Name: RNA התערבות קרציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: למד טכניקת RNAi בקרציות באמצעות הזרקת dsRNA לחקר תפקודי גנים ואינטראקציות עם פתוגנים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור ביולוגיה של קרציות ולפתח אסטרטגיות לבקרת מחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לחברי במעבדות שלנו לדיונים פוריים וסיוע טכני. מצגת זו וידאו נתמך על ידי דיקן שותף למחקר מחלקת Pathobiology וטרינרית, מרכז וטרינרי למדעי הבריאות, אוקלהומה סטייט. המחקר מומן על ידי דה Ministerio Ciencia דואר Innovación, ספרד (הפרויקט BFU2008-01244/BMC), פרויקט CSIC עירונית PA1002451 כדי JF, נתרמו ר וולטר Sitlington הקתדרה לחקר בעלי חיים מזון כדי KMK, CVHS 2009 RAC מענק, OAES לבריאות בעלי חיים קרנות USDA, המענק הלאומי לחקר יוזמת תחרותי, מס &#39;2007-04613.

1. דור dsRNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז פריימרים oligonucleotide המכיל רצפים T7 האמרגן עבור ב שעתוק במבחנה סינתזה של dsRNA (לדוגמה, עבור Dermacentor variabilis subolesin להשתמש primers oligonucleotide D8AAT75: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'ו D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3 "). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Amplify גן היעד על ידי RT-PCR באמצעות 10 pmol של פריימר כל oligonucleotide ו 1-10 ננוגרם של רנ"א סך לתקתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצר ה-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז dsRNA באמצעות 8 μL של המוצר מטוהרים PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת dsRNA ידי ספקטרומטריית. </li></ol> 2. הזרקה של קרציות עם dsRNA. 2.1. הכנת קרציות להזרקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לשטוף את קרציות בסדרה של פתרונות על ידי רועדת להם פתרון כל שפופרת 50 מ"ל צנטריפוגה חד פעמיות, decanting הפתרון באמצעות מסך חוט דק רשת מעל הצינור כדי לשמור על קרציות. רצף של פתרונות קרציות הכביסה מי ברז, מי חמצן 3%, שני שוטפת של מים מזוקקים, אתנול 70% ושני שוטף יותר עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם יבש קרציות על מגבות נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן קרציות לקבוצות של 20 עד 50, תלוי בניסוי, המקום קרציות מקבוצה כל כוס פלסטיק 1.25 גרם עם מכסה מתאים בחוזקה תווית עם מספר קבוצת הניסוי. </li></ol> 2.2. סמן צוות ההזרקה. צוות RNAi מורכבת משלושה אנשים: (1) אדם אחד עמדות כל סמן על סרט דביק כפול מודבקת פיסת שעווה שיניים אדום, (2) אדם אחד מזריק את קרציות ו (3) אדם אחד המסכים קרציות לאחר זריקה, נושם CO 2 על קרציות כדי להפעיל אותם וסופר את קרציות החיים לתוך כוסות תווית עם מספר קבוצת הניסוי. כל חברי הצוות חייבים ללבוש כפפות חד פעמיות. 2.3. המיקום של קרציות להזרקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידת סמן באמצעות מלקחיים דומון בסדר למקם אותו בצד הגחון על סרט דביק כפול מודבקת גיליון 3 "x 6" של שעווה שיניים אדום. קרציות ממוקמים יחדיו בקבוצות של 5 קרציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים רצועה קטנה של דבק על גפי כל 5 קרציות כדי לקדם לרסן אותם, אך תוך השארת רוב הגוף חשוף כל כך את תהליך ההזרקה ניתן לצפות על ידי סמן ההזרקה (איור 1). </li></ol> 2.4. הזרקה של קרציות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרציות יהיה להזריק ברבע הימני התחתון של משטח הגחון של שלד חיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לנקב חור שלד באמצעות מזרק אינסולין Monoject מצויד ½ ", 29 מחט מד (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק קרציות מיד עם μL 0.2-0.5 פתרון dsRNA (5 x אוקטובר 10-05 x 10 11 מולקולות לכל μL) באמצעות מזרק מחוייט עם המילטון 1 אינץ, 33 מחט מד עם נקודה 45 ° משופעים (איור 2b) . המחט צריך להיות ממוקם היטב לתוך חלל סמן כדי להבטיח את המיקום ושמירה של dsRNA. נוזל חלק עשוי להימלט מן הזריקה (איור 2 ג). יש להקפיד לא על להזריק את קרציות, אשר יגרום לאובדן hemolymph ועלולה לגרום למותם של סמן את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המזרק המילטון לאחר סיום זריקות בכל קבוצה ניסיונית. לפני השימוש עבור קבוצה אחרת ניסיונית. מלאו את המזרק הראשון כוס המכילה מי חמצן 3% ולאחר מכן לגרש לתוך מיכל פסולת, וחזור 15 פעמים. מלאו את המזרק מתוך כוס המכילה מים סטריליים ואז לגרש לתוך מיכל פסולת, וחזור 15 פעמים. הקפד לא לכופף את הבוכנה של המזרק המילטון, כי אם כפופות, הבוכנה לא יעברו בצורה חלקה להגיב למגע עדין נדרש הזרקה של קרציות. </li></ol> 2.5. טיפול קרציות לאחר ההזרקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את סמן מוזרק מיד מהקלטת דביק כפול עם מלקחיים בסדר להניח אותו במיכל פלסטיק התאוששות (כ 6 "x 6" ועטור דבק כדי למנוע בריחה של קרציות). קרציות יהיה פעיל לזמן קצר לאחר ההזרקה, אבל צריך בקרוב להתחיל לזחול סביב המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נשימת CO 2 על קרציות מיד לאחר הצבתם במכולה התאוששות כדי לסייע להפעיל את קרציות. לאחר קרציות הן זחילה פעיל, הפצע יתרפא זריקה במהירות והם סביר להניח לשרוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן קרציות לפי מספר בכל קבוצה ניסיוניים ולמקם אותם בכוס פלסטיק עם מכסה