JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo

Full Text

17,083 Views

13:36 min

December 30, 2009

DOI: 10.3791/1687-v

Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine,Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

מיפוי גנטי הגורל ועין מתנהלת (GIFM) סימני עקבות תאים עם שליטה במרחב ובזמן קנס

Transcript

מפות גורל נוצרות על ידי סימון ומעקב אחר תאים in vivo כדי לקבוע כיצד אבות תורמים למבנים וסוגי תאים ספציפיים ברקמה מתפתחת ובוגרת. והתקדמות בתפיסה זו היא מיפוי גורל הניתן להשראה גנטית או GIFM המקשר בין ביטוי גנים סולפט והתנהגויות תאים in vivo כדי ליצור מפות גורל המבוססות על שושלת גנטית. היי, שמי דבורה אליסור ממעבדת מארק סרוויסס והמחלקה לביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה של התא וביוכימיה באוניברסיטת בראון.

היום עמיתיי אשלי בראון, ליז נורמן נין האגן, סטיב בראון ואני נדגים הליך למיפוי גורל גנטי. אנו משתמשים בהליך הזה במעבדה כדי לחקור התפתחות מוחית מוקדמת. אנו יכולים ליישם את הטכניקה הזו גם במחקרי השבתת גנים ובמודלים של מחלות אנושיות בבעלי חיים.

אז בואו נתחיל ב-X cre, E-R-M-G-F-P. MGFP LAE הוא אלל מדווח הקיים בכל התאים המיוצג על ידי אליפסות אפורות X cre, er, כאשר X מייצג אלמנטים מווסתים של גנים. שליטה בביטוי C ER מוגבלת מרחבית לתחום הביטוי של גן X המוצג בכחול וחלבון CRE ER מבודד בציטופלזמה על ידי HSP 90.

בהיעדר טמוקסיפן, המדווח יהיה כבוי. מתן טמוקסיפן מביא לתאים ממופים גורל בתחום X מכיוון ש-CER משתחרר מ-HSP 90 עובר לגרעין ומסיר את קלטת העצירה מהאלל המדווח. רקומבינציה קבועה ותורשתית מבטיחה שהתאים מבטאים באופן מהותי MG FP LA Z. השילוב של אלל מדווח CER וטמוקסיפן מביא לסימון כאשר אוכלוסיית תאים מסומנת לראשונה באזור מוח קדמון של העובר על סמך ביטוי גנים, תאים ממופים גורל אלה נמצאים במעקב גם לאחר כיבוי ביטוי הגנים הראשוני המשמש להנעת CER.

בדרך זו. ניתן לזהות את התפוצה הסופית ואת הגורל הסופי של שושלת תאים מוגדרת גנטית אצל הבוגר. הליך זה מתחיל בהכנת תמיסת גבעול של 20 מיליגרם למיליליטר של טמוקסיפן הממיסים 200 מיליגרם של הטמוקסיפן ב-10 מיליליטר שמן תירס לפני המלחמה בבקבוקון שאיפת זכוכית.

לאחר מכן דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים על מערבולת טטור. התמיסה מגנה לסירוגין על תמיסת מלאי הטמוקסיפן המוכנה מפני אור על ידי עטיפת הבקבוקון בנייר כסף ומאוחסנת בארבע מעלות צלזיוס. ניתן להשתמש במלאי עד חודש.

לניסויי מיפוי גורל, קבע זוג רבייה המורכב מנקבת וובסטר שוויצרית מסוג בר וזכר הנושא גם אלל CreER ספציפי לגן וגם אלל מדווח. לצורך הדגמה זו, נשתמש בניצחון לזכר CreER MG FP אחד. בדוק את נקבת וובסטר השוויצרית בכל בוקר למראה של פקק נרתיקי.

ייעד את בוקר היום של פקק הנרתיק כפי שנראה כ-0.5 ימים לאחר הקוטוס וחשב את תאריך מתן הטמוקסיפן. בהתבסס על נקודת התחלה זו בניסוי זה, טמוקסיפן יינתן ביום העוברי 8.5. בעזרת מזרק מיליליטר אחד עם מחט האכלה לבעלי חיים, צייר 200 מיקרוליטר מתמיסת גבעול הטמוקסיפן.

