HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתמש בתאים מציגי אנטיגן מלאכותיים (aAPC) להרחבה ex vivo של תאי CTL אנושיים ספציפיים לאנטיגן, לשימוש פוטנציאלי באימונותרפיה אדופטיבית. זאת מושג תחילה על ידי הצמדה של HLA A2 IG ונוגדן מונוקלונאלי נגד CD28 אנושי לחיידבקים מגנטיים (dynabeads) כדי ליצור aAPC. השלב השני של הפרוצדורה הוא ביצוע בקרת איכות והטענת פפטידים ל-aAPC. השלב השלישי של הפרוצדורה הוא בידוד של תאי T חיוביים ל-CD8 מדם פריפריאלי אנושי. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא דגירה של תאי T חיוביים ל-CD8 עם aAPC למשך שבוע.

לאחר מכן קוצרים את ה-CTL ומאפיינים אותם לפני שימוש, או מעבירים אותם לגירוי חוזר למשך שבוע נוסף כדי להגיע לרמת הסגוליות וההתרחבות הרצויה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות של מדידת תאי T או צביעה המראות כי ל-CTL שהתרחבו בנוכחות A A PC יש סגוליות אנטיגנית מוגברת. היום אראה לכם מערכת A A PC המבוססת על HI IG וכיצד להשתמש במערכת זו כדי להתרחב ביעילות ex vivo של תאי CTL אנושיים סגוליים ל-CMV בהשוואה לשיטות קיימות אחרות.

טכנולוגיית A A PC שלנו מציעה מספר יתרונות חשובים. היא זמינה מהמדף, כמותה אינה מוגבלת, ונניח ש-A A PC יכולה לשמש עבור כל התורמים החיוביים ל-HRAA two. אוקיי, נתחיל: העבירו 1 mL של חרוזי M four 50 epoxy מהמלאי (כ-400 מיליון חרוזים) אל מבחנה זכוכית סטרילית עם מכסה הברגה.

שטפו את החרוזיים פעם אחת על ידי הוספת 1 ml של בופר boid, ולאחר מכן הניחו את מבחנת הזכוכית מול מגנט dyin all magnet NBC one בזמן שהחרוזים נצמדים לדופן המבחנה. הסירו את ה-snat באמצעות שאיבה. השעיו את החרוזים בתערובת של בופר boid, HLA A two IG dimer ונוגדן מונוקלונלי anti-human CD 28.

לאחר מכן, כדי להקל על צימוד החלבון לחרוצים, סובב את מבחנת הזכוכית ברוטטור בטמפרטורה של 4 °C למשך 24 שעות. לאחר מכן, הנח את המבחנה במגנט MPC 1 והסר את כל תחליל הבוראט. לאחר הסרת התחליל, שטוף את החרוצים פעמיים עם 1 mL של תחליל לשטיפת חרוצים.

כעת הדגרי את החרוזים ב-1 mL של תמיסת שטיפה לחרוזים וסובבי את המבחנה בטמפרטורה של 4 °C למשך 24 שעות נוספות כדי לחסום את אתרי קישור החלבון שנותרו על החרוזים. לאחר מכן הסירי את התמיסות מהמבחנה מזכוכית והחליפי אותן ב-1 mL של תמיסת שטיפה טרייה לחרוזים. העבירי 100 µL של תמיסת שטיפה ל-fax למבחנות fax, ולאחר מכן הוסיפי 5×10⁵ חרוזים.

צבע את החרוצים עם מיקרוליטר אחד של anti muse IgG, one PE ומיקרוליטר אחד של anti muse IgG two a fite לאחר צביעה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C. הוסף 3 mL של באפר שטיפה fax לכל אחת מדגימות הצביעה. לאחר מכן, השק את ה-A A PC על ידי סבוב ב-300 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.

ששפו את ה-A A PC בבופר fax רענן ובדקו את תוצאות הצביעה באופן מיידי באמצעות ציטומטר זרימה. שטפו את החרוזיים פעמיים עם PBS סטרילי כפי שנעשה קודם לכן. לאחר מכן, טענו את החרוזיים עם 10 µL של פפטיד CMV.

