גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo

מפות גורל (Fate maps) נוצרות על ידי סימון ומעקב אחר תאים in vivo כדי לקבוע כיצד תאי אב תורמים למבנים וסוגי תאים ספציפיים ברקמה מתפתחת וברקמה בוגרת. התקדמות של קונספט זה היא מיפוי גורל גנטי הניתן להשראה או GIFM, המקשר בין ביטוי גנים, מצבים תאיים והתנהגויות תאים in vivo כדי ליצור מפות גורל המבוססות על שושלת גנטית. שלום, שמי דבורה אליסור ממעבדת Mark Services ומחלקת הביולוגיה המולקולרית, הביולוגיה של התא והביוכימיה באוניברסיטת בראון.

היום עמיתיי אשלי בראון, ליז נורמן, נין הייגן, סטיב בראון ואני נדגים פרוצדורה למיפוי גורל גנטי הניתן להשראה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה כדי לחקור את התפתחות המוח המוקדמת. ניתן ליישם טכניקה זו גם במחקרי השבתה של גנים ובמודלים של בעלי חיים למחלות אנוש.

בואו נתחיל. בעוברים מסוג X cre, E-R-M-G-F-P. MGFP LAE הוא אלל רפורטר המצוי בכל התאים, המיוצגים על ידי אליפסות אפורות X cre, er, כאשר X מייצג אלמנטים רגולטוריים של גנים. הבהרה של ביטוי C ER מוגבלת מרחבית לתחום הביטוי של גן X, המוצג בכחול, וחלבון CRE ER מבודד בציטופלזמה על ידי HSP 90.

בהיעדר Tamoxifen, הרפורטר לא יהיה פעיל. מתן Tamoxifen מוביל למיפוי גורל (fate mapping) של תאים בדומיין X, מכיוון ש-CER משתחרר מ-HSP 90, עובר גרעין ומסיר את קסטת העצירה (stop cassette) מאליל הרפורטר. רקומבינציה קבועה ותורשתית מבטיחה שהתאים יבטאו באופן קבוע MG FP LA Z. השילוב של אליל הרפורטר CER ו-tamoxifen מאפשר סימון שבו אוכלוסיית תאים מסומנת תחילה באזור מוח ראשוני של העובר על בסיס ביטוי גנים; תאים אלו, שגורלם מומפה, נחלקים ומעקבבים גם לאחר שביטוי הגן הראשוני ששימש להנעת CER דעך.

בדרך זו, ניתן לזהות בבוגר את ההפצה הסופית ואת הגורל הסופי של שושלת תאים המוגדרת גנטית. הליך זה מתחיל בהכנה של תמיסת גבעול של tamoxifen בריכוז 20 mg/mL; המיסו 200 mg של tamoxifen ב-10 mL של שמן תירס שחומם מראש בתוך בקבוק זכוכית לאינהלציה.

לאחר מכן, דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים באמצעות שייקר מסוג Tator vortex. הגנו על תמיסת ה-Tamoxifen המוכנה מפני אור על ידי עטיפת הבקבוק בנייר אלומיניום ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 °C. ניתן להשתמש בתמיסת המקור למשך עד חודש אחד.

עבור ניסויי מיפוי גורל (fate mapping), הכינו זוג להרביה המורכב מנקבת Swiss Webster מסוג בר (wild type) ומזכר הנושא גם אלל CreER ספציפי לגן וגם אלל דשייר (reporter allele). לצורך הדגמה זו, נשתמש בזכר win to one CreER MG FP. בדקו את נקבת ה-Swiss Webster מדי בוקר כדי לזהות הופעתו של פקק נרתיקי.

הגדירו את בוקר היום בו נראה פקק נרתיקי כ-0.5 ימים לאחר הזיווג וחשבו את מועד מתן ה-Tamoxifen. בהתבסס על נקודת התחלה זו בניסוי, ה-Tamoxifen יינתן ביום עוברי 8.5. באמצעות מזרק של 1 ml עם מחט להזנת בעלי חיים, שאבו 200 µL של תמיסת הסטוק של Tamoxifen.

רסנו בחוזקה את נקבת עכבר ה-Swiss Webster ההרה בנקודת הזמן שנקבעה, על ידי תפיסת עורף הצוואר והגב כדי לקבע את הראש, והפכו את העכבר כך שהצד הבטני פונה כלפי מעלה. החזיקו את הזנב בין האצבעות הפנויות כדי לשמור על הגוף בקו ישר. לאחר מכן, הכניסו את מחט ההאכלה לפינת הפה והובילו אותה בעדינות במקביל לתקרת הפה, עד שקצה מחט ההאכלה יגיע בערך למיקום של העין.

הטה את הראש בעדינות לאחור כדי להשיג גישה לוושט. הובל את המחט מעבר לאפגלוטיס (מכסה הגרון) ומטה בתוך הוושט לכיוון הקיבה. היזהר לא להיכנס לקנה הנשימה.

לאחר שהמחט להזנה נמצאת בקיבה, ניתן את ה-tamoxifen והוצא את המחט. לאחר מכן, החזר את הנקבה לכלוב המגורים שלה עד למועד הניתוח. ביום הניתוח, הוצא את העוברים בשלב E 12.5 מהנקבה ההרה (Timed pregnant female) ובחן אותם כדי לזהות סימון GFP.

בעובר חיובי ל-GFP, אנו מבחינים כי נוירונים הגזורים מ-wind one תורמים לאזור המוח האמצעי, המוח האחורי וחוט השדרה. הדיווח של MG FP מסמן בליטות אקסונליות, שניתן לראותן גם בעוברים חיוביים ל-GFP על ידי העברה של העוברים בשלמותם לצלחת פטרי המכילה PPS וצילומם באמצעות picture frame. לאחר צילום העוברים, השתמשו בפינצטה כדי לקטוע פיסה קטנה מהזנב של כל עובר והניחו כל פיסה במבחורת PCR. הרקמות יעברו גנוטיפיקציה באמצעות PCR עבור שני האללים כדי לאשר את התוצאות שנראו בניתוח העוברים בשלמותם.

הפרוצדורות הבאות מאפשרות לנו לנתח כיצד תאים מסומנים שנגזרים מאזורים עובריים מאכלסים את המוח הבוגר לפני תחילת הקרניאוטומיה. ודאו באמצעות צביטה בבהוז שהעכבר נמצא תחת הרדמה מלאה. לאחר ההרדמה באמצעות nembutal, בצעו חתכים כדי להשיג גישה ללב דרך כלוב הצלעות.

בשלב הבא, הכניסו מחט פרפר לקודקוד הלב או לחדר השמאלי של הלב והדקו אותה באמצעות תפס C. צרו פתח ליציאת נוזלים בעלייה הימנית באמצעות מספריים, ולאחר מכן בצעו פרפוזיה של 10 עד 15 milliliters של סליין קר מאוד עד שהנוזל שיוצא יהיה צלול. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה של 20 עד 25 milliliters של 4%paraform aldehyde.

עם השלמת הפרופוזיה התוך-לבבית, הסר את הראש באמצעות מספריים על ידי חיתוך של עמוד השדרה ממש מעל הכתפיים. העבר סכין מנתחים לאורך קו האמצע הגבי של הראש, בכיוון רוסטרלי, כדי לחתוך את הקרקפת ולחשוף את הגולגולת. בעזרת סכין המנתחים, גרד כל רקמה או שריר עודפים מצדי הגולגולת ומחלקו האחורי.

בעזרת פינצטה, נקב את הגולגולת בקו האמצע, ממש רוסטרלית לפחוסים הריחניים (olfactory bulbs), וצור חור קטן שיאפשר את הכנסת קצותיהן של מספריים עדינים. הכנס את המספריים העדינים לחור זה ובצע שתי חתכים בילטרליים מקו האמצע לאורך הפחוסים הריחניים. חיתוך זה ישבור את הגולגולת בנקודת המפגש בין עצם האף לעצם המצח ויאפשר גישה טובה למספריים.

גזרו לאורך התפרים הסגיטליים (sagittal sutures) בגולגולת, תוך הקפדה על כך שקצות המספריים יהיו מוטים הרחק מהמוח כדי למנוע פגיעה ברקמה שמתחתיהם. לאחר מכן, אחזו בעדינות את הגולגולת באמצעות פינצטה וקלפו את העצם לאורך החתך המדיאלי כדי לחשוף את המוח. הגולגולת עשויה להישבר לרסיסים קטנים או להתנתק בחלקים גדולים יותר.

