ייצור של מיקרו-רקמות באמצעות מודולים של קולגן ג'ל התאים המכילים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מיקרו רקמות מודולריות שניתן להשתמש בהן לניסויים בהנדסת רקמות. זה מושג תחילה על ידי משיכת תמיסת הקולגן לתוך צינור פוליאתילן, באמצעות מזרק ולאחר מכן ג'ל הקולגן. השלב השני הוא לחתוך את צינורות הפוליאתילן לאורכים של שני מילימטר ליצירת מודולי המיקרו רקמות.

השלב השלישי בהליך הוא הפרדת המודולים מהצינור, ולבסוף, המודולים מצופים בתאי אנדותל. בסופו של דבר, ניתן להשתמש ברקמות המיקרו המתקבלות לבדיקות תאיות במבחנה כדי לחקור את האינטראקציה של תאים באמצעות תא מיקרופלואידי. בנוסף, ניתן להשתיל את רקמות המיקרו ליצירת רקמות לחקר האינטראקציה והעיצוב מחדש של רקמות המיקרו in vivo.

היי, שמי ברנדן לונג ממעבדת ספאן כאן באוניברסיטת טורונטו. מכשול מרכזי ביצירת תחליף רקמה תלת מימדי גדול הוא היעדר כלי דם מהירים לאחר ההשתלה. בסרטון הזה נראה לכם כיצד ליצור רקמה מודולרית שמצופה בתאי אנדותל כדי לעזור להתגבר על המגבלה הזו.

מי שמדגים את ההליך ייחשב על ידי צ'מברליין, עמית לאחר הניתוח ממעבדת ספטין. כמות הקולגן לנטרול תהיה תלויה באורך צינור הפוליאתילן. בהדגמה זו נשתמש בצינור פוליאתילן באורך שני מטר בקוטר פנימי של 0.76 מילימטר וקוטר חיצוני של 1.22 מילימטר.

להכנת הצינור, השחילו מחט אחת של 20 גרם לקצה אחד של הצינור, ולאחר מכן הניחו את הצינור בשקית ממיר לריפוי עצמי לעיקור גז. מכיוון שמיליליטר אחד של קולגן ממלא כשני מטרים של צינורות פוליאתילן, ננטרל מיליליטר אחד של קולגן. הכניסו את הקולגן לתוך שפופרת חרוטית של 15 מיליליטר והשאירו את השפופרת על קרח.

הוסף 128 מיקרוליטר של 10 x אלפא, MEM למיליליטר קולגן לשפופרת וערבב על ידי פיפטינג חוזר ונשנה של התמיסה. כדי להקפיד למזער את יצירת הבועות, התמיסה אמורה להפוך לצהובה כאשר מערבבים את האלפא MEM לתוך הקולגן המחומצן. לאחר מכן, נטרלו את הקולגן על ידי הוספת 0.8 נתרן ביקרבונט מולארי להערכה כללית של ה-pH, הוסיפו נתרן ביקרבונט עד שתמיסת הקולגן הצהובה תהפוך לצבע ורוד בהיר.

בדרך כלל נדרשים 30 עד 60 מיקרוליטר למיליליטר קולגן כדי להשיג pH של 7.4. כדי למנוע מהקולגן המנוטרל להתגבש, שמור אותו על קרח עד שהוא מוכן לשימוש. כדי להתחיל בהליך ג'ל הקולגן, קח את השקית המכילה את צינורות הפוליאתילן המעוקרים לארון בטיחות ביולוגי וחתך את הקצה האטום של השקית תוך שמירה על הצינור בשקית.

השתמש בפינצטה מעוקרת כדי לחבר מזרק של שלושה מיליליטר למחט בגודל 20 שהוכנסה בעבר לקצה אחד של הצינור. הכניסו את הקצה השני של הצינור לתוך הקולגן המנוטרל עד שהקצה נמצא בתחתית הצינור החרוטי, שנשמר על קרח. את השלב הבא אתה צריך לעשות לאט, אחרת אתה מכניס בועות אוויר לקולגן.

החזר את הבוכנה של המזרק לאט כדי למשוך את הקולגן לתוך צינור הפוליאתילן. כאשר הקולגן נמשך דרך הצינור, משוך את המחט בגודל 20 החוצה והחזיר את שני קצוות הצינור לשקית. לאחר סגירת השקית, הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.

מכשיר חיתוך שהורכב מראש ישמש לחיתוך הצינור. כדי להתחיל בהליך זה, הניחו צינורות במגש סטרילי מול מכשיר החיתוך והעמיסו את הצינור למכשיר החיתוך בשקע מכשיר החיתוך, הקימו צינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של מדיה תאי אנדותל. כדי לאסוף את המודולים החתוכים, הגדר את מכשיר החיתוך לחיתוך צינורות באורך של שני מילימטר ואז חתוך את הצינור.

דגרו את המודולים החתוכים בצינור החרוטי של 50 מיליליטר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. להסרת מודולי קולגן מהצינור, מערבולת, הצינור החרוטי בנפח 50 ליטר המכיל את המודולים במהירות בינונית. למשך 10 שניות, הניחו למודול להתיישב בתחתית הצינור, מה שלוקח כחמש דקות.

גלולה רופפת של מודולים תיווצר בתחתית הצינור ואילו הצינור ייצור שכבה על גבי המדיה. לאחר שהמודולים התייצבו, השתמש בפה רחב, פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי להעביר אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. מערבולת, הצינור החרוטי של 15 מיליליטר, ואז לאפשר למודולים להתיישב פעמיים נוספות.

המודולים המיושבים מהמערבולת השנייה והשלישית מועברים גם לצינור 15 מיליליטר. לאחר שכל המודולים הוסרו מהצינור ונאספו, הביאו את נפח המדיה בצינור לחמישה מיליליטר. המודולים מוכנים כעת לציפוי בתאי אנדותל, שיוצגו בהמשך להכנת תאי אנדותל לציפוי המודולים.

ראשית, הסר את המדיה מהתאים ושטוף עם PBS. לאחר הסרת ה-PBS, הוסיפו שלושה מיליליטר של טריפסין EDTA ודגרו במשך חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, החייאה, השעו את התאים בשבעה מיליליטר מדיה והעבירו לצינור של 15 מיליליטר.

ספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו, תצטרכו חמש פעמים 10 עד תאי האנדותל השישי למיליליטר של מודולים ארוזים בתחתית הצינור החרוטי. גלולה את התאים ב -300 גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר של מדיה תאי אנדותל.

כעת הוסף חמישה מיליליטר של מדיה המכילה תאי אנדותל למודולים. המודולים מודגרים עם תאי האנדותל, הן סטטית והן דינמית לדגירה סטטית, מערבבים מודולים עם תאי אנדותל על ידי היפוך, ואז מגדירים את הצינור זקוף על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, הפוך שוב את הצינור ודגירה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות נוספות.

כדי לדגור את המודולים עם תאי האנדותל באופן דינמי, נדנד בעדינות את צינור ה-15 מיליליטר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר השלמת הדגירה עם תאי האנדותל, העבירו את המודולים לצלחת שאינה מטופלת בתרבית רקמה ודגרו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס למחרת, הניחו את המודולים בצלחת חדשה שאינה מטופלת בתרבית רקמה עם מדיה טרייה כדי להסיר תאי אנדותל לא מחוברים. דגירה של מודולים המצופים בתאי אנדותל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מכסים 100% משטח המודולים.

זה בדרך כלל לוקח כשבעה ימים. המודולים ייראו גליליים כאשר הם יוסרו לראשונה מהצינור. אם הם מצופים בתאי אנדותל, הם יכולים להתכווץ עד 50% בנפח ולפתח צורה אליפסה, כמו גם להיות צפופים ואטומים יותר במבט במיקרוסקופ אור.

בתמונות אלה, הקוטר והאורך של המודולים מסומנים על ידי d ו-l בהתאמה. התמונה הבאה מציגה שני תאים משובצים של Hep G המפוזרים באופן אחיד בתוך מודולים בזמן הייצור. התאים שמרו על כדאיות גבוהה כפי שמעיד הצבע הירוק של תאים חיים.

תאים מתים יהיו בצבע אדום כאשר תאי האנדותל מתלכדים. על פני השטח של המודולים, יש היווצרות של צמתים הדוקים, אותם ניתן לראות על ידי אימונופלואורסצנטיות. צביעה של ניתוח העברת מסה של VE cadherin הוכיחה כי מודולים מסוגלים לתמוך בצפיפות תאים גבוהה מבלי לפתח ליבה נמקית עקב הובלת חמצן לא מספקת, שלעתים קרובות בעייתית ברקמות גדולות יותר.

בדוגמה זו, צביעת Massen Tri chro של מודולים קטנים טיפוסיים מראה כי המודולים שמרו על פיזור אחיד וגבוה של תאים חיים שבעה ימים לאחר הייצור. לעומת זאת, מספר רב של תאים מתים נוצרו בתוך ליבת המודולים הגדולים והשאירו רק שפה דקה של תאים ברי קיימא. מודולים יוצרו גם עם תערובת של קולגן ופולימר אינס או המכילים מיקרוספירות מעידות תרופות.

כאן כאשר תאי hm EC אחד יושבים על מודולי קולגן של פאלין, המודולים שומרים על צורתם הגלילית ויש תכונות הצמדה מוגבלות של תאים בהשוואה למודולי קולגן בלבד. תמונה במיקרוסקופ אור של מודול קולגן המכיל מיקרוספירות מתכלות מבוססות PLGA מוצגת כאן. מספר בדיקות מבחנה הוכחו כתואמות למודולים.

לדוגמה, בבדיקת אנגיוגנזה, ניתן לזהות ולכמת בקלות תצורות דמויות נימים במודול היושב עם תאי אנדותל לאחר חמישה ימים של דגירה עם תאי גזע שמקורם בשומן. בדוגמה אחרת, תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של בדיקת מת חי במודולים מציגות תאים חיים מוכתמים בירוק ותאים מתים מוכתמים באדום. לבסוף, מודולים שימשו גם בתאים מיקרופלואידיים והושתלו בעכברים וחולדות כדי לחקור את האינטראקציה בין סוגי תאים שונים וכיצד רקמות המיקרו מעוצבות מחדש על ידי תגובת המארח.

לאחר ההליך, ניתן לתרבת את המודולים בצלחת פטרי או בכלים אחרים כגון ביו-ריאקטור או מכשיר מיקרופלואידי. ניתן להתאים שיטה זו גם ליצירת רקמות שונות על ידי שימוש בשילובים שונים של סוג התא או שימוש בצינורות בקוטר שונה. תודה שצפית.