כימות תדירות הגידול מתפשט תאים באמצעות הגבלת השתלת דילול ב Syngeneic דג הזברה

מבחן השתלת תאי הדילול המגביל הוא תקן הזהב להערכת פוטנציאל החידוש העצמי במודלים ניסיוניים של בעלי חיים. בהדגמה זו, עוברי דג זברה סינגניים בשלב תא אחד מוזרקים עם סמרטוט שני MIC ו-RAG שני GFP כדי ליצור דג זברה טרנסגני שיפתח לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי T עם תווית פלואורסצנטית. עד 60 יום לחיים, תאי הלוקמיה העיקריים מבודדים מדגי הזברה ולאחר מכן מטוהרים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי.

לאחר מכן, התאים מושתלים בדילול מוגבל לחלל הצפק של דג הזברה הבוגר, והדגים מנוטרים אחר צמיחת הגידול עד 90 יום. לבסוף, התוכנה הסטטיסטית לניתוח דילול מגביל קיצוני משמשת לכימות תדירות התאים המתפשטים בלוקמיה בתוך הגידול המקורי. הגבלת ניתוח השתלת תאי דילול מאפשרת לחוקרים להעריך במדויק את מספר התאים המתחדשים מעצמם הכלולים בחלק הארי של מסת הגידול.

תאים אלה המתחדשים מעצמם הם שמניעים את היווצרות הסרטן ובסופו של דבר אחראים להישנות. היתרון העיקרי בביצוע מבחני השתלת דילול מגבילים במודל דגי הזברה הוא שניתן להשתיל דגים רבים לכל ניסוי, וכתוצאה מכך דיוק טוב יותר בעת קביעת תדירות תאי התפשטות הגידול המתחדשים מעצמם. שיטה זו מספקת תובנה לגבי תאים המתפשטים בגידול בתאי T, לוקמיה לימפובלסטית חריפה.

ניתן ליישם אותו גם כדי להבין מודלים אחרים של סרטן דג הזברה. ג'סיקה בלקבורן, עמיתה במעבדה וסאלי ליו, טכנאית מוכשרת, ידגימו עבורך את ההליך היום כדי ליניאריזציה של Rag שני CM ו-RAG שני G-F-P-D-N-A מבנים לעכל 10 מיקרוגרם מכל פלסמיד עם אנזים הגבלה, לא אחד ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה. לאחר מיצוי פניל כלורופורם ומשקעי אתנול, אנו משעים כל פלסמיד ב-20 מיקרוליטר מים.

קבע את ריכוזי ה-DNA על ג'ל אגרו של 1% על ידי הפעלת אחד לאחד, אחד עד חמישה, ודילול אחד עד 10 של כל פלסמיד מעוכל עם 20 מיקרוליטר, 10 מיקרוליטר וחמישה מיקרוליטר של סולם DNA בטווח גבוה. כעת יש לדלל את ה-DNA לריכוז סופי של 60 ננוגרם למיקרוליטר להזרקה ל-CG זן אחד syngen. עוברי דג זברה מזריקים 250 ננוליטר של 30 ננוגרם לסמרטוט מיקרוליטר, שני ס"מ ו-30 ננוגרם למיקרוליטר.

סמרטוט שני GFP לשלב תא אחד עוברי דג הזברה המכוונים בזהירות ל- DNA ישירות לתוך התא ולא לחלמון. יש לאחסן את העוברים המוזרקים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס ולהוציא את העוברים המתים לאחר 24 שעות לאחר חמישה ימי חיים, להעביר בעלי חיים למכלים גדולים כ-28 יום לאחר ההזרקה. זחל זברה מורדם על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של ארבעה ננוגרם למיליליטר טריקה S ל-25 מיליליטר מי מערכת דגים בצלחת פטרי.

בחנו את הזחלים להתפתחות גובה פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לזיהוי פלואורסצנטי GFP. הפרד זחלים חיוביים לגידול מאלה השליליים כדי להבטיח שאף דג לוקמי לא יחמיץ בניתוח. ניתן לבחון זחלים שליליים בנקודת זמן מאוחרת יותר לאחר שהגידולים עשויים לגדול עקוב אחר דגי לוקמיה המסומנים פלואורסצנטית לפחות פעם בשבוע באמצעות מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר צמיחת הגידול.

כאשר תאי לוקמיה חיוביים ל-GFP עקפו יותר מ-50% מהחיה, הוסף מיליליטר אחד של ארבעה ננוגרם למיליליטר. Trica S בצלחת פטרי המכילה תשעה מיליליטר של מי מערכת הדגים כדי להקריב את הדג, מניחים את הדג בצלחת פטרי חדשה המכילה מיליליטר אחד של סרום בקר עוברי 5% ב-0.9 XPBS משרים את הדג עם סכין גילוח, משרים את התערובת כדי להפריד גושי תאים גדולים. לאחר מכן העבירו את התאים דרך מסננת רשת של 40 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר.