המשך להשתמש בפינצטה כדי להסיר את כל עצמות המצח, העצמות הפריאטליות, העצמות האינטר-פריאטליות ועצמות העורף. שחרר את ה-para oculi הממוקמים לאורך הקצוות הלטראליים של המוח בגובה המוחון, על ידי צביטה עדינה של העצמות הכדוריות בכל צד. השתמש במספריים כדי לחתוך בזהירות את החלק הדורסלי של העצם המקיפה את גזע המוח.

החדירו צד אחד של המספריים ממש מתחת לקצה הגבי (dorsal) של העצם, החל מהנקודה שבה נחתך חוט השדרה, וגזרו לכיוון המוחון. זאת כדי לשחרר את גזע המוח ואת המוחון. הסירו את שארית העצם מסביב לגזע המוח בעזרת פינצטה.

הרחיקו בעדינות את העצמות, הפכו את הראש כך שהצד הגבי (dorsal) פונה כלפי מטה, והשתמשו בפינצטה כדי לנתק את העצבים הגולגולתיים ולשחרר את המוח מהגולגולת. הניחו את המוח בצלחת פטרי עם קרח. Cold PPS בחנו את מוח הבוגר לאיתור סימון GFP, באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי, וצלמו באמצעות מסגרת תמונה.

בדוגמה זו, המוח האמצעי מסומן באמצעות GFP בנוסף לשימוש ב-GFP לצורך ניתוח שושלות תאים במהלך העובר; בבגרות, GIFM ניתן לשלב עם יישומים אחרים הנפוצים בביולוגיה התפתחותית, כגון מיקרו-דיסקציה וניסויי תרביות רקמה (tissue explant). לדוגמה, המזנצפאלון הוונטרלי (ventral mesencephalon) הוא אזור התאיים הקדמונים עבור נוירונים דופמינרגיים מתפתחים המבטאים את הגן wind one. לכן, בידוד המזנצפאלון הוונטרלי באמצעות מיקרו-דיסקציה מאפשר להקים מערך in vitro כדי לחקור את התפתחותו באופן מעמיק יותר.

זהו דוגמה אחת בלבד לשימוש ב-GIFM כדי לבודד אזור פרוגניטור (progenitor zone) רלוונטי המוגדר על ידי היסטוריה גנטית. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו את העובריים החיוביים ל-GFP שזוהו קודם לכן ל-PBS סטרילי קר במיסבך (cell culture dish) באמצעות מספריים עדינים. הסירו את חלק הראש של העובר על ידי חיתוך רוחבי.

בשלב הבא, הסר את החלק הרוסטרלי של הראש באמצעות חיתוך קורונלי דרך ה-cephalon. פעולה זו תחשוף מבנה דמוי צינור, שבו הרקע של המערך מהחדר הרביעי דרך ה-mesocephalic vesicle יוצר תעלה בין הרקמות הדורסליות לוונטרליות. הכנס בזהירות את קצות המספריים לתוך החדר הרביעי וגזור לאורך קו האמצע הדורסלי לכיוון הרוסטרלי עד לפתיחה מלאה של הצינור, ליצירת דגימה במבנה של "ספר פתוח".

כעת נחשוף את המזנצפאלון (mesencephalon) הוונטרלי מדיאלית. בעוד ששני החצאים הדורסליים של המזנצפאלון יישארו לטרלית, ייתכן שיהיה צורך להסיר כל רקמה לא-עצבית שנותרה מתחת למזנצפאלון הוונטרלי. כדי שהדגימה המופרדת (explan) תשכב בצורה שטוחה, היא צריכה להיראות כעת כפרפר, שבו המזנצפאלון הדורסלי מייצג את הכנפיים והתרומבומרה (thrombomere) אחת מייצגת את הזנב.

על מנת לבודד עוד יותר את המיזנצפאלון הוונטרלי (ventral mesencephalon) לצורך אנליזת fax או ניסויי תרבית תאים, הסר את ההיבטים הלטרליים של הרקמה. כעת נציג מספר תוצאות מייצגות של GIFM. בניסוי זה, תאים המבטאים WINT one המסומנים ב-E 8.5 מוצגים ויזואלית כדי לקבוע כיצד תאי wint one תורמים למבנים עצביים לאורך ההתפתחות.