ספור את החרו지를 באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer) ולאחר מכן סמן אותם בתאריך ובריכוז החרוזים, כמספר החרוזים למיליליטר. דגור את ה-A A PC עם הפפטיד למשך שלושה ימים לפחות בטמפרטורה של 4 °C. סבב בצנטריפוגה כ-100 milliliters של דם פריפריאלי טרי מתורם חיובי ל-HLA A two ב-10 מבחנות vacutainer עם sodium heparin ב-300 Gs למשך 10 דקות.

בטמפרטורת החדר, הסר בזהירות את שכבת הפלזמה העליונה באמצעות שאיבה. החלף את הפלזמה שנאספה ב-PBS סטרילי והעבר את הדם לבקבוק תרבית סטרילי מסוג T 75. ערבב היטב את הדם ואת ה-PBS באמצעות פיפטינג לאחר שכל הדם נאסף ב-15 milliliters of fial pack פלוס ארבעה מבחנות קוניות של 50 milliliter.

הוסיפו באיטיות 30 עד 35 מיליליטרים של תאי דם מעל ה-fial בכל מבחנה. תוך שמירה על ממשק ברור בין ה-fial לתאי הדם, סבבו בצנטריפוגה את הגרדיאנט של הדם וה-fial ב-500 GS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, כאשר הבלם (break) כבוי וההאצה נמוכה ככל האפשר כדי לשמור על ממשק נקי בין השכבות. לאחר הסבב, שאבו את שכבת הפלזמה העליונה ולאחר מכן השתמשו בפיפטה סרולוגית כדי לשאוב בזהירות את שכבת ה-PBMC. העבירו את ה-PBMC למבחנה קונית חדשה של 50 מיליליטר. לאחר שכל ה-PBMC נאספו, הוסיפו לתאים 30 מיליליטרים של PBS וסבבו אותם בצנטריפוגה.

בשלב הבא, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו את המשקע. בצעו שטיפה נוספת עם 30 milliliters של PBS כדי להסיר שאריות של ה-fi call, ולאחר מכן הגנירו את אוכלוסיית תאי ה-T החיוביים ל-CD8 באמצעות ערכה לבידוד תאי T חיוביים ל-CD8 של Milton Human. בהתאם לפרוטוקול היצרן, ספרו את תאי ה-T החיוביים ל-CD8 ואשרו את רמת הטוהר באמצעות אנליזת FACS.

השעה מיליון CTL בשמונה מיליליטר של תווך גידול לתאי T (culture medium two x) בתוספת שמונה מיליליטר של תווך RPMI מלא, והוסף 1 × 10⁶ של תערובת AA PC. לאחר מכן, השתמש בפפטה רב-ערוצית כדי לזרע 160 µL של תאים לבאר בלוח תרבית רקמות בעל 96 בארות עם תחתית בצורת U. הדגר את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך שבעה ימים.

הזינו את התאים ביום הרביעי עם 80 µL לבאר של T-cell growth Factor two x culture medium. קצרו את התאים ביום השביעי ולאחר מכן הניחו את התאים מול המגנט כדי להסיר את ה-A A PC הישן כאשר כל החרוזים נצמדים לדופן המבחנה.

קצרו והעבירו את התאים למבחנה קונית נוספת בנפח 50 מיליליטר וספרו את מספר התאים. קבעו את הסגוליות האנטיגניות של ה-A A PC באמצעות צביעת טטראמר לפי פרוטוקול היצרן. חשכו שוב את התאים שנקצרו עם A A PC חדש תחת אותם תנאים כדי להגדיל את מספר התאים בעלי הסגוליות האנטיגניות.

להלן תוצאת צביעת טטראמר מייצגת של CTL ספציפי ל-CMV שהופק על ידי A A PC לאחר שבוע אחד של תרבית. מוצגת כאן תוצאת צביעת ציטוקינים תוך-תאית מייצגת של CTL ספציפי ל-CMV שהופק על ידי A-A-P-C-C-M-V; הספציפיות הייתה 61% לפי צביעת טטראמר. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום תאי T, כגון כיצד ניתן לזהות את תנאי התרבית האופטימליים ואת הדרישות לוויסות תפקודי של תאי T.

השיטה של Lowly סיפקה תובנות לטיפול במחלות ויראליות. ניתן להשמיש אותה גם בתחומים אחרים, כגון סרטן.