RNA התערבות קרציות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את הטכניקה של הפרעות RNA בקרציות על ידי הזרקה. זה מושג על ידי סינתזה ראשונה של RNA דו-גדילי של הגן או הגנים המעניינים. לאחר מכן מוזרק ה-RNA לקרציות, ולאחר מכן הן מוחזקות בתא לחות למשך 24 שעות.

לאחר תקופת החזקה זו, הקרציות מורשות להאכיל בעל חיים כמו קרציית כבשה לבסוף. נקבעים פרמטרי הזנה כגון משקל, התכה ומיקום ביציות, וביטוי הגן או הגנים המעניינים על ידי R-T-P-C-R בזמן אמת. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המדגימות את ההשפעה של השתקת גנים ממוקדים על הביולוגיה של הקרציות על ידי הערכת פרמטרים ביולוגיים של קרציות וביטוי גנים על ידי R-T-P-C-R בזמן אמת.

הקבוצה שלנו עובדת עם קרציות המנסות לאפיין אירועים מולקולריים בממשק פתוגן הקרציות כדי להשתמש במידע בסיסי זה כדי לפתח שיטות לשליטה בהתפשטות קרציות והעברת פתוגנים לבני אדם ובעלי חיים. התערבות RNA התגלתה ככלי חיוני במחקר זה מכיוון שזו השיטה היחידה הזמינה למניפולציה גנטית של קרציות. תפקידם של גנים רבים של קרציות אינו ידוע.

הפרעות RNA מאפשרות לנו להגדיר את תפקידם של גנים של קרציות וביטוי גנים בהיבטים רבים של הביולוגיה של הקרציות, כולל הזדווגות, רבייה, האכלה, עיכול, תפקוד בלוטות הרוק ויכולת וקטור הקרציות להעברת פתוגנים. מי שידגים את ההליך יהיה צוות הפרעות ה-RNA של הקרציות מהמעבדה שלנו, ד"ר אד לוין, סטודנט לתואר שני ובאזבי ואני. כדי ליצור RNA דו-גדילי, סנתז תחילה פריימרים אוליגונוקלאוטידים המכילים T שבעה רצפי מקדם לשעתוק במבחנה של RNA.

לדוגמה, דרמה סנטר vari lesin. השתמש בפריימרים של אוליגונוקלאוטידים D שמונה A a T 75, ו- D שמונה DVT 73 המוצגים כאן. להגביר את גן המטרה על ידי R-T-P-C-R באמצעות 10 פיקומולים של כל פריימר אוליגונוקלאוטיד ואחד עד 10 ננוגרם של RNA כולל של קרציות.

לאחר מכן, טהר את מוצר ה-PCR. לאחר מכן השתמש בשמונה מיקרוליטר או כ-100 ננוגרם כדי לסנתז RNA דו-גדילי. כדי להכין את הקרציות להזרקה תחילה, שטפו את הקרציות בסדרת התמיסות הבאה, מי ברז 3% מי חמצן מים מזוקקים פעמיים, 70% אתנול ושתי שטיפות אחרונות במים מזוקקים.

בצע כל שטיפה בצינור צנטריפוגה חד פעמי של 50 מיליליטר על ידי ניעור. לאחר מכן סילוק התמיסה דרך רשת רשת עדינה. חסמו את הקרציות יבשות על מגבות נייר, ואז חלקו את הקרציות לקבוצות של 20 עד 50 בהתאם לניסוי.

מניחים כל קבוצה בכוס פלסטיק של 1.25 גרם עם מכסה הדוק ומסמנים כל עם קבוצת הניסוי. לאחר מכן, הרכיבו צוות RNAi המורכב משלושה אנשים שיבצעו את תהליך ההזרקה. האדם הראשון ממקם כל קרציה על סרט דביק כפול המודבק על יריעת שעווה דנטלית אדומה בגודל 3 על 6 אינץ'.

האדם השני מזריק את הקרציות, והשלישי עוקב אחר הקרציות לאחר ההזרקה, נושם פחמן דו חמצני על הקרציות כדי להפעיל אותן, וסופר ומעביר את הקרציות החיות לכוסות המסומנות במספר קבוצת הניסוי. כל חברי הצוות חייבים ללבוש כפפות חד פעמיות כדי להתחיל בתהליך הזרקת הקרציות, לכוד קרצייה באמצעות מלקחיים עדינים של דומונט והנח אותה עם הצד הגחוני כלפי מעלה על סרט דביק כפול המודבק ליריעת השעווה האדומה מקם את הקרציות לקבוצות של חמישה. הניחו רצועה קטנה של מסקינגטייפ על חלקי הפה של כל חמש הקרציות.

על מנת לרסן אותם עוד יותר, השאר את רוב הגוף חשוף כך שניתן יהיה לצפות בתהליך ההזרקה על ידי מזרק הקרציות. כדי להזריק את הקרצייה, יש לנקב חור ברבע הימני התחתון של פני הגחון של השלד החיצוני באמצעות מזרק אינסולין חד-פליטה המצויד במחט בגודל 29 אינץ'. לאחר מכן, הזריקו מיד לקרציות 0.2 עד 0.5 מיקרוליטר של תמיסת RNA כפולה באמצעות מזרק המילטון בהתאמה אישית ומחט בגודל 33 אינץ' עם נקודה משופעת של 45 מעלות, הנח את המחט היטב לתוך חלל הקרציות כדי להבטיח את המיקום והשמירה של ה-RNA הדו-גדילי.

למרות שהנוזל משתחרר לאחר ההזרקה, מיקום עמוק של המחט להזרקה יבטיח שמספיק RNA דו-גדילי יופקד לתוך חלל הקרציות כדי לגרום להשתקת גנים יש לנקוט בזהירות שלא להיכנס פנימה. הזרקו את הקרציות, מה שיגרום לאובדן המולימפה ולמות הקרצייה. מיד לאחר הזרקת הקרציות, הרם אותן מהסרט הדביק הכפול עם המלקחיים העדינים והניח אותן בכלי התאוששות מפלסטיק.

הקרציות יישארו לזמן קצר לא פעילות לאחר ההזרקה, אך בקרוב יתחילו לזחול סביב הצלחת. הפעל את הקרציות על ידי נשימת פחמן דו חמצני עליהן. ברגע שהקרציות זוחלות ופעילות, פצע ההזרקה יחלים במהירות וסביר להניח שהן ישרדו.

ספרו את הקרציות בכל קבוצת ניסוי והניחו כל קבוצה בכוס פלסטיק מסומנת עם מכסה צמוד. החלף את כל הקרציות שמתות בקבוצה הנוכחית לפני הזרקת קבוצת הניסוי הבאה. נקו את מזרק המילטון לפני הזרקת קבוצת הניסוי הבאה על ידי מילוי ולאחר מכן הוצאת המזרק במי חמצן טריים של 3%.

15 פעמים ואחריהם 15 שטיפות במים סטריליים. הקפד לא לכופף את הבוכנה של מזרק המילטון, אחרת הבוכנה לא תזוז בצורה חלקה ותגיב למגע העדין הנדרש להזרקת קרציות. לאחר ההזרקה מניחים את הקרציות בתא עם מיכל מלא במים ואשלגן גופרתי, השומר על לחות גבוהה ועליהם למשך יום אחד.

לאחר מכן, הכניסו קרציות בודדות לתאי האכלה של קרציות המודבקות לכבשה ואפשרו להן להאכיל במספר שווה של קרציות זכר או נקבה שהוזרקו, לא משנה איזה מין לא הוזרק. אוספים ומנופפים בקרציות נקבות מתא ההזנה לאחר שהן מסיימות את ההאכלה במשך כ-10 ימים או כאשר נקבות הביקורת נשרו, המארח דוגר על כל קבוצת קרציות בתא הלחות עד להשלמת מיקום הביציות. העריכו את מיקום הביציות לפי קבוצה על ידי שקילת מסת הביצים המיוצרות על ידי כל הקרציות בקבוצה כדי להעריך את פנוטיפ הקרציות לאחר האכלה.

קבע את מספר הקרציות ששרדו וחשב את משקל הקרצייה, כמו גם את מיקום הביציות ופוריות הביציות. בהתאם לגן הממוקד ומטרות המחקר, ניתן לבצע ניתוחים אחרים כדי לאשר השתקת גנים על ידי R-T-P-C-R. לאחר ההאכלה, נתחו את בלוטות הרוק והמעיים מקרציות בודדות מקבוצות הביקורת שהוזרקו והוזרקו RNA דו-גדילי, ולאחר מכן חלצו את סך ה-RNA מדגימות הרקמה הבודדות.

לנתח את תעתיקי גן המטרה ברקמות בודדות על ידי R-T-P-C-R בזמן אמת ולנרמל את רמות ה-RNA כנגד RNA ריבוזומלי של 16 s. באמצעות שיטת הנורמה הגנטית, הפעל עקומות דיסוציאציה בסוף התגובה כדי להבטיח שנוצר רק אמפליקון אחד ושהאמפליקונים מתפרקים באופן עקבי באותו טווח טמפרטורות עבור כל דגימה, השווה את ערכי ה-CT המנורמלים עבור רמות mRNA בין בקרה מוזרקת לכפולה. RNA הזריק קרציות באמצעות מבחן ה-T של התלמיד.

הפרוטוקול המתואר כאן שימש במעבדה שלנו עבור RNAi במינים רבים ושונים של קרציות אקסוט. כמות הרנ"א הדו-גדילי המוזרקת לקרציות משתנה בהתאם לגודל הקרצייה. מיני קרציות גדולים יותר יכולים להכיל נפח גדול יותר.

ניתן למצוא את ההפניות בחלק הכתוב הנלווה של הפרוטוקול. אם הפרוטוקול נעשה כהלכה, יש להשיג פחות מ-5% תמותה מהליך ההזרקה לאחר 24 שעות. פנוטיפ טיפוסי לאחר הפלת גנים בקרציות מוצג כאן שבו פאנל של קרציות הוזרק עם מאגרים של RNA דו-גדילי ששימשו לסינון אנטיגנים המגנים על קרציות.

בקרציות הנבדקות במיקרוסקופ אור ניתן להבחין בניוון תאי ברקמות הקרציות. שינויים פנוטיפיים עשויים להיות מלווים גם באובדן תפקוד. לדוגמה, RNAI של SUBIN מביא לזכרים עקרים שאינם יכולים להזדווג בהצלחה עם הנקבות בעקבות הפרעות RNA וקרציות.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי לקבוע את ההשפעה של השתקת גנים על ביטוי גנים וחלבונים ועל הביולוגיה של הקרציות, כולל R-T-P-C-R בזמן אמת, אלקטרונים קלים או מיקרוסקופיה קונפוקלית. גנומיקה או פרוטאומיקה. הפרעות RNA יכולות להיעשות גם בתרביות תאי קרציות ומספקת שיטה חוץ גופית לחקר אינטראקציות פתוגנים של תאי קרציות.