רסנו בחוזקה את נקבת וובסטר השוויצרית ההרה המתוזמנת על ידי אחיזת תנומת הצוואר והגב כדי לשתק את הראש ולהפוך את העכבר כך שהצד הגחוני פונה כלפי מעלה. החזק את הזנב בין האצבעות החופשיות כדי לשמור על הגוף בקו ישר. לאחר מכן, הנח את מחט ההזנה בזווית הפה והנח בעדינות את המחט במקביל לגג הפה עד שקצה מחט ההזנה נמצא בערך במיקום העין.

הטה בעדינות את הראש לאחור כדי לקבל גישה לוושט. הנח את המחט מעבר לאפיגלוטיס ובמורד הוושט לכיוון הקיבה. היזהר לא להיכנס לקנה הנשימה.

ברגע שמחט ההזנה נמצאת בקיבה, יש לתת את הטמוקסיפן ולהוציא את המחט. לאחר מכן החזירו את הנקבה לכלוב הבית שלה עד למועד הנתיחה. בתאריך הנתיחה, עוברי E 12.5 מהנקבה ההרה המתוזמנת מנותחים חופשיים ולאחר מכן מוערכים לסימון GFP.

בעובר חיובי ל-GFP, אנו רואים שתאי עצב שמקורם ברוח אחת תורמים למוח האמצעי, למוח האחורי ולחוט השדרה. כתב MG FP מסמן הקרנות אקסונליות, שניתן לראות גם מעבירות עוברים חיוביים ל-GFP על ידי הרכבה ביתית לצלחת פטרי המכילה PPS ומצלמות אותם באמצעות מסגרת תמונה לאחר צילום העוברים, השתמשו במלקחיים כדי לצבוט חתיכת זנב קטנה מכל עובר ולהניח כל חתיכה בצינור PCR. הרקמות יעברו גנוטיפ באמצעות PCR עבור שני האללים כדי לאשר תוצאות שנראו באמצעות ניתוח הר שלם.

ההליכים הבאים מאפשרים לנו לנתח כיצד התאים המסומנים שמקורם באזורים עובריים מאכלסים את המוח הבוגר לפני תחילת הגולגולת. אושר על ידי צביטה בבוהן שהעכבר הוא איננו לחלוטין. ה-ized עם nembutal מבצעים חתכים כדי לקבל גישה ללב דרך כלוב הצלעות.

לאחר מכן, הנח מחט פרפר לתוך הקודקוד או החדר השמאלי של הלב ואבטח בעזרת C clamp. צור אתר יציאת נוזלים באטריום הימני בעזרת מספריים, ולאחר מכן העבר 10 עד 15 מיליליטר של מי מלח קרים כקרח עד שהנוזל צלול. ואחריו 20 עד 25 מיליליטר של 4% אלדהיד פרפורם.

לאחר השלמת השפע התוך לבבי, הסר את הראש במספריים על ידי חיתוך עמוד השדרה ממש מעל הכתפיים. העבירו אזמל לאורך קו האמצע הגבי של הראש, rostral de cottle כדי לחתוך את הקרקפת ולחשוף את גולגולת ה-S. בעזרת האזמל, מגרדים את כל הרקמות או השרירים העודפים לאורך הצד והחלק האחורי של הגולגולת.

בעזרת מלקחיים, נקב את הגולגולת בקו האמצע, רק רוסטרל לנורות הריח וצור חור קטן כדי להכיל את קצות המספריים העדינים. הכנס את המספריים העדינים לחור זה וכדי לבצע שני חתכים דו-צדדיים מקו האמצע בעקבות אורך נורות הריח. חתך זה ישבור את הגולגולת בצומת עצם האף והעצם הקדמית ויספק גישה טובה למספריים.

חותכים לאורך התפרים הסגיטליים בגולגולת, מקפידים לשמור על קצות המספריים בזווית הרחק מהמוח כדי למנוע פגיעה ברקמה הבסיסית. לאחר מכן, תפסו בעדינות את הגולגולת בעזרת מלקחיים וקילפו את העצם לאורך החתך המדיאלי כדי לחשוף את המוח. הגולגולת עלולה להתפצל לחתיכות קטנות או להתפרק בחלקים גדולים יותר.