שכותרתו צפופות. קרציות החלפת צריך להיות מוזרק להחליף כל שכל נפטר לפני הזרקת קבוצת הניסוי הבא. </li></ol> 2.6. סמן מחזיק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרציות בתא לחות (12hr אור: 12 שעות photoperiod כהה 22-25 ° C ו 95% h יחסיתumidity) והחזק ליום 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרציות מקום קרציות האכלה תאים, אחד לכל קבוצת הניסוי, דבוק כבשה ולאפשר להם להאכיל עם מספר שווה של קרציות זכר או נקבה uninjected (לפי המין לא היה מוזרק). קרציות נקבה כי להאכיל את גודש, אלה יוסרו מן הכבשים לאחר 10 ימים של האכלה או כאשר הנקבות לשלוט כבר הוריד את המארחת נאספים שקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרציות בקרטונים, והחזק בתא לחות עד השלמת ההטלה. הערכת ההטלה על ידי שקלול המוני ביצים המיוצר על ידי כל קרציות בקבוצה. </li></ol> 2.7. ניתוח של פנוטיפ סמן לאחר RNAi. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת סמן פנוטיפ לאחר האכלה על ידי קביעת מספר קרציות ששרדו, משקל סמן, ההטלה והפוריות ביצה. עם זאת, ניתוחים אחרים עשויים להתבצע בהתאם הגן לבין מטרות ממוקדות של המחקר. </li></ol> 3. ניתוח לאשר השתקת הגן על ידי RT-PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח בלוטות הרוק ואת האומץ של קרציות בודדים מקבוצות שליטה הזריק ו-dsRNA מוזרק לאחר ההנקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית RNA הכולל דגימות רקמה בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תעתיקי גנים ברקמות יעד שונות על ידי זמן אמת RT-PCR ו לנרמל את רמות RNA נגד 16S rRNA סמן בשיטת genNorm (שיטת ddCT כמו מיושם על ידי Bio-Rad iQ5 Standard Edition, גרסה 2.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל עקומות דיסוציאציה בסוף התגובה על מנת להבטיח כי רק אחד amplicon נוצר וכי לפגל amplicons עקבי בטווח הטמפרטורה זהה עבור כל מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את רמות ה-mRNA (מנורמל לערכי CT) בין שליטה הזריק ו-dsRNA מוזרק באמצעות קרציות הסטודנטים `s t-test (p = 0.05). </li></ol> 4. נציג תוצאות: פרוטוקול המתואר במסמך נעשה שימוש במעבדה שלנו RNAi ב שונה מינים רבים סמן ixodid (טבלה 1). כמות dsRNA מוזרק קרציות משתנה עם גודלו של סמן את; מינים סמן גדול יכול להכיל נפח גדול יותר. קרציות שליטה שלילי צריך להיות מוזרק עם dsRNA שאינו קשור. DsRNAs מספר כגון subolesin 14-19,22-25,27-32,34 ו בטא אקטין 20,21 יכול לשמש שולטת חיובית. שים לב, חשוב לשטוף את המזרק בין הטיפולים, כדי למנוע ערבוב פתרונות dsRNA. אם הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה, פחות מ 5% תמותה יש לקבל זריקה ההליך לאחר 24 שעות. פנוטיפ אופייני אחרי מציאה גן קרציות מוצג באיור 3 עם פאנל של קרציות מוזרק עם בריכות של dsRNA כדי המסך סמן אנטיגנים מגן. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סמן מינים </td><td> dsRNA מוזרק </td><td> הפניות </td></tr><tr><td> קרצית scapularis </td><td> ספריית cDNA, subolesin, אקטין, nucleotidase, NF-kB, akirin </td><td> 21, 22, 29, 30 </td></tr><tr><td> Dermacentor variabilis </td><td> subolesin, GST, היוביקוויטין, vATPase, selenoproteins M ו W2a, hematopoietic גזע / ובתאים דמוי חלבון, למקטע אקטין פרוטאזום 26S, ferritin1, varisin, akirin </td><td> 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 </td></tr><tr><td> Dermacentor marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> Amblyomma americanum </td><td> ספריית cDNA, subolesin, akirin </td><td> 17, 22, 30 </td></tr><tr><td> Amblyomma hebraeum </td><td> subolesin, voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus sanguineus </td><td> Rs86, subolesin </td><td> 22, 23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus microplus </td><td> GST, היוביקוויטין, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, העיכול, GIII, EF1a, חלבון flagelliform משי, von Willebrand גורם </td><td> 16, 18, 25, 27 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus annulatus </td><td> היוביקוויטין, subolesin, EF1a, GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. טיק מינים שבהם פרוטוקול RNAi כבר בשימוש. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. המיקום של קרציות, בצד הגחוני מעלה, בקלטת דביק כפול דבק גיליון של שעווה שיניים אדום. קרציות מוצבים בקבוצות של 5, לאחר מכן רצועה קטנה של דבק מונח על גפי על מנת להבטיח את המשך קרציות תוך מתן מזרק כדי לשמור על הגוף במהלך סמן את הזריקה. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ההליך כולל הזרקה (א) פירסינג ברבע הימני התחתון של שלד חיצוני לתקתק עם אינסולין סאיringe מצויד במחט 29 מד כדי ליצור אתר הזרקה, (ב) הזרמה מיידית של dsRNA באתר זה בעזרת מזרק עם מחט המילטון 33 מד אשר (ג) קרוב לוודאי תגרום לדליפת חלק hemolymph סמן / נוזלים. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. פאנל של שש קבוצות סמן שבו RNAi שימש המסך אנטיגנים סמן המגן Amblyomma americanum. השינויים פנוטיפי ב קרציות ניתן לראות בהשוואה חיובי subolesin RNAi מלאה שליטה שלילי dsRNA קשור. בניסוי זה ההשפעה של RNAi על התמותה סמן, משקולות, ו ההטלה של כל קבוצה נותח סטטיסטית.

