פנוטיפים תאים שונים אנדותל ניתן הציגו ^16. בהתאם לעכל את גודלן ואת המחזוריות של זרימה, השפעות על תאי האנדותל עשויות לכלול הפעלת תא דלקתית אפופטוזיס, אשר עשוי לשקף שינויים בביטוי גנים או חלבון ^17,18. מחקרים על תגובות תא האנדותל גזירת תופעות ולכן נשארים מסתבכים בשל הקשיים בהפקה במודלים חוץ גופייה כי כראוי לייצר דפוסי גזירה כזו.

experime רב ושונהפרוטוקולים פתיחות opening סגירות closures פותחו כדי להחיל מאמץ הגזירה נוזל אנדותל monolayers התא. אחת מהמערכות הנפוצות ביותר הוא תא זרימת צלחת במקביל, יוצרת זרימה למינרית אחידה בתוך התא ^{19 - 21.} משאבת peristaltic מחוברת בדרך כלל ליצור זרימה תקופתית, אשר יכול לשחזר מאפייני תזרים נמצאים בדרך כלל במקומות רבים in vivo ^22. עוד הגדרת משותף משתמשת במודל 'חרוט צלחת ", שבו מתח גזירה נוזל נקבע על ידי מהירות הסיבוב של החרוט ^23. שני מערכות, והסדרים אחרים הדומים להם, יכולים להיות מייגעות להגדיר דורשים רכיבים שיכולים להיות יקר יחסית ולא נגיש למעבדות רבות.

מגבלה עיקרית נוספת של המודלים הנוכחיים אלה הוא מספר נמוך יחסית של מחקרים לשכפל שניתן לבצע בו זמנית, כל אחד עם שטח פנים נמוך יחסית. זו מאריכה את הזמן ושיתוף mplexity של גישות כאלה. לכן, מודל אידיאלי שגורם גזירה חד כיווני ותקופתית עשוי להיות אחד שבו מספר גבוה של משכפל מחקר ניתן להגדיר בקלות, כל אחד עם שטח פנים גדול יחסית. יתר על כן, המודלים הנ"ל דורשים התקנה מתוחכמת למדי, אשר עשוי להיות עלות אוסרני עבור משתמשים רבים. מודל שיכול לייצר הפרעות גזירת נוזל תוך שימוש בחומרי מעבדה בסיסיים עשוי להיות מספר יתרונות.

שיטה פשוטה מאוד חסכונית של החלת מתח גזירה חד כיווני, תקופתי כרוכה את המיקום של מנות חוזרות על שייקר מסלולית ^24. פרוטוקול זה הוא פשוט מאוד וניתן לשנותם עד כדי להשיג מספרים גבוהים של מחקר משכפל, כל אחד עם שטח פנים גדול יחסית, בהתאם לצורך. עם זאת, תאים ממוקמים במרכז של המנה נחשפים דפוסי זרימה שונים מאשר תאים לאורך בפריפריה, מניב תגובות פנוטיפי הסלולר מעורבות באותה הצלחת.

_content "> בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים את הבנייה והשימוש 'טבעות גזירה', המודל שלנו ליצירת מתח גזירה חד כיווני ותקופתיים. העיצוב של טבעת גזירה פנוטיפים הנגרמת גזירה הסלולר'מעורבים' גבולות באופן יעיל על ידי הגבלת זרימת מסלול בתוך צלחת תרבות עגולה לפריפריה באמצעות המיקום של טבעת פנימית. הקמה וההפעלה של הטבעת הגזירה הוא פשוט וחסכוני, וניתן לשנותם בקלות להכיל מגוון רחב של שייקר מסלולית משימוש בחומרים מתכלים בתרבית רקמה נפוצה. זה מודל יכול להיות מיושם בניסויי תא האנדותל לספק תבניות זרימה חד כיווני ותקופתיות בתוך הרמות פיסיולוגיות pathophysiological.

פרוטוקול

1. בנייה של 150 מ"מ קוטר שאר הטבעות (איור 1)

הערה: טבעות Shear ניתן להקים כדי ליצור מאפיינים שונים על ידי שינוי הגדל בצלחת פטרי החיצונית ופנימי, וכתוצאה מכך מכשירים בעלי שטח פנים הכולל שונה, תשואות תא ופתח טווחי כוחות גזירה. דו"ח זה מתאר צלחת 150 מ"מ בשילוב עם צלחת 100 מ"מ פנימית עבור שטח כולל של 98 ס"מ ² (איור 2).