המשך להשתמש במלקחיים כדי להסיר את כל העצמות הקודקודיות, הבין-קודקודיות והעורפיות. שחרר את ה-para oculi הממוקם לאורך הקצוות הצדדיים של המוח בגובה המוח הקטן על ידי צביטה עדינה של העצמות הכדוריות מכל צד. השתמש במספריים כדי לחתוך בזהירות את החלק הגבי של העצם המקיף את גזע המוח.

הכנס צד אחד של המספריים ממש מתחת לקצה הגבי של העצם, החל מהמקום שבו נחתך חוט השדרה וחתך לכיוון המוח הקטן. לשחרר את גזע המוח והמוח הקטן. הסר את העצם שנותרה מסביב לגזע המוח בעזרת המלקחיים.

משוך בעדינות את העצמות, סובב את הצד הגבי של הראש כלפי מטה והשתמש במלקחיים כדי לנתק את עצבי הגולגולת ולשחרר את המוח מהגולגולת. הניחו את המוח בצלחת פטרי של קרח. PPS קר העריכו את המוח הבוגר לסימון GFP, באמצעות היקף ניתוח פלואורסצנטי וצילום באמצעות מסגרת תמונה.

בדוגמה זו, המוח התיכון מסומן על ידי GFP בנוסף לשימוש בו לניתוח שושלת במהלך האמבריוגנזה וב-GIFM הבוגר ניתן לשלב עם יישומים אחרים הנפוצים בביולוגיה התפתחותית כגון מיקרו-דיסקציה וניסויי השתלת רקמות. לדוגמה, המזנספלון הגחוני הוא אזור האב לפיתוח נוירוני דופמין המבטאים את הגן רוח אחד. לפיכך, בידוד המזנספלון הגחוני על ידי מיקרו דיסקציה מאפשר ליצור הגדרה במבחנה כדי להמשיך לחקור את התפתחותו.

זו רק דוגמה אחת לשימוש ב-GIFM כדי לבודד אזור עניין של אב המוגדר על ידי היסטוריה גנטית. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו את העוברים החיוביים ל-GFP שזוהו בעבר ל-PBS סטרילי קר כקרח בצלחת תרבית תאים באמצעות מספריים עדינים. הסר את חלק הראש של העובר על ידי חיתוך רוחבי מפונק לרומי.

לאחר מכן, הסר את החלק הרוסטרלי של הראש עם חתך עטרה דרך הצפלון. זה יחשוף מבנה דמוי צינור שבו החדר הרביעי דרך השלפוחית המזוצפלית יוצר צינור בין רקמות הגב והגחון. הכנס בזהירות את קצות המספריים לחדר הרביעי וחתוך לאורך קו האמצע הגבי המחובר לרוסטרל ופותח את הצינור במלואו, ויוצר הכנת ספר פתוח.

המזנספלון הגחוני ייחשף כעת מדיאלית. בעוד ששני חצאי הגב של המזנספלון ישכנו לרוחב, ייתכן שיהיה צורך להסיר את כל הרקמה הלא עצבית שנותרה מתחת למזנספלון הגחוני. על מנת שהאקספלן יהיה שטוח, האקספלן צריך כעת להידמות לפרפר שבו ה-mesencephalon הגבי מייצג את הכנפיים והפקקת רק אחת את הזנב.

כדי לבודד עוד יותר את המזנספלון הגחוני לניתוח פקס או ניסויים בתרבית תאים, הסר את ההיבטים הרוחביים של הרקמה. כעת נציג כמה תוצאות מייצגות של GIFM. בניסוי זה, תאים מבטאים WINT אחד המסומנים ל-E 8.5 מוצגים כדי לקבוע כיצד תאים ישירים של wint one תורמים למבנים עצביים לאורך ההתפתחות.