<ol><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+Ticks+as+vectors+of+pathogens+that+cause+disease+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals.</a> Front. Biosci. 13, 6938-6946 (2008).</li>
<li>Peter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mosquito+control-Lessons+from+the+past%2C+solutions+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">mosquito control-Lessons from the past, solutions for the future.</a> Vet. Parasitol. 132, 205-215 (2005).</li>
<li>Barker, S. C., Murrell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematics+and+evolution+of+ticks+with+a+list+of+valid+genus+and+species+names%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names.</a> Parasitol. 129, S15-S36 (2004).</li>
<li>Willadsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+control%3A+Thoughts+on+a+research+agenda%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Tick control: Thoughts on a research agenda.</a> Vet. Parasitol. 138, 161-168 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J., Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+development+of+vaccines+for+control+of+ixodid+tick+species%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species.</a> Parasite Immunol. 28, 275-283 (2006).</li>
<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Cerutti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+traveling+in+the+cell+and+gaining+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA interference: traveling in the cell and gaining functions.</a> Trends Genet. 19, 39-46 (2003).</li>
<li>Kavi, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in Drosophila.</a> FEBS Lett. 579, 5940-5949 (2005).</li>
<li>Mello, C. C., Conte, D. J. r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431, 338-342 (2004).</li>
<li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">RNA interference and potential applications.</a> Curr. Top. Med. Chem. 6, 901-911 (2006).</li>
<li>Ramakrishnan, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+RNA+interference+in+tick+salivary+gland+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Application of RNA interference in tick salivary gland research.</a> J. Biomol. Tech. 16, 297-305 (2005).</li>
<li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+applicability+in+tick+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">RNA interference: applicability in tick research.</a> Exp. Appl. Acarol. 28, 89-96 (2002).</li>
<li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+ticks%3A+a+study+using+histamine+binding+protein+dsRNA+in+the+female+tick+Amblyomma+americanum%5BTitle%5D)+AND+%22Insect.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA interference in ticks: a study using histamine binding protein dsRNA in the female tick Amblyomma americanum.</a> Insect. Mol. Biol. 12, 299-305 (2003).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+studies+of+tick+cells+in+response+to+infection+with+the+cattle+pathogen%2C+Anaplasma+marginale%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale.</a> Genomics. 90, 712-722 (2007).</li>
<li>AlmazäN, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+candidate+protective+antigens+for+the+control+of+cattle+tick+infestations%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations.</a> Parasitol. Res. 106, 471-479 (2010).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protective+antigens+by+RNA+interference+for+control+of+the+lone+star+tick%2C+Amblyomma+americanum%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum.</a> Vaccine. 28, 1786-1795 (2010).</li>
<li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+genes+in+salivary+glands+of+male+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+in+response+to+infection+with+Anaplasma+marginale%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Differential expression of genes in salivary glands of male Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to infection with Anaplasma marginale.</a> BMC Genomics. 11, 186-186 (2010).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+tick+infections+with+Anaplasma+marginale+and+A.+phagocytophilum+by+targeting+the+tick+protective+antigen+subolesin%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction of tick infections with Anaplasma marginale and A. phagocytophilum by targeting the tick protective antigen subolesin.</a> Parasitol. Res. 100, 85-91 (2006).</li>
<li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 1141-1146 (2004).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+ticks+for+identification+of+protective+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens.</a> Parasitol. Res. 96, 137-141 (2005).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tick+protective+antigen%2C+4D8%2C+is+a+conserved+protein+involved+in+modulation+of+tick+blood+ingestion+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction.</a> Vaccine. 24, 4082-4095 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+silencing+the+expression+of+tick+protective+antigens+4D8+and+Rs86+in+Rhipicephalus+sanguineus+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of silencing the expression of tick protective antigens 4D8 and Rs86 in Rhipicephalus sanguineus by RNA interference.</a> Parasitol. Res. 99, 108-113 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocidal+control+of+ticks+by+silencing+of+a+single+gene+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autocidal control of ticks by silencing of a single gene by RNA interference.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 332-338 (2006).</li>
<li>Nijhof, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bm86%2C+Bm91+and+subolesin%2C+in+the+silencing+of+the+tick+protective+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Bm86, Bm91 and subolesin, in the silencing of the tick protective antigens.</a> Int. J. Parasitol. 37, 653-662 (2007).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+defensin%2C+varisin%2C+in+male+Dermacentor+variabilis+by+RNA+interference+results+in+reduced+Anaplasma+marginale+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">Silencing of the defensin, varisin, in male Dermacentor variabilis by RNA interference results in reduced Anaplasma marginale infections.</a> Exp. Appl. Acarol. 46, 17-28 (2008).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+role+of+tick+subolesin+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evidence of the role of tick subolesin in gene expression.</a> BMC Genomics. 9, 372-372 (2008).</li>
<li>Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+RNA+interference+of+the+subolesin+and+voraxin+genes+in+male+Amblyomma+hebraeum+%28Acari%3A+Ixodidae%29+on+female+engorgement+and+oviposition%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">The impact of RNA interference of the subolesin and voraxin genes in male Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae) on female engorgement and oviposition.</a> Exp. Appl. Acarol. 47, 71-86 (2009).</li>
<li>Galindo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+subolesin+is+an+ortholog+of+the+akirins+described+in+insects+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates.</a> Dev. Comp. Immunol. 33, 612-617 (2009).</li>
<li>Canales, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+immunogenicity+of+the+mosquito+ortholog+of+the+tick+protective+antigen%2C+subolesin%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation and immunogenicity of the mosquito ortholog of the tick protective antigen, subolesin.</a> Parasitol. Res. 105, 97-111 (2009).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+genes+involved+in+Anaplasma+marginale-tick+interactions+affects+the+pathogen+developmental+cycle+in+Dermacentor+variabilis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis.</a> BMC Dev. Biol. 9, 42-42 (2009).</li>
<li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subolesin+expression+in+response+to+pathogen+infection+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks.</a> BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).</li>
<li>Karim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+tool%3A+gene+silencing+in+Ixodes+scapularis+eggs+and+nymphs+by+electroporated+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA.</a> BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li>
<li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