איור 1. גזירת טבעת הרכבה. החלק העליון של האיור מציגה טבעת גזירה בהרכבה חלקית. להזריק 0.5 מיליליטר של מתילן כלוריד דרך חור 3 מ"מ עם pipet העברה אם חותם חזק לא נוצר לחלוטין בין המנות הפנימיות וחיצוניות. הטבעת הגזירה היא חתום לסגור ידי החלת חרוז 1 מ"מ עובי של דבק גומי סיליקון סביב EDG הפנימידואר של העליון טבעת גזירה. החלק התחתון של האיור מציג את טבעת הגזירה התאספה. הכחול מייצג את האזור של תאי אנדותל מצופים. החיצים האדומים החיצוניים ופנימיים לציין את התנועה הסיבובית של טבעת הגזירה ומדיה בתוך הטבעת הגזירה כאשר הניחו על שייקר מסלולית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. מדידות שטחי טבעת גזירה 150 מ"מ (נמשך לא בקנה מידה). הפאנל למעלה מראה הסטה צנטריפוגלי של נוזל לכיוון הטבעת החיצונית בתגובה סיבוב מסלולית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. יצירת תבנית בניית טבעת גזירה על ידי יצירה150 מ"מ פרופיל הקצה החיצוני בתוכנה מצגת בקוטר 100 מ"מ פנימית להציב במרכז המעגל 150 מ"מ. הדפס את התבנית על גיליון נייר לבן A4.
2. Pipet 10 מ"ל של מתילן כלוריד (dichloromethane) לתוך צלחת 150 מ"מ זכוכית פטרי. זה קריטי, כי המנה היא זכוכית ולא קלקר (או פלסטיק ויניל אחר), כמו מתילן כלוריד solubilizes ביותר הפלסטיק והוא משמש כאן כדי להצטרף רכיבי פלסטיק.
   זהירות: כפפות לשימוש לכל הבנייה עם אוורור ברדס נאות. מתילן כלוריד הוא גורם האלרגיה והוא hepatotoxic.
3. יישר צלחת 150 מ"מ פטרי מפלסטיק על תבנית טבעת גזירה החיצונית.
4. לקדוח חור 3 מ"מ במרכז צלחת 100 מ"מ באמצעות כלי רוטרי. הסר את כל שבבי פלסטיק המופק בקידוח.
5. תוך כדי לחיצה עם יד בכפפה, להפוך וטובלים את הקצה העליון של צלחת פטרי 100 מ"מ מהשלב הקודם לתוך הבריכה של מתילן כלוריד במשך כ 3 שניות.
6. עָבָרfer את "רטוב" קצה-למטה צלחת 100 מ"מימ על גבי במרכז צלחת 150 מ"מ, בזהירות יישור צלחת 100 מ"מימ על התבנית הניכרת. כלוריד מתילן יהיה למזג את הפלסטיק, שהצטרף מנות 100 מ"מ ו -150 מ"מ. בעדינות לסובב את כיוון השעון צלחת 100 מ"מ נגד כמה פעמים כדי להבטיח הידבקות טובה כדי בצלחת 150 מ"מ.
   הערה: להקדיש תשומת לב רבה כדי להבטיח יישור נכון של המנה הפנימית אל מרכז הצלחת החיצונית. יישור אקסצנטרי עשוי ליצור הגירסות של מאמץ הגזירה במקומות שונים בזירת הגזירה. תשמור על עצמך כדי לא לאפשר מתילן כלוריד לטפטף בשוגג על חלק המסלול החיצוני של צלחת פטרי 150 מ"מ במהלך המיקום של מנת 100 מ"מימ. זה יתמוסס הפלסטיק על המשטח התחתון שבו תא יהיה גדל, יצירת משטח אחיד שעשויות לגרום להפרעות בזרימה.
7. לאחר מתילן כלוריד התייבש, להעיף את צלחות פטרי כבול לאחרונה שוב בזהירות לבדוק את נקודות המגע על מנת להבטיח כיחותם חזק כבר נוצר בין שתי צלחות פטרי.
8. אם חותם חזק לא נוצר לחלוטין, להזריק 0.5 מיליליטר של מתילן כלוריד דרך חור 3 מ"מ עם העברת pipet. תרימי את המנה בעדינות לסובב אותו כדי לאפשר מתילן כלוריד להגיע לקצה.
   הערה: אם מסובב מהר מדי, מתילן כלוריד יכול לשפוך לתוך החלק החיצוני של מנת 150 מ"מ, לעוות את פני השטח שבו תאים יגדלו הורס את הטבעת הגזירה. טבעות גזירה דולפות אמורות להיות מושלכות.
9. תאטמו את החור בצלחת 100 מ"מ על ידי החלת חרוז 3 מ"מ של חומר איטום גומי סיליקון.
10. באמצעות כלי רוטרי מצויד עם ראש חיתוך שטוח, לחתוך את החלק העליון ס"מ 3 של צינור בתרבית רקמה פוליסטירן 15 מ"ל חרוטי, משאיר לפחות 1 ס"מ של הצינור מתחת לכובע. ללטש את הקצה של הצינור לחתוך עד שתערובת חלקה ושטוח באמצעות הצד השטוח של ראש החיתוך. הסר את כל שבבי פלסטיק המיוצרים על ידי שחיקה.
11. עקוב אחר מנותק 15 מיליליטר צינור חרוטים עלהמכסה של צלחת 150 מ"מ עם סמן, במרחק של כ -0.5 ס"מ מהקצה של המנה. לקדוח חור בתוך המעגל נמשך, משאיר מרווח כ 1-2 מ"מ מהקצה של המעגל.
12. הנח את החלק עליון צינור חרוטים המנותק מעל חור הקדח. באמצעות העברה pipet, להחיל כ 250 μl של מתילן כלוריד עד קצות לנתק של צינור חרוטי לחייב את צינור חרוטי על המכסה 150 מ"מ.
13. חותם את מכסת 150 מ"מ על צלחת 150 מ"מ על ידי החלת חרוז 1 מ"מ עובי של חומר איטום גומי סיליקון מסביב לקצה הפנימי של צלחת פטרי העליונה.

