HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בתאים המציגים אנטיגן מלאכותי או ב-A PC להרחבה ex vivo של CTL ספציפי לאנטיגן אנושי לשימוש פוטנציאלי באימונותרפיה מאמצת. זה מושג על ידי צימוד ראשון של HLA A שני IG ונוגדנים חד שבטיים CD 28 אנטי אנושיים לחרוזי דינה מגנטיים כדי ליצור מחשב A. השלב השני של ההליך הוא ביצוע בקרת איכות והעמסת פפטידים של מחשב ה-A. השלב השלישי של ההליך הוא בידוד CD של שמונה תאי T חיוביים בדם היקפי אנושי. השלב האחרון של ההליך הוא לדגור שמונה תאי T חיוביים עם מחשב A למשך שבוע.

לאחר מכן נקצרים ה-CTL ומאופיינים אותם לפני השימוש בהם או מגורים מחדש למשך שבוע נוסף כדי להשיג את הרמה הרצויה של הספציפיות וההתרחבות שלהם. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות של טאום או צביעה המראות כי ל-CTL המורחבים בנוכחות A A PC יש ספציפיות אנטיגן מוגברת. היום אני הולך להראות לכם מערכת A A PC מבוססת HI IG וכיצד להשתמש במערכת זו כדי להרחיב ביעילות את exvivo ה-CTL האנושי הספציפי ל-CMV בהשוואה לשיטות קיימות אחרות.

טכנולוגיית A A PC שלנו מציעה מספר יתרונות חשובים. הוא זמין, הוא בכמות בלתי מוגבלת, ונניח שניתן להשתמש ב-A A PC עבור כל שני התורמים החיוביים של HRAA. אוקיי, בואו נתחיל להעביר מיליליטר אחד של M ארבעה חרוזי אפוקסי 50 ממלאי של כ -400 מיליון חרוזים לקובץ זכוכית מוברג סטרילי.

שטפו את החרוזים פעם אחת על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר גוף ולאחר מכן הנחת בקבוקון הזכוכית על מגנט NBC בזמן שהחרוזים מודבקים לצד הבקבוקון. הסר את החטיפה על ידי Resus שאיפה. השעו את החרוזים בתערובת של חיץ גוף HLA A שני דימר IG ונוגדנים חד שבטיים CD 28 אנטי אנושיים.

לאחר מכן, כדי להקל על צימוד חלבון לחרוזים, סובב את בקבוקון הזכוכית על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן, הנח את הצינור במגנט MPC אחד והסר את כל מאגר הבוראט. לאחר הסרת המאגר, שטפו את החרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של מאגר שטיפת חרוזים.

כעת דגרו את החרוזים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת חרוזים וסובבו את הבקבוקון בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות נוספות כדי לחסום את אתרי קשירת החלבון הנותרים על החרוזים. לאחר מכן הסר את המאגר מבקבוקון הזכוכית והחלף אותו במיליליטר אחד של מאגר שטיפת חרוזים טריים. העבירו 100 מיקרוליטר של מאגר שטיפת פקס לצינורות הפקס, ולאחר מכן הוסיפו חמש פעמים 10 לחרוזים החמישיים.

צבעו את החרוזים במיקרוליטר אחד של אנטי מוזה IgG, אחד PE ומיקרוליטר אחד של אנטי מוזה IgG שניים לאחר צביעה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בשלושה מיליליטר של מאגר שטיפת פקס לכל אחת מדגימות הצביעה. לאחר מכן גלולה את המחשב על ידי הוצאה ב-300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

ראוס השהה את המחשב במאגר פקס טרי וקרא את תוצאת הצביעה מיד על ידי ציטומטר זרימה. שוטפים את החרוזים פעמיים עם PBS סטרילי כמו קודם. לאחר מכן, טען את החרוזים ב -10 מיקרוליטר פפטיד CMV.