לדוגמה, עוברים מסוג wint one C EER MG FP בשלב E 12.5 מפגינים פלואורסצנציית GFP בעיקר במדבנה, בחלק האחורי של המוח האחורי ובחוט השדרה; בהגדלה גבוהה ניתן לראות שלוחות עצביות עדינות המעצבבות את גוף המדבנה, את דופן הגוף, את הגפה ואת האזור הקרניו-פציאלי. ניתן להדגים ולנתח תאים מסומנים גם ברמה התאית באמצעות אימונוהיסטוכימיה. כפי שמוצג בחתך אופטי בעובי one micrometer של עובר בשלב E 12.5 שסומן באמצעות מתן Tamoxifen בשלב E 8.5, סימון נוגדן beta galacto גרעיני באדום וסימון נוגדן GFP בירוק מצביעים על תאים שמופתה גורלם (fate mapped) המוצגים בחלק הוונטרלי של המדבנה.

במקרה זה, התאים המשולבים הם כפולי-חיוביים בשל אופיו של ה-MGFP reporter המותנה במוח הבוגר. צפיפות הרקמה הבשלה עלולה להסתיר פלואורסצנציית GFP הנובעת ממבנים פנימיים במוח. לפיכך, מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של דגימה שלמה (whole mount) חושפת רק פלואורסצנציית GFP חלשה ב-CUI העליון של הבוגר המעריכה את הניצחון.

שושלת אחת שסומנה ב-E 8.5 בחתכים של מבוגרים באמצעות מיקרוסקופיה בהגדלה נמוכה מגלה כי שושלת WIN one נותנת מקור למבני מוח ביניים, כולל ה-superior וה-inferior cui. בתמונה זו בהגדלה גבוהה יותר, שצולמה מהמוח הביניים הגבאי (ventral midbrain) בסביבת נוירונים דופמינרגיים, ניתן לראות תאים חיוביים ל-nuclear beta cal ופלקסוס אקסונלי עשיר וחיובי ל-GFP; בניגוד לכך, סימון ב-E 9.5 מביא לסימון GFP משמעותי הנצפה בקלות ב-inferior colus של מוח הביניים באמצעות פלואורסצנציה של דגימה שלמה (whole mount). שושלת WINT one שסומנה ב-E 9.5 בחתכים של מבוגרים מרוכזת ב-inferior kaulu, כפי שנראה במיקרוסקופיה בהגדלה נמוכה.

בתמונה זו בהגדלה גבוהה יותר, שצולמה מהמידבריין הוונטרלי (ventral midbrain) של נוירונים דופמינרגיים, ניתן לראות תאים חיוביים ל-nuclear beta gel ופלקסוס אקסוני עשיר וחיובי ל-GFP. לפיכך, בעוד שנוירונים נגזרים מ-win one שסומנו ב-E 8.5 לעומת E 9.5 מוגבלים באופן פרוגרסיבי מתרומתם למידבריין הדורסלי (dorsal midbrain), שושלת ה-WIN one ממשיכה לתרום למידבריין הוונטרלי.

הרגע הצגנו בפניכם את הפרוצדורה למיפוי גורל גנטי הניתן להשראה (genetic inducible fate mapping) לצורך סימון ומעקב אחר שורות תאים in vivo. שיטה זו מאפשרת לנו לסמן תאים על בסיס השושלת הגנטית שלהם ולעקוב אחריהם לאורך זמן, גם לאחר שביטוי הגנים פסק. באמצעות מתן טמוקסיפן בשבוע שמונה וחצי, הראינו שהדומיין wit 1 תורם להתפתחות המוח האמצעי, בנוסף לכל המוח האמצעי בבגרות.

לעומת זאת, מתן tamoxifen ביום תשעה וחצי, כאשר הדומיין של wit one הופך להיות מוגבל, מביא לתרומה מוגבלת יותר למוח האמצעי המתפתח במהלך העוברולוגיה, אשר נשמרת גם בבגרות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לקחת בחשבון שהמערכת מסמנת תאים באופן פסיפסי (mosaically), ולכן לא כל תא במבנה מסוים עשוי להיות מסומן. הדבר נובע ככל הנראה מקו ה-CRE er או מאלל הדיווח המותנה שבו נעשה שימוש.

חשוב לציין כי למרות שסימון התאים הוא פסיפס (mosaic), התבנית וההפצה של תאי ה-mar הן בעלות הדירות גבוהה. מצאנו כי מתן טמוקסיפן באמצעות זריקה פומית (oral gavage) הוא יתרוני בהשוואה למתן באמצעות זריקה תוצפרית (Interperitoneal injection), מכיוון שהוא ממזער דלקת בחלל התוצפרי וכן נזק מכני לעוברי. וזהו זה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.