2. עיקור של טבעות Shear

1. Pipet כ 10 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים לזירה גזירה שהוקמה זה עתה דרך יציאת צינור חרוטי 15 מ"ל. מערבולת סביב כדי להסיר כל פסולת בתוך הטבעת הגזירה. הסר את בופר פוספט עם aspirator pipet / ואקום פסטר.
2. חזור על השלב הקודם עד פסולת מוסר.
3. כדי SteriLize הטבעת הגזירה, להשתמש בשילוב של שטיפת אתנול 70% עם קרינת UV.
   1. פתחו את מכסה מאוורר, pipet כ 10 מ"ל של אתנול 70% דרך יציאת גישה, ואת שוב את המכסה על. לסובב ולהפוך מעל מספר פעמי טבעת גזירה, להבטיח כי החלק הפנימי של הטבעת הגזירה הוא שטף ביסודיות.
   2. מתחת למכסה מנוע קטר, לשאוב את אתנול 70% עודפים. עם בקבוק תרסיס, ביסודיות לרסס את יציאת כובע וגישה עם אתנול 70%.
   3. מניחים את הטבעת גזירה כובע תחת קרינת UV בתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה עד יבש לחלוטין.
4. לאחר יבש, שוב את המכסה על וטבעות גזירה מעוקר ולאחסן בטמפרטורת החדר עד בשימוש בציפוי תרבית תאים.