פיפטה 500 מיקרוליטר מהתאים לתוך צינור פוליסטירן של ארבעה מיליליטר. הוסף מיקרוליטר אחד של מיליגרם אחד למיליליטר, פרידיום יודיד כדי לסמן מערבולת תאים מתים, ואז שמור את התאים על קרח. הכינו גם דג CG אחד מסוג בר לאיסוף תאי דם תקינים, המשמשים כנשא לתאי הגידול במהלך ההשתלה בארבעה מיליליטר של 5% FPS ב-0.9 X PB S לצינור של 50 מיליליטר לנפח כולל של חמישה מיליליטר.

ספרו את תאי הדם הרגילים מדוללים לשלוש פעמים 10 עד חמישית תאים למיליליטר ב-5% FBS ב-0.9 x pbs ואז פיפטה 100 מיקרוליטר לבאר של צלחת 96 בארות באמצעות ממיין תאים מופעל פלואורסצנטי מיון תאי גידול שליליים חיוביים ל-GFP לתוך צלחת 96 באר המכילה תאי דם במינונים שצוינו. בנוסף, מיין 10,000 תאים לבאר ללא תאי דם תקינים ונתח מחדש באמצעות עובדות כדי להעריך את הטוהר והכדאיות של צנטריפוגת התאים הממוינים. צלחת 96 בארות ב 2000 GS למשך 10 דקות כדי לגלול את התאים.

הסר 95 מיקרוליטר מהחטיפה והשהה מחדש את התאים בחמשת המיקרוליטרים הנותרים. הזרקו את תרחיף התאים לחלל הצפק של דג זברה סינגני בוגר בן יותר מ-60 יום באמצעות מזרק מיקרו בגודל 26 וחצי. דג הזברה אינו צריך להיות מורדם לפני ההשתלה.

השתל 45 דגים עם 10 תאי לוקמיה, 20 דגים עם 100 תאים, שבעה דגים עם 1000 תאים וחמישה דגים עם 10,000 תאים גבוהים כ-28 יום לאחר ההשתלה. בדק את דג הזברה המקבל במיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי באמצעות אורך גל עירור 4 85 20 ומסנן פליטה 5 30 25. כדי לזהות פלואורסצנטיות GFP.

רשום את מספר הדגים החיוביים לכל מספר כולל של דגים שהוזרקו. בדוק מחדש את הדגים כל 14 יום עד 90 ורשום את מספר הדגים החיוביים. כאשר דג חיובי לגידול הופך לשופע יותר.

להקריב את החיה על ידי מנת יתר של trica US, להזין את התוצאות לטבלה ולהעלות את הנתונים לתוכנת ניתוח דילול מגביל קיצוני מבוססת אינטרנט כדי לקבוע את תדירות תאי הלוקמיה המתחדשים מעצמם בתוך ה- TALL CG הראשוני עוברים זן אחד הוזרקו עם RAG שני cmic ו- RAG שני זחלי GFP נבדקו ל- TALL ראשוני לאחר 28 ימים התואמים לעבודה קודמת, לכ-5% מהדגים המוזרקים יש תאי T חיוביים ל-GFP בתוך בלוטת התימוס שלהם, ו-100% מהדגים הללו יפתחו לוקמיה. כאן, תאי TALL עם תווית פלואורסצנטית מוינו מבעלי חיים חולים בני 65 יום ושימשו בבדיקת השתלת תאי דילול מגבילה. ראשית, צוירה הליכה לבחירת תאים בודדים.

לאחר מכן נבחרו תאים שליליים של פרופידיום יודיד. ולבסוף נמשכה הליכה כדי לבחור רק את תאי הלוקמיה החיוביים ל-GFP למיון. בדוגמה זו של דגים מושתלים ביום 28 גידולים בשלב מוקדם נראו כאזור של תאים חיוביים ל-GFP ליד אתר ההזרקה.

בעוד שחלק מה-TLS היו מתקדמים יותר, לאחר שהתרחבו כדי למלא את חלל הצפק בניסויים אלה, הושתלו למעלה מ-220 בעלי חיים, שאדם אחד יכול לבצע בקלות תוך מספר שעות. ניתוח נתונים באמצעות תוכנת elda הראה כי בממוצע אחד מכל 135 T כל התאים היו תאים מפיצי לוקמיה המתחדשים מעצמם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתיל תאי גידול בדילול מוגבל לחלל הצפק של דג הזברה הסינגטי, וכיצד להשתמש בנתונים המתקבלים כדי לקבוע את תדירות תאי התפשטות הגידול בתוך גידול נתון.

מחקרים נוספים המשתמשים בבעלי חיים מהונדסים גנטית עשויים לסייע בזיהוי המנגנונים השולטים בחידוש עצמי של תאים אלה המתפשטים בגידול.