למרות שיטות אחרות תוארו עבור RNAi ב 14 קרציות, 33, הזרקה של dsRNA המתואר כאן הוא הנפוץ ביותר הן יאכילו (טבלה 1) והאכילה קרציות 16,25,34. RNAi הוכח להיות כלי רב ערך לחקר תפקוד הגן סמן על האפיון של ממשק קרציות הפתוגן והקרנת ואפיון של אנטיגנים סמן מגן 14,35. בפרט, RNAi הפך כלי חשוב ביותר עבור ניתוחים תפקודית קרציות 35. מתודולוגית, RNAi צפוי להתפתח שיטות יעילות יותר עשוי לאפשר מציאה גן במספר רב של אנשים. המנגנון של dsRNA-Induced RNAi ב קרציות צריך להיות מעודן לתרום להבנה טובה יותר וניצול של גישה זו הגנטי מין זה 35,36. היקף מחוץ היעד ההשפעות של RNAi ב קרציות היא גם שאלה חשובה, כי יש לטפל באופן מלא 14,27. לבסוף, RNAi סביר להניח לספק תרומות מקיף ללימוד תקנה סמן גנטי וביולוגיה מערכות קרציות הפתוגן ממשק עלולה להיות השפעה על התפתחות של חיסונים כדי לשלוט מכת סמן והעברת סמן נישאים פתוגנים.

<table><tbody><tr><td>מערכת Access RT-PCR</td><td>Promega</td><td>A1250</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לטיהור PCR מסוג Purelink</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-02</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Megascript RNAi</td><td>Ambion</td><td>AM1626M</td><td></td></tr><tr><td>שעווה דנטלית אדומה</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72674</td><td></td></tr><tr><td>כוסות פלסטיק, 1.25 oz ומכסים</td><td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פינצטה עדינה</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>שונות</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין</td><td>Monoject</td><td></td><td>מצויד במחט &amp;#189;&quot;, 29 gauge</td></tr><tr><td>מזרק Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>701SN,33/.375&amp;#8221;/45DGR</td><td>מיוצר בהזמנה מיוחדת</td></tr><tr><td>TriReagent</td><td>Sigma</td><td>93289</td><td></td></tr><tr><td>ערכת iScript One-Step RT-PCR עם SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8892</td><td></td></tr><tr><td>מערכת לגילוי Real-time PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>מספר מערכות</td><td>אנא עיינו ב-&lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

rna התערבות קרציות

RNA Interference in Ticks

קרציות הן ectoparasites hematophagous מחייבת של חיות ובני אדם בר מקומיים, נחשבים ברחבי העולם השנייה יתושים כמו וקטורים של מחלות אנושיות 1 ואת הווקטורים החשובים ביותר המשפיעים על תעשיית הבקר העולמית 2. קרציות מסווגים תת Acari, Parasitiformes סדר, suborder Ixodida ו מופצים ברחבי העולם מן הקוטב הצפוני אל באזורים טרופיים 3. למרות המאמצים לשלוט מכת קרציות, ectoparasites אלה נשארים בעיה חמורה לבריאות בני אדם ובעלי חיים 4,5. התערבות RNA (RNAi) 6 היא גישה המבוססת על גרעין חומצה הפוך גנטי כרוך שיבוש של ביטוי גנים על מנת לקבוע תפקוד הגן או את השפעתו על מסלול מטבולי. RNAs התערבות קטנה (siRNAs) הם מולקולות של מפעיל מסלול RNAi כי הוא שיזם פעמיים תקועים RNA (dsRNA) ותוצאות השפלה עוצמה רצף ספציפי של mRNAs cytoplasmic המכיל את רצף זהה ההדק dsRNA 7-9. פוסט תעתיק להשתקת גנים מנגנוני ביוזמת dsRNA התגלו אאוקריוטים כל למד עד כה, RNAi פותחה במהירות ככלי ללימודי גנומיקה תפקודית יישומים אחרים 10 במגוון רחב של אורגניזמים. RNAi הפך הנפוצה ביותר גנים והשתקת טכניקה קרציות ואורגניזמים אחרים בו גישות חלופיות עבור מניפולציה גנטית אינם זמינים או 5,11 אמין. אפיון גנטי של קרציות הוגבל עד הבקשה האחרונה של RNAi 12,13. בזמן הקצר הזה RNAi כבר זמין, הוא הוכיח את עצמו להיות כלי רב ערך ללימוד פונקציה סמן גנטי, אפיון של ממשק קרציות הפתוגן והקרנת ואפיון של אנטיגנים סמן מגן 14. בזאת, שיטה עבור RNAi באמצעות הזרקה של dsRNA לתוך קרציות יאכילו מתואר. סביר להניח כי הידע שנרכש גישה זו הניסוי יתרום משמעותית להבנה של מערכות ביולוגיות בסיסיות ופיתוח של חיסונים כדי לשלוט מכת סמן ולמנוע העברת סמן נישאים פתוגנים 15-19.

השיטה של ​​התערבות RNA (RNAi) בזריקה של dsRNA לתוך קרציות יאכילו מתואר. RNAi היא הנפוצה ביותר גנים והשתקת טכניקה קרציות שם שימוש בשיטות אחרות של מניפולציה גנטית הוגבל.

RNA התערבות קרציות

קרציים הם אקטופרזיטים המטרופיים (hematophagous) מחייביים של בעלי חיים ברים ומבויתים ובני אדם, ונחשבים לשניים בעולם אחרי הפשיות כווקטורים...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את טכניקת השתקת RNA (RNA interference) בקרציות באמצעות הזרקה. דבר זה מושג תחילה על ידי סינתזה של RNA דו-גדילי של הגן או הגנים הרלוונטיים. לאחר מכן, ה-RNA מוזרק לקרציות, שלאחר מכן הן נשמרות בתא לחות למשך 24 שעות.לאחר תקופת המתנה זו, הקרציות ניזונות מבעל חיים, כגון כבש. נקבעים פרמטרי האכלה כגון משקל, התקלפות ומיקום הביצים, וכן ביטוי של הגן או הגנים המבוקשים באמצעות real-time R-T-P-C-R. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המדגימות את השפעת השתקתו של הגנים המבוקשים על הביולוגיה של הקרצייה באמצעות הערכה של פרמטרים ביולוגיים של הקרצייה וביטוי גנים ב-real-time R-T-P-C-R.הקבוצה שלנו עובדת עם קרציות בניסיון לאפיין אירועים מולקולריים בממשק שבין הקרצייה לפתוגן, על מנת להשתמש במידע בסיסי זה לפיתוח שיטות לבקרת פלישת קרציות והעברת פתוגנים לבני אדם ולבעלי חיים. השתקת RNA (RNA interference) הפכה לכלי חיוני במחקר זה מכיוון שהיא השיטה היחידה הזמינה למניפולציה גנטית של קרציות. תפקודם של גנים רבים בקרציות אינו ידוע.השתקת RNA (RNA interference) מאפשרת לנו להגדיר את תפקידם של גנים בקרציות ואת ביטוי הגנים בהיבטים רבים של הביולוגיה של הקרציה, כולל הזדווגות, רבייה, האכלה, עיכול, תפקוד בלוטות הרוק, והכשירות של הקרציה כווקטור להעברת פתוגנים. את הפרוצדורה ידגים צוות השתקת ה-RNA בקרציות מהמעבדה שלנו, ד"ר Ed Lewin, סטודנט לתואר מתקדם, Busby ואני. כדי לייצר RNA דו-גדילי, תחילה סנתיזו פריימרים אוליגונוקלאוטידיים המכילים רצפי פרומוטור T7 עבור תמלול RNA in vitro.לדוגמה, derma center vari lesin. השתמשו בפריימרים האוליגונוקלאוטידיים D eight A a T 75 ו-D eight DVT 73 המוצגים כאן. הגבירו את הגן המטרה באמצעות R-T-P-C-R תוך שימוש ב-10 picomoles מכל פריימר אוליגונוקלאוטידי ו-1 to 10 nanograms של RNA כולל מקרציה.בשלב הבא, טהרו את תוצר ה-PCR. לאחר מכן, השתמשו בשמונה µL או בכ-100 ng כדי לסנתז RNA דו-גדילי. כדי להכין את הקרציות להזרקה, שטפו תחילה את הקרציות בסדרת התמיסות הבאה: מי ברז, 3% hydrogen peroxide, מים מזוקקים פעמיים, 70% ethanol ושתי שטיפות סופיות במים מזוקקים.בצעו כל שטיפה בתוך מבחנה צנטריפוגית חד-פעמית של 50 milliliter על ידי ניעור. לאחר מכן, שפכו את התמיסה דרך רשת סריג דקה. ייבשו את הקרציות על נייר סופג, ולאחר מכן חלקו את הקרציות לקבוצות של 20 עד 50, בהתאם לניסוי.העבירו כל קבוצה לכוס פלסטיק בנפח 1.25 ounce עם מכסה אטום, וסמנו כל כוס לפי הקבוצה הניסויית. לאחר מכן, הרכיבו צוות RNAi המורכב משלושה אנשים שיבצעו את תהליך ההזרקה. האדם הראשון ממקם כל קרציה על סרט דביק המודבק לדף שעווה דנטלית בצבע אדום בגודל של שלוש על שש אינץ'.האדם השני מזריק לקרציות והשלישי עוקב אחר הקרציות לאחר ההזרקה, נושף פחמן דו-חמצני על הקרציות כדי להפעילן, וסופר ומעביר את הקרציות החיות לכוסות המסומנות במספר הקבוצה הניסויית. כל חברי הצוות חייבים להרכיב כפפות חד-פעמיות. כדי להתחיל בתהליך ההזרקה לקרציות, תפסו קרצייה באמצעות פינצטת Dumont עדינה והניחו אותה כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה על סרט דביק כפול שהודבק ללוח שעווה דנטלית אדומה. מקמו את הקרציות בקרבה אחת לשנייה בקבוצות של חמש. הניחו רצועה קטנה של סרט דביק (masking tape) מעל חלקי הפה של כל חמש הקרציות.כדי להגביל אותם עוד יותר, השאר את רוב הגוף חשוף כך שתהליך ההזרקה יוכל להיצפה על ידי המזריק. כדי להזריק לקרצייה, פתח חור ברביע הימני התחתון של המשטח הוונטרלי של השלד החיצוני באמצעות מזרק אינסולין חד-פעמי המצויד במחט בדרגה 29 ובאורך חצי אינץ'. לאחר מכן, הזרק באופן מיידי לקרציות 0.2 עד 0.5 µL של תמיסת RNA דו-גדילי באמצעות מזרק Hamilton בהתאמה אישית ומחט בדרגה 33 ובאורך אינץ' אחד עם קצה חתוך בזווית של 45 מעלות; הכנס את המחט עמוק לתוך חלל הקרצייה כדי להבטיח את מיקומו והשמירה של ה-RNA דו-גדילי.על אף שנוזל משתחרר לאחר ההזרקה, מיקום עמוק של המחט להזרקה יבטיח שפיקדון מספיק של RNA דו-גדילי יועבר לחלל הקרציה כדי לגרום להשתקת גנים; יש להיזהר לא להזריק כמות מופרזת, דבר שיגרום לאובדן המולימפה ולמות הקרציה. מיד לאחר הזרקת הקרציות, הרים אותן מהסרט הדביק הכפול באמצעות פינצטה עדינה והעבר אותן למכל התאוששות מפלסטיק.הקרציות יישארו לזמן קצר לא פעילות לאחר ההזרקה, אך אמורות להתחיל לזחול בתוך הצלחת במהרה. הפעילו את הקרציות על ידי נשיפת פחמן דו-חמצני עליהן. ברגע שהקרציות זוחלות ופעילות, פצע ההזרקה יחלים במהירות והן צפויות לשרוד.ספרו את הקרציות בכל קבוצה ניסויית והניחו כל קבוצה בכוס פלסטיק מסומנת עם מכסה אטום. החליפו כל קרציה שמתה בקבוצה הנוכחית לפני הזרקה לקבוצה הניסויית הבאה. נקו את מזרק ההמילטון לפני ההזרקה לקבוצה הניסויית הבאה על ידי מילוי ואז ריקון של המזרק במי חמצן 3% טריים.15 פעמים, ולאחר מכן 15 שטיפות במים סטריליים. יש להיזהר לא לכופף את הבוכנה של מזרק ההמילטון (Hamilton), שכן אחרת הבוכנה לא תנוע בצורה חלקה ולא תגיב למגע העדין הנדרש להזרקה לקרציים. לאחר ההזרקה, יש להניח את הקרציים בתא המכיל מיכל מלא במים ובאשלגן סולפט, השומר על לחות גבוהה עבורם למשך יום אחד.בשלב הבא, מקמיים קרציות בודדות בתאי האכלה של קרציות המודבקים לכבשה, ומאפשרים להן להזין יחד עם מספר שווה של קרציות זכר או נקבה שלא הוזרקו, בהתאם למין שלא הוזרק. אספי ושקלי את קרציות הנקבה מתא ההאכלה לאחר השלמת ההזנה, הנמשכת כ-10 ימים, או כאשר נקבות הביקורת נשרו מהמארח. דגרי כל קבוצת קרציות בתא לחות עד לסיום הנחת הביצים. העריכי את הנחת הביצים לפי קבוצה על ידי שקילת מסת הביצים שהופקה על ידי כל הקרציות בקבוצה, כדי להעריך את הפנוטיפ של הקרצייה לאחר ההזנה.קבעו את מספר הקרציות ששרדו וחשבו את משקל הקרציות, כמו גם את מיקום הביציות ואת פוריות הביצים. בהתאם לגן המטרה ומטרות המחקר, ניתן לבצע אנליזות נוספות כדי לאשר השתקה גנטית באמצעות R-T-P-C-R. לאחר ההאכלה, בצעו דיסקציה של בלוטות הרוק והמעיים מקרציות בודדות מקבוצת הביקורת המוזרקת ומקבוצת ה-RNA דו-גדילי המוזרקת, ולאחר מכן הפקו RNA כולל מדגימות הרקמה הבודדות.נתחו את תמלילי הגן המטרה ברקמות בודדות באמצעות real-time R-T-P-C-R ונרמלו את רמות ה-RNA ביחס ל-16 s ribosomal RNA של הקרציה. באמצעות שיטת gene norm, הריצו עקומות דיסוציאציה בסוף התגובה כדי להבטיח שנוצר רק אמפליקון אחד ושהאמפליקונים עוברים דנטורציה באופן עקבי באותו טווח טמפרטורות עבור כל דגימה, השוו את ערכי ה-CT המנורמלים של רמות ה-mRNA בין קרציות שהוזרקו ביקורת לבין קרציות שהוזרק להן RNA דו-גדילי באמצעות מבחן t של Student.הפרוטוקול המתואר כאן שימש במעבדתנו לביצוע RNAi במגוון מינים שונים של קרציות. כמות ה-RNA דו-גדילי המוזרקת לקרציות משתנה בהתאם לגודל הקרצייה. מיני קרציות גדולים יותר יכולים לקלוט נפח גדול יותר.ניתן למצוא את המקורות בחלק הכתוב המצורף לפרוטוקול. אם הפרוטוקול בוצע נכון, שיעור התמותה כתוצאה מהליך ההזרקה לאחר 24 שעות צריך להיות נמוך מ-5%. מוצג כאן פנוטיפ טיפוסי לאחר השתקה גנטית (gene knockdown) בקרציים, כאשר קבוצת קרציים הוזרקה עם תערובות של RNA דו-גדילי ששימשו לסריקת אנטיגנים מגנים בקרציים.בקרציים הנבדקים באמצעות מיקרוסקופיה של אור, ניתן להבחין בניוון תאי ברקמות הקרצייה. שינויים פנוטיפיים עשויים להיות מלווים גם באובדן תפקוד. לדוגמה, RNAI של SUBIN מוביל לזכרים עקרים שאינם יכולים להזדווג בהצלחה עם הנקבות בעקבות הפרעה ב-RNA ובקרציים.ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי לקבוע את השפעת השתיקה הגנטית על ביטוי הגנים והחלבונים ועל הביולוגיה של הקרציה, כולל real-time R-T-P-C-R, מיקרוסקופיית אור, אלקטרונים או קונפוקלית, גנומיקה או פרוטאומיקה. ניתן לבצע השתקת RNA גם בתרביות תאים של קרציות, דבר המספק שיטה in vitro לחקר האינטראקציות בין תאי הקרציה לפתוגנים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ליים מחלות מחקר מחקרים לעיתים קרובות דורשים דור של קרציות נגוע הפתוגן Borrelia burgdorferi, תהליך זה לוקח בדרך כלל מספר שבועות. כאן אנו מדגימים microinjection מבוססי זיהום סמן הליך זה יכול להתבצע תוך שעות ספורות. אנחנו גם להדגים שיטה immunofluorescence עבור בלוקליזציה באתרו של B. burgdorferi בתוך קרציות.

שיטות העברה מהירים לוקליזציה של פתוגנים מחלת ליים בתוך גוט טיק

Colorado tick fever virus (CTFV) is a non-enveloped virus with a multi-segmented double-stranded RNA genome.To generate CTFV, take a mixture of genome and expression plasmids.The genome plasmids encode all viral genome segments under a T7 promoter, while the expression plasmids encode all viral proteins under a mammalian promoter.Introduce a transfection reagent to form complexes.Apply these complexes to mammalian cells that express T7 RNA polymerase and incubate to allow plasmid entry. The...

Plasmid-Based Reverse Genetics System to Generate Colorado Tick Fever Virus

מחלת ליים היא המחלה וקטור הנישא ביותר המדווח בדרך כלל בצפון אמריקה. הסוכן סיבתי, Borrelia burgdorferi הוא חיידק החיידק מועבר על ידי קרציות Ixodid. הילוכים וזיהוי של זיהום במודלים של בעלי חיים מותאם על ידי השימוש בהאכלה לתקתק, שאנו מתארים כאן.

האכלה של קרציות בבעלי חיים להילוכים וXenodiagnosis במחקר מחלת ליים

PCR מקוננת היא טכניקה רגיש, ספציפית, וברור כי ניתן להחיל על שנתות ש-DNA תמציות כדי לחקור Borrelia burgdorferi, סוכן סיבתי של מחלת ליים. הניסוי הראשוני של ה-PCR משתמשת תחל גנים ספציפיים כדי ליצור amplicons ארוכה, אשר לאחר מכן הופכים תבניות עבור ריאקציה עוקבות באמצעות תחל פנימי.

זיהוי החיידק מחלת ליים, Borrelia Burgdorferi, בשנתות באמצעות PCR מקוננים

כאן אנו מציגים פרוטוקול הדור הבא רצפי עבור מטוסי אף-16 rRNA רצף המאפשרת זיהוי ואפיון של קהילות חיידקים בתוך וקטורים. שיטה זו כרוכה DNA החילוץ, הגברה, barcoding דגימות באמצעות PCR, רצף תאים זרימה, ביואינפורמטיקה כדי להתאים את רצף נתונים למידע פילוגנטי.

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

במחקר זה, מערכת האכלה עבור שלבי נימפה וזחל של קרצייה קשה פותחה באמצעות כמוסה המחוברת לעכבר מעבדה. קפסולת ההאכלה עשויה מחומרים גמישים ונשארת מחוברת היטב לעכבר למשך שבוע אחד לפחות ומאפשרת ניטור נוח של הזנת קרציות.

מודל מבוסס קפסולה לשריצה בשלבי קרציות קשות לא בוגרים בעכברי מעבדה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד של מיקרו-רנ"א מבלוטות הרוק של קרציות ושלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות. זהו הליך אוניברסלי המשלב ריאגנטים ואספקה נפוצים. השיטה גם מאפשרת שימוש במספר קטן של קרציות, וכתוצאה מכך מיקרו-רנ"א איכותיים שניתן לרצף בקלות.

בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להזרקת עוברי קרציות. הזרקת עובר היא הטכניקה המועדפת למניפולציה גנטית ליצירת קווים מהונדסים.

טכניקת הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis

מוצגת כאן שיטה להאכלת קרציות במבחנה באמצעות מערכת ממברנות מלאכותית המאפשרת גודש חלקי או מלא של מגוון שלבי חיים של הקרציות.

קרציות האכלת קרום מלאכותי עבור Ixodes scapularis

מאמר זה מציג את המתודולוגיה לחשיפת בני אדם לזחל Ixodes scapularis לצורך מחקר קליני. הטכניקה פשוטה יחסית, נסבלת על ידי מתנדבי המחקר, וניתנת לשינוי בהתאם לצרכי הניסוי. מחקר כזה בבני אדם חייב להתבצע תחת פרוטוקולי מחקר קליני שאושרו על ידי הרשויות הרגולטוריות המתאימות.

מודל לחשיפה ניסיונית של בני אדם לקרציות זחל Ixodes scapularis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף רוק, המולימפה, בלוטות הרוק והמעי האמצעי, לאחר דיסקציה של קרצייה בודדת שניזונה, כדי לחקור לוקליזציה ספציפית לרקמה של פתוגנים הנישאים על ידי קרציות כדי לקדם את ההבנה של יכולת הווקטור ואינטראקציות פתוגן-מיקרוביום.

מיצוי רוק, המולימפה, בלוטות רוק ומעי תיכון מקרציות בודדות (Acari: Ixodidae)

למד טכניקת RNAi בקרציות באמצעות הזרקת dsRNA לחקר תפקודי גנים ואינטראקציות עם פתוגנים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור ביולוגיה של קרציות ולפתח אסטרטגיות לבקרת מחלות.

RNA התערבות קרציות

גלה סרטונים נוספים