3. מחקרים מתח שאר

1. פלייט לתאי אנדותל טבעות גזירה מעוקרת בעקבות פרוטוקול תרבית תאים הסטנדרטי בדרך כלל באמצעות יחס של 1: 4 פיצול לקווי תא האנדותל טרנספורמציה.
   הערה: microv רשתית העכברושתאי אנדותל ascular התקבלו מסחרי. תאי המוח אנושיים האנדותל (hCMEC / D3) תאים נמסרו במתנה נדיבה של ד"ר הפיר-אוליבר Couraud (INSERM, צרפת) והיו בתרבית בינוני בסיס אנדותל מלא (EBM).
2. אפשר תרבויות מגיעות למפגש לפני תחילת לימודי זרימה. השתמש 30 מיליליטר של תקשורת בתרבית הרקמה (10% נסיוב עגל עוברי, בינוני של הנשר השונה של Dulbecco עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין / amphotericin). השנה בינוני תרבית תאים כל 3 ימים ולשמור תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 7.5% CO ₂ ואוויר 92.5% בחדר.
3. מניחים את שייקר מסלולית בחממה.
   הערה: שייקרים Orbital הם בדרך כלל כבדים (> 10 ק"ג). מניחים את שייקר מסלולית במדף התחתון של החממה כדי למזער מתח המדף ורעידות.
4. מניח את טבעות גזירה הניסיוניות על שייקר מסלולית. מניחים טבעות גזירה בקבוצת הביקורת סטטיים בתוך אותה חממה.
5. להעריך את מאמץ הגזירה המרבי בתוך shעגיל עם המשוואה איפה הוא רדיוס הסיבוב של שייקר מסלולית (בס"מ), הוא הצמיגות של המדיום (ב שלווה), היא הצפיפות של המדיום (ב מיליליטר g /), ו תדירות הסיבוב היא (ברוטציה / sec) ^24.
6. ליזום את גדרות סיבוב על שייקר מסלולית אל סל"ד הרצוי (למשל, 90 סל"ד), עוזב את טבעות גזירה על שייקר למשך הרצוי של יישום מאמץ גזירה (למשל, 72 שעות).
   הערה: שייקרים Orbital יכולים לייצר חום, כך הטמפרטורה בחממה צריכה להיות במעקב בתחילה על מנת להבטיח 37 ° C נשמר לאורך כל תקופת הניסוי. לחלופין, sטבעות לשמוע ניתן להעביר לתאים סביבתיים (למשל, תא חממת מודולרי) ולאחר מכן הניחו בתוך חממה מסתובבת.
7. אחרי שכבות תאים שנחשפו גזירה עבור משך הזמן הרצוי, להסיר טבעות גזירה מן החממה. משוך את מכסת טבעת הגזירה ולאחזר תאים ו / או תקשורת לבחינת סיום רצוי מנתח (למשל, מערבי סופג, מיון תא מופעל קרינה, וכו ') ^25.

תוצאות

כאן אנו מציגים תוצאות נציג משני תאים hCMEC / D3 המוח האנדותל monolayers תאים ברשתית עכברוש אנדותל כלי הדם, בתרבית טבעות גזירה.

לאחר המאפשר monolayers תא hCMEC / D3 המוח אנדותל לגדול מפגש ב EBM המלא, הטבעות הגזירה הונחו על שייקר מסלולית במשך 72 שעות. באמצעות המשוואה משלבת 3.5, מחושב מאמץ גזירה מקסימאלי

דיון

בניית מערכת הטבעות הגזירה על חשיפת תאי אנדותל גזירה היא גישה פשוטה לביצוע מחקרי מאמץ גזירה. אף על פי כן, ישנם מספר צעדים אשר הם קריטיים עבור קבלת טבעות גזירה מעולות תוצאות טובות יותר. חותם שלם צריך להיעשות בין הטבעת הפנימית וחיצונית כדי למנוע מחומרים מ דולף אשר יכול ליצור מתח גזירה לא עקבי בין דגימות. אם חותם שלם לא נעשה, כמות מזערית של מתילן כלוריד יש להוסיף הקצה שבין הצלחת הפנימית וחיצונית עם העברת pipet דרך חור הטבעת הפנימית. בעדינות לסובב את הטבעת צריכה לאפשר את מתילן כלוריד כ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100 x 20 מ"מ צלחת תרבית רקמות פלסטיות	קורנינג	430167	הכלים חייבים להיות פוליסטירן
150 x 25 מ"מ צלחת תרבית רקמות פלסטיות	קורנינג	430599	הכלים חייבים להיות פוליסטירן
150 מ"מ זכוכית צלחת פטרי	פישר	3160150BO
15 מ"ל תרבית רקמות פוליסטירן צינורות פלסטיק	פלקון	352099
מתילן כלוריד	Sigma-Aldrich	D65100
איטום גומי סיליקון	DAP	7079808641
אתנול	Decon	2701
3 מ"ל העברת פיפטה	Becton-Dickinson	357524
מדפסת
נייר מספריים
כפפות
כלי סיבובי וסט	Dremel	4000-6/50
ראש חיתוך כלי סיבובי	Dremel	EZ476
ראש מקדחה
שייקר מים
חממה
	תאים ביולוגיים	RA-6065

כלי סיבובי מזוקקים VWR 57018-754 חולדה תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית