ייצור של מיקרו-רקמות באמצעות מודולים של קולגן ג'ל התאים המכילים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיק רקמות מיקרו-מודולריות שניתן להשתמש בהן לניסויי הנדסת רקמות. זאת מושג תחילה על ידי שאיבת תמיסת קולגן לתוך צינור פוליאתילן באמצעות מזרק, ולאחר מכן ג'ילציה של הקולגן. השלב השני הוא חיתוך צינור הפוליאתילן למקטעים באורך של שני מילימטרים כדי ליצור את מודולי רקמות המיקרו.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הפרדת המודולים מהצינורות, ולבסוף, המודולים מצופים בתאים אנדותליאליים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש ברקמות המיקרו שנוצרו עבור בדיקות תאיות in vitro כדי לחקור את האינטראקציה בין תאים באמצעות תא מיקרופלואידי. בנוסף, ניתן להשתיל את רקמות המיקרו כדי ליצור רקמות למחקר של האינטראקציה וההסתננה מחדש (remodeling) של רקמות המיקרו in vivo.

שלום, שמי ברנדן לונג ממעבדת Sepan כאן באוניברסיטת טורונטו. מכשול מרכזי ביצירת תחליפי רקמה תלת-ממדיים גדולים הוא היעדר וסקולריזציה מהירה לאחר השתלה. בסרטון זה, נראה לכם כיצד ליצור רקמה מודולרית מצופה בתאים אנדותליאליים כדי לסייע בהתגברות על מגבלה זו.

את הפרוצדורה ידגים צ'מברליין, עמית פוסט-אופ מהמעבדה של ספטן. כמות הקולגן שיש לנטרל תלויה באורך צינור הפוליאתילן. בהדגמה זו, נשתמש בצינור פוליאתילן באורך שני מטרים, עם קוטר פנימי של 0.76 millimeter וקוטר חיצוני של 1.22 millimeter.

להכנת הפיתול, השחילו מחט אחת בכיול 20 G לקצה אחד של הפיתול, ולאחר מכן הניחו את הפיתול בתוך שקיית סגירה עצמית (self-heal) של הממיר לצורך עיקור בגז. מכיוון שמיליליטר אחד של קולגן ממלא כשני מטרים של פיתול פוליאתילן, נבצע נטרול למיליליטר אחד של קולגן. העבירו את הקולגן למבחנה קונית של 15 מיליליטר והניחו את המבחנה על קרח.

הוסיפו למבחנה 128 microliters של 10 x alpha, MEM לכל מיליליטר של קולגן וערבבו באמצעות שאיבה ודחיפה חוזרת של התמיסה עם פיפטה. תוך הקפדה על מזעור היווצרות בועות, התמיסה צריכה להפוך לצהובה עם ערבוב ה-alpha MEM לתוך הקולגן המוחמצ. לאחר מכן, נטרלו את הקולגן על ידי הוספת sodium bicarbonate בריכוז 0.8 molar. להערכה כללית של ה-pH, הוסיפו sodium bicarbonate עד שתמיסת הקולגן הצהובה תהפוך לצבע ורוד בהיר.

בדרך כלל נדרשים 30 עד 60 µL לכל מיליליטר קולגן כדי להגיע ל-pH של 7.4. כדי למנוע מהקולגן המנוטרל להגביש, שמרו אותו על קרח עד למועד השימוש. כדי להתחיל את הליך הגבשתו של הקולגן, העבירו את השק המכיל את צינור הפוליאתילן הסטרילי לקליפת בטיחות ביולוגית וחתכו את הקצה האטום של השק תוך השארת הצינור בתוך השק.

השתמשו בפינצטה סטרילית כדי לחבר מזרק של 3 mL למחט בכי মাপ 20 gauge שהוכנסה קודם לכן לקצה אחד של הפחית. הכניסו את הקצה השני של הפחית אל תוך הקולגן המנוטרל עד שהקצה יגיע לתחתית הפפית הקונית, הנשמרת על קרח. את השלב הבא יש לבצע באיטיות, כדי למנוע חדירת בועות אוויר אל תוך הקולגן.

משוך לאט את בוכנת המזרק כדי להעביר את הקולגן לתוך צינור הפוליאתילן. לאחר שהקולגן עבר דרך הצינור, הוצא את המחט (במידה 20) והחזר את שני קצות הצינור אל השקית. לאחר סגירת השקית בעזרת סרט דביק, הדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך 60 דקות.

מכשיר חיתוך מורכב מראש ישמש לחיתוך הצינורית. כדי להתחיל בהליך זה, הניחו את הצינורית במגש סטרילי לפני מכשיר החיתוך והגניבו את הצינורית לתוך מכשיר החיתוך בפתח היציאה שלו, והכינו מבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה 25 מיליליטר של מצע גידול לתאי אנדותל. כדי לאסוף את המודולים החתוכים, הגדירו את מכשיר החיתוך לחיתוך קטעים באורך של שני מילימטר מהצינורית ולאחר מכן חתכו את הצינורית.

דגרו את המודולים החתוכים בתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר בטמפרטורה של 37 °C למשך 60 דקות. כדי להסיר את מודולי הקולגן מהצינורית, בצעו וורטקס למבחנה הקונית בנפח 50 מיליליטר המכילה את המודולים במהירות בינונית. למשך 10 שניות, אפשרו למודול לשקוע לתחתית המבחנה, תהליך שארך כחמש דקות.

משקע רפוי של מודולים ייווצר בתחתית המבחנה, בעוד שהצינוריות יצרו שכבה מעל המדיום. לאחר שהמודולים שקעו, השתמשו בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר עם פיה רחבה כדי להעביר אותם למבחנה קונית של 15 מיליליטר. בצעו ערבוב במערבל Vortex למבחנה הקונית של 15 מיליליטר, ולאחר מכן המתינו ששקיעת המודולים תתרחש פעמיים נוספות.

את המודולים שהשקיעו מהמערבולת השנייה והשלישית מעבירים אף הם למבחנה בנפח 15 מיליליטר. לאחר שכל המודולים הוסרו מהצינוריות ואספו יחד, מעלים את נפח המצע במבחנה לחמישה מיליליטר. המודולים מוכנים כעת לציפוי בתאי אנדותל; בשלב הבא נראה כיצד להכין תאי אנדותל לצורך ציפוי המודולים.

ראשית, הסירו את המצע מהתאים ושטפו באמצעות PBS. לאחר הסרת ה-PBS, הוסיפו שלושה מיליליטרים של trypsin EDTA והדגרימו למשך חמש דקות ב-37 °C. לאחר מכן, השעו את התאים בשבעה מיליליטרים של מצע והעבירו למבחנה בנפח 15 מיליליטר.

ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר; תזדקקו ל-5×10⁶ תאי אנדותל למיליליטר של מודולים דחוסים בתחתית המבחנה הקונית. השקיעו את התאים ב-300 G למשך חמש דקות. השביו את משקע התאים ב-5 milliliters של מצע גידול לתאי אנדותל.

כעת הוסיפו למודולים חמישה מיליליטרים של מצע המכיל תאי אנדותל. המודולים מדגברים עם תאי האנדותל, הן באופן סטטי והן באופן דינמי; עבור דגירה סטטית, ערבבו את המודולים עם תאי האנדותל על ידי היפוך, ולאחר מכן הניחו את המבחנה במצב זקוף בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, הפכו את המבחנה שוב ודגגרו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 15 דקות נוספות.

כדי לדגור את המודולים עם התאים האנדותליאליים באופן דינמי, נערים בעדינות את המבחנה בנפח 15 ml בטמפרטורה של 37 °C למשך 60 דקות. לאחר סיום הדגירה עם התאים האנדותליאליים, מעבירים את המודולים לצלחת שאינה מטופלת לתרבית רקמות (non tissue culture treated plate) ומדגירים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, מעבירים את המודולים לצלחת חדשה שאינה מטופלת לתרבית רקמות עם מצע גידול טרי כדי להסיר תאים אנדותליאליים שלא נצמדו. מדגירים את המודולים המצופים בתאים אנדותליאליים בטמפרטורה של 37 °C עד שהתאים מכסים 100% משטח המודולים.

תהליך זה אורך בדרך כלל כמעט שבעה ימים. המודולים ייראו גליליים כאשר יוצאו לראשונה מהמבחנה. אם הם מצופים בתאים אנדותליאליים, הם עשויים להתכווץ בעד 50% בנפחם ולפתח צורה אליפטית, וכן להפוך לדחוסים ועכורים יותר בבדיקה תחת מיקרוסקופ אור.

בתמונות אלו, קוטרם ואורכם של המודולים מסומנים ב-d וב-l בהתאמה. התמונה הבאה מציגה תאי Hep G two מוטמעים המפוזרים באופן אחיד בתוך המודולים בזמן הייצור. התאים שמרו על חיוניות גבוהה, כפי שמעיד הצבע הירוק של התאים החיים.

תאים מתים יופיעו בצבע אדום כאשר התאים האנדותליאליים יהיו קונפלואנטים. על פני המודולים קיימת התוותה של צמתים הדוקים (tight junctions), שניתן לראות באמצעות אימונופלואורסצנציה. ניתוח מעבר מסה של צביעת VE cadherin הוכיח כי המודולים מסוגלים לתמוך בצפיפויות תאים גבוהות ללא התפתחות של גרעין נמק עקב הובלת חמצן לא מספקת, דבר המהווה לעיתים קרובות בעיה ברקמות גדולות יותר.

בדוגמה זו, צביעת Tri chro של מודולים קטנים טיפוסיים מראה כי המודולים שמרו על התפלגות אחידה וגבוהה של תאים חיים שבעה ימים לאחר הייצור. לעומת זאת, מספר רב של תאים מתים נוצרו בליבת המודולים הגדולים, מה שהותיר רק שוליים דקים של תאים חיוניים. מודולים יוצרו גם עם תערובת של קולגן ופולימר עדין או במכיל מיקרו-ספירות המשחררות תרופה.

כאן, כאשר תאי h hm EC מושבצים על גבי מודולים של קולגן ופולין (palin), המודולים שומרים על צורתם הגלילית ותכונות היצמדות התאים מוגבלות בהשוואה למודולים המורכבים מקולגן בלבד. כאן מוצגת תמונת מיקרוסקופ אור של מודול קולגן המכיל מיקרוספירות מתכלות מבוססות PLGA. מספר בדיקות in vitro הוכחו כתואמות למודולים.

לדוגמה, בבדיקת אנגיוגנזה (angiogenesis assay), ניתן לזהות ולכמת בקלות תצורות דמויות נימיים על גבי מודול המאוכלס בתאי אנדותל לאחר חמישה ימי דגירה עם תאי גזע המופקים מרקמת שומן. בדוגמה אחרת, תמונות מיקרוסקופיה קונפוקאלית של בדיקת חי/מת (live dead assay) על מודולים מראות תאים חיים הצבועים בירוק ותאים מתים הצבועים באדום. לבסוף, המודולים שימשו גם בתאי מיקרופלואידיקה והושתלו בעכברים ובחולדות כדי לחקור את האינטראקציה בין סוגי תאים שונים ואת האופן שבו הרקמות המיקרוסקופיות מעוצבות מחדש על ידי תגובת המארח.

בעקבות הפרוצדורה, ניתן לתרבת את המודולים בצלחת פטרי או בכלי קיבול אחרים כגון ביו-ריאקטור או התקן מיקרופלואידי. ניתן להתאים שיטה זו גם ליצירת רקמות שונות על ידי שימוש בשילובים מגוונים של סוגי תאים או שימוש בצינוריות בעלות קטרים שונים. תודה שצפיתם.