לדוגמה, עוברי C EER MG FP ב-E 12.5, מציגים פלואורסצנטיות GFP בעיקר במוח האמצעי, במוח האחורי האחורי ובחוט השדרה בהגדלה גבוהה, הקרנות עצביות עדינות נראות עצבניות. ניתן גם לדמיין ולנתח את התאים המסומנים בדופן הגוף, הגפה ואזור הפנים של הגולגולת ברמה התאית על ידי אימונוהיסטוכימיה. כפי שמוצג בחתך אופטי בעובי מיקרומטר אחד של עובר E 12.5 המסומן על ידי מתן טמוקסיפן ב-E 8.5, תיוג נוגדני בטא גלקטו גרעיני באדום ותיוג נוגדני GFP בירוק מצביע על תאים ממופים גורל המוצגים במוח התיכון הגחוני.

כאן שילבנו תאים חיוביים כפולים בגלל האופי של מדווח MGFP מותנה במוח הבוגר. צפיפות הרקמה הבוגרת עלולה לטשטש את הקרינה של GFP הנובעת ממבני מוח פנימיים. לכן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הר שלם חושף רק פלואורסצנטיות GFP קלושה ב-CUI העליון של המבוגר המעריך את הזכייה.

שושלת אחת המסומנת ב-E 8.5 בחלקים בוגרים עם מיקרוסקופיה בהגדלה נמוכה מגלה כי שושלת WIN אחת מולידה מבנים במוח האמצעי, כולל ה-cui העליון והנחות. בתמונת הגדלה גבוהה יותר זו שצולמה מהמוח התיכון הגחוני בקרבת נוירונים דופמינרגיים, ניתן לראות תאים חיוביים בטא קאל גרעיניים ומקלעת אקסונלית חיובית עשירה של GFP בסימון ניגודיות ב-E 9.5 מביא לתיוג GFP משמעותי שנצפה בקלות בקולוס התחתון של המוח התיכון על ידי פלואורסצנציה שלמה. שושלת WINT אחת המסומנת ב-E 9.5 בחלקים בוגרים מרוכזת בקאולו התחתון כפי שניתן לראות במיקרוסקופיה בהגדלה נמוכה.

בתמונת הגדלה גבוהה יותר זו שצולמה מהמוח התיכון הגחוני בנוירונים דופמינרגיים, ניתן לראות תאים חיוביים של ג'ל בטא גרעיני ומקלעת אקסונלית חיובית עשירה של GFP. לפיכך, בעוד שניצחון אחד נגזר נוירונים המסומנים ל-E 8.5 לעומת E 9.5 מוגבלים בהדרגה מלתרום למוח האמצעי הגבי. שושלת WIN אחת ממשיכה לתרום למוח התיכון הגחוני.

זה עתה הראינו לכם את הנוהל למיפוי גורל גנטי כדי לסמן ולעקוב אחר שושלות תאים in vivo. זה מאפשר לנו לסמן תאים על סמך השושלת הגנטית שלהם ולעקוב אחריהם לאורך זמן גם לאחר שביטוי הגנים נכחד. עם טמוקסיפן הניתן בגיל שמונה וחצי, הראינו כי תחום אחד תורם להתפתחות המוח התיכון בנוסף לכל המוח התיכון אצל המבוגר.

לעומת זאת, מתן טמוקסיפן בתשע וחצי כאשר תחום השנון הופך מוגבל, מביא לתרומה מוגבלת יותר להתפתחות המוח התיכון במהלך האמבריוגנזה, שנמשכת לתוך המבוגר. כאשר מבצעים הליך זה, חשוב לקחת בחשבון שהמערכת מסמנת תאים, באופן פסיפסי, ולכן לא כל תא במבנה מסוים עשוי להיות מסומן. סביר להניח שזה נובע מקו ה-CRE er או אלל המדווח המותנה שבו נעשה שימוש.

חשוב לציין, למרות שסימון התאים הוא פסיפס, הדפוס וההתפלגות של תאי מאר ניתנים לשחזור רב. מצאנו כי מתן טמוקסיפן על ידי גבאז' דרך הפה הוא יתרון בהשוואה למתן בהזרקה אינטרפריטונאלית מכיוון שהוא ממזער דלקת בחלל הבין-צפקי כמו גם נזק מכני לעוברים. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.

Explore More Videos

לביולוגיה התפתחותית גיליון 34 neurodevelopment גנטיקה ועין מתנהלת מיפוי גנטי גורל (GIFM) immunostaining עכבר העובר GIFM שושלת נותב מיפוי גורל