ספרו את החרוזים לפי ציטומטר המו ואז סמנו אותם עם התאריך והריכוז של החרוזים. כחרוזים למיליליטר. דגרו את ה-A A PC עם הפפטיד למשך שלושה ימים לפחות בארבע מעלות צלזיוס צנטריפוגה כ-100 מיליליטר של דם היקפי טרי מתורם HLA A שני חיוביים ב-10 צינורות ואקוטיין נתרן הפרין ב-300 גרם למשך 10 דקות.

בטמפרטורת החדר, הסר בזהירות את שכבת הפלזמה העליונה על ידי שאיפה. החלף את הפלזמה שנאספה ב-PBS סטרילי והעביר את הדם לבקבוק תרבית T 75 סטרילי. ערבבו היטב את הדם וה-PBS על ידי פיפטינג לאחר שכל הדם נאסף ב-15 מיליליטר של חבילת פיאל בתוספת ארבעה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר.

כיסו לאט לאט 30 עד 35 מיליליטר של תאי הדם על גבי הפיאל בכל צינור. שמירה על הממשק מובחן בין הפיאל לתאי הדם, צנטריפוגה של שיפוע הדם והפיאל ב-500 GS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם הניתוק והתאוצה נמוכה ככל האפשר כדי לשמור על ממשק ברור בין השכבות לאחר שהספין שואב משכבת הפלזמה העליונה ולאחר מכן השתמש בפיפטה סרולוגית כדי לשאוב בזהירות את שכבת ה-PBMC. העבירו את ה-PBMC לצינור חרוטי טרי של 50 מיליליטר כאשר כל ה-PBMC נקטפו ב-30 מיליליטר PBS לתאים וצנטריפוגה אותם.

לאחר מכן, השליכו את הסופרנט ושטפו את הגלולה. פעם נוספת עם 30 מיליליטר של PBS כדי להסיר את שאריות ה-fi ואז להעשיר עבור ה-CD שמונה אוכלוסיית תאי T חיוביים באמצעות ערכת בידוד של Milton Human CD שמונה תאי T חיוביים. על פי פרוטוקול היצרן, ספרו את התקליטור שמונה תאי T חיוביים ואשרו את הטוהר על ידי ניתוח פקס.

השעו 1 מיליון CTL בשמונה מיליליטר של גורם גדילה של תאי T, שני x מדיום תרבית ועוד שמונה מיליליטר של מדיום RPMI שלם והוסיפו פעם אחת 10 מתוך שש תערובת A, A PC. ובכן, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לצלחת 160 מיקרוליטר תאים לבאר על צלחת תרבית רקמות תחתונה של 96 באר. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך שבעה ימים.

האכילו את התאים ביום הרביעי עם 80 מיקרוליטר לבאר של גידול תאי T. גורם שני x מדיום תרבית. קצרו את התאים ביום השביעי ולאחר מכן הניחו את התאים כנגד המגנט כדי להסיר את המחשב הישן כאשר כל החרוזים נדבקים לדופן הבקבוקון.

קצרו והעבירו את התאים לצינור חרוטי נוסף של 50 מיליליטר וספרו את מספר התאים. קבע את ספציפיות האנטיגן של מחשב A A על ידי צביעת טטרמר בהתאם לפרוטוקול היצרן. הפעל מחדש את התאים שנקטפו עם מחשב A A חדש באותם תנאים כדי ליצור מספר תאים מוגבר לספציפיות אנטיגן.

להלן תוצאת צביעת טטרמר מייצגת של CTL ספציפי ל-CMV שנוצר על ידי A A PC לאחר שבוע של תרבית. מוצגת כאן תוצאת צביעת ציטוקינים תוך תאית מייצגת של CTL ספציפי ל-CMV שנוצר על ידי הספציפיות של A-A-P-C-C-M-V הייתה 61% על ידי צביעת טטרמר. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום תאי T, כגון כיצד נוכל לזהות את התנאים התרבותיים האופטימליים ואת הדרישות לאפנון תפקודי של תאי T.

השיטה הנמוכה סיפקה תובנות לטיפול במחלות ויראליות. ניתן ליישם אותו גם בתחומים אחרים כגון סרטן.