שבבי microfluidic מבוקרת עם מערכים Microvalve אלסטומרי

מיקרופלואידיקה מציעה לביולוגים של תאים טכנולוגיה לביצוע ניסויים בקיבולת גבוהה שבהם נדרש טיפול מדויק בנוזלים. שלום, אני נין צ'ן לי מהמעבדה של פולק במחלקה להנדסה ביובית, אוניברסיטת וושינגטון. היום אראה לכם כיצד להכין קצוות מיקרופלואידיים הנשלטים על ידי מערך שסתומי PDMS מיקרוסקופיים.

המכשיר מורכב משלוש שכבות. השכבה הראשונה היא השכבה הפלואידית המכילה מיקרו-תאים בגדלים שונים, והשכבה השנייה היא שכבת הבקרה המכילה תעלות בין שתי השכבות. קיימת ממברנת PMS דקה בשל ההידרופוביות והגמישות של PMS.

המעמם נסגר כנגד התבנית שלו, ובכך הוא מבודד את תאי הנוזלים זה מזה. אם נפעיל ואקום דרך ערוצי הבקרה, ממбраנת ה-PDMS יכולה להתכופף ולחבר את תאי הנוזלים שהיו מבודדים קודם לכן. היום אני אדגים לכם מערבל מקבילי המאפשר לערבב נפחים של פחות מננו-ליטר של תמיסות מימי ביחסי ערבוב שונים.

כעת, קריס מהמעבדה שלנו יעניק לכם הדגמה של מערכת מיקרופלואידיקה משולבת המאפשרת הזרמה של מספר תמיסות לתוך תרביות תאים. בואו נתחיל. כאן אני מראה לכם מאסטר עם תכונות תעלות של SU-8 על גבי פרוסת סיליקון.

התבנית המאסטר יוצרה באמצעות הליכי פוטוליתוגרפיה סטנדרטיים של SUH מהמאסטרים הללו. אנו יכולים להכין רפליקות של PDMS שוב ושוב. כדי להקל על הפרדת ה-PDMS מהמאסטרים, עלינו תחילה לבצע פסיבציה למאסטר.

אנו בדרך כלל נחשיג את התבנית באמצעות F foods מכיוון שאנו עובדים עם Florence Island. ראשית, אני מניח את הפרוסה (wafer) בתוך ה-ator ומטפטף טיפות של forest, ולאחר מכן סוגר את תא ה-desk skate, מפעיל את הוואקום, משאיר את הוואקום למשך 1, 2, 3 דקות ואז סוגר את הוואקום. מניחים לחומר להתאדות במשך חצי שעה ואז מוציאים את ה-wave drop. לפני הכנת רפליקה של MOD PDMS, עלינו לערבב מראש את ה-PDMS pre polymer ואת סוכני ההקשיה ביחס של 10 ל-1.

שקלתי 31 גרם של פרה-פולימר, ולאחר מכן שקלתי 3.1 גרם של חומרי מעבדה (curing agents) וערבבתי אותם היטב במשך חמש דקות. כך נראה המוצר המוגמר. לאחר מכן, הכנסתי את התערובת לתנור ואקום (density heat) כדי להוציא בועות אוויר מה-PS במשך 5 עד 10 דקות, עד שהחומר הפך לשקוף.

בזמן ההמתנה לסיום תהליך הוצאת בועות האוויר מה-PMS, ניתן להדביק צינורות סיליקון לאזור של שכבת הבקרה. בחרנו בצינור סיליקון מכיוון שזהו אותו רכיב של ה-PMS, כך שניתן יהיה להטמיע אותו במכשיר מאוחר יותר וליצור אטם אטום לאוויר ולנוזלים. כעת אני מוסיף מעט דבק D cement לקצה של פיסת צינור סיליקון קטנה ולוחץ אותה על אזור הכניסה של התבנית הראשית.

כדי שהצינורות לא יחריגו את המגברים, יש לוודא שצינורות הסיליקון הללו שטוחים מאוד בעת החיתוך, ואין למרוח כמות מרובה מדי של דבק על חלקם העליון. הסבירו כיצד אתם לוחצים את הדבק. בואו נראה. נוצרים אזורים הן בפתח האוורור והן בהסרת המכסה.

כעת כאשר ה-PS מוכן, אשפוך אותו מעל לתבנית (master). יש להיזהר למשוך את ה-PGAs המקיפים את הצינורות.

כעת אני שופך על התבנית הראשית השנייה, הכוללת את מאפייני שכבת הנוזלים. לאחר שפיכת ה-PS לתבניות, יש להסיר מהן בועות שוב במכשיר להסרת אבק (dust kicker) למשך 5 עד 10 דקות. לאחר הסרת הבועות, אנו מקרינים את ה-PMS בתנור בטמפרטורה של 65 עד 70 °C למשך שעה אחת עד 24 שעות.

בסדר, מצוין. לאחר שעתיים, ה-PMS עבר תהליך פולימריזציה (curing). כעת נגזור את התקן ה-PMS מהתבנית הראשית של ה-SU ונתחיל בהכנת שכבת הבקרה.

לאחר הכנסת הפיתולים, אנו מסירים את הדבק מאזורי הכניסה. במכשירים שלנו, אזורי כניסה נוצרו הן בשלוש השכבות והן בשכבות הבקרה, אך אנו מחברים את פיתול הסיליקון לשכבה אחת בלבד.

לדוגמה, כאן רק בשכבת הבקרה. כדי ליצור גישה לשכבת הנוזלים, ניתן לנקב את הממברנה מתחת לצינורות הסיליקון כדי ליצור פתח גישה. כך נוכל לגשת לכל המכשירים הללו מלמעלה, מה שמקל על ביצוע מיקרוסקופיה תחת סטראוסקופ ומיקרוסקופ הפוך מסורתי.

כעת אנו נכנסים לחדר C. כדי להכין ממбраנות CTM S, אראה לכם כיצד לסובב את ממברנת ה-PDFs באמצעות סבב ה-headway. לפני שהנחתי את הפרוסה על גבי תושבת הפרוסות, כיסיתי את הבסיס בניילון ואספתי נייר סופג מתחתיו כדי להקל על ניקוי השאריות לאחר מכן.

אם כך, לאחר שהתהליך הושלם, בדומה למה שעשינו עם התבניות לפני כן, לאחר ניקוי בשואב, אני מתיס כ-2 mL של PDMS על גבי פרוסת הסיליקון, מכיוון שאנו מעוניינים להשיג ממбраנה בעובי של 11 עד 12 µm. הפרוסה תסובב במהירות של 7,000 RPM למשך 20 שניות. כעת ניתן לראות את הפרוסה מסתובבת; נסובב אותה למשך הזמן הנדרש. לאחר הסבב, נניח את הפרוסה על לוח חימום בטמפרטורה של 85 °C למשך ארבע דקות. כעת ממбраנת ה-PDMS עברה פולימריזציה.

בשלב הבא נחמצן את ממברנת ה-P DM S ואת שכבת הבקרה בתנור פלסמה. נקבע את הספק הפלטינה על 75%, ונשתמש בלחץ חמצן של 30 PSI ובקצב זרימה של חמישה. ניתן תמיד להתאים פרמטרים אלו בהתאם ליישומים שונים.

הפעילו את המכשיר, הפעילו את הפלסמה למשך 30 שניות. כעת הניחו את שכבת הבקרה מעל לממברנה. הביאו אותן למגע; תוך מספר דקות שכבת הבקרה תיקשר לממברנה.

לאחר מספר דקות, הסירו את שכבת הבקרה יחד עם הממברנה. כעת אנו מוכנים ליישר את שכבת הבקרה אל ה-fully clear. מכיוון שאיננו נמצאים עוד בחדר נקי, נשתמש בסרט דביק (scotch tip) כדי להסיר את האבק מה-fully clear.

עלינו להסיר גם את הממברנה מאזור הכניסה של שכבות הבקרה. זאת כדי לאפשר גישה לשכבת הנוזל שמתחתיהן. לכן, הניחו את שכבת הבקרה עם הממברנה מעל שכבת הנוזל.

בדקו את כל תאי הנוזלים ואת השסתומים. ודאו שכולם מיושרים משמאל לימין. אם הם אינם מיושרים, ניתן להסיר את שכבת הבקרה ולבצע את הפעולה מחדש.

ניתן לראות כאן כי שכבת הנוזלים ושכבת הבקרה מיושרות. כעת אכניס מספר צינורות דקים יותר אל פתחי כניסה אלו כדי לחבר אותם למקורות הנוזלים ולמקורות הלחץ. כעת אחבר את השסתומים למקור הלחץ ואחבר את פתחי כניסת הנוזלים למקור הנוזלים.

כאן יש לנו שני צבעים שונים, אחד כחול ואחד צהוב, לפתיחה וסגירה של מיקרו-שסתומים מ-PDMS. אנו משתמשים בשסתומים סולנואידיים המחוברים למקור ואקום ולכוח לחץ אוויר, והשסתומים נשלטים באמצעות תוכנת LightView. כעת אני פותח את סט השסתומים מספר אחת.

ניתן לראות את ממбраנות ה-PDMS נכנעות ואת השסתומים פתוחים. כעת אני סוגר את מערכת השסתומים הראשונה, סוגר ופותח את המערכת השנייה, פותח וסוגר. כעת כל השסתומים המיקרוסקופיים פועלים.

אני אמלא את תאי המיקרופלואידיקה בשני תמיסות שונות. אני אפתח את סט השסתומים מספר אחת ואשתמש בואקום כדי למשוך את שתי התמיסות אל תוך התאים. לאחר שהתאים ימולאו בתמיסות, אסגור את סט השסתומים מספר אחת כדי לבודד כל תא, ולאחר מכן אפעיל את סט השסתומים.

שנית, כדי לערבב את הזוגות בשתי המערכים. השארת השסתום פתוח והערבוב נמשכים בדרך כלל בין דקה לשתי דקות. מכיוון שתכננו את גדלי התאים ב-10 גדלים שונים.

לכן, יש לנו יחס ערבוב של 11 יחסים שונים. לאחר סיום הערבוב, אני סוגר את השסתום, וכך ניתן לראות שבתאים הבודדים קיימים יחסי ערבוב שונים.

הצבע השתנה מכחול לירוק ואז למשחה של צהוב. לאחר הייצור, ניתן להשתמש במכשירים אלו פוטנציאלית בבדיקות ביו-רפואיות, כגון סריקת תרופות, או במחקרי ביולוגיה של התאים, כגון כימוטקסיס או תגובת תאים לריכוזים שונים של כימיקלים, גורמי גדילה או תרופות. אני כריס סיפ, ואדגים מכשיר המהווה מערכת פרפוזיה מיקרופלואידית אינטגרטיבית, והוא דומה מאוד למכשיר שנראה קודם לכן בשלב הייצור.

ההבדל היחיד והעיקרי הוא שבמקום תאים נפרדים המופרדים על ידי שסתום שמתערבבים באמצעות דיפוזיה, יש לנו מספר כניסות שמתכנסות ונשלטות על ידי שסתומים, סכמת שסתומים מרובת-ערוצים (multiplex valving scheme). מה שאדגים הוא הפעלה סלקטיבית של שסתומים, שתשלוט על פתיחה או סגירה של כניסות שונות. בנוסף, אראה את הפעולה של תעלת ערבוב משולבת וניתוב של מדרגות ריכוזים (gradients).

בחלק העליון של המסך ניתן לראות 16 פתחים הנכנסים זה לזה, כאשר הזרימה מגיעה מלמעלה דרך תעלה אנכית זו ואל תוך רשת הפיצול, שהיא תא תרבית התאים. כעת אנו רואים את הפתחים מחליפים לצבע כחול, שזורם וניתן להבחין בפרופיל הזרימה הלמינרית בעודו עובר דרך התא. כעת אנו מבצעים שילוב של כחול וצהוב, ואז נוכל להחליף זאת כדי ליצור את השילוב ההפוך.

ניתן להכווין את המעבר (gradient) שלנו לצד ימין. ניתן ליצור סוגים אחרים של מעברים. כעת מוצגת ההחלפה המהירה של השסתומים, כך שנוכל להתחלף במהירות רבה בין תמיסות שונות.

כעת אנו מזינים צבע כחול וצהוב דרך ההומוגניזטור, והתמיסה יוצאת ירוקה בתא, ואנו יכולים גם להחליף כל מספר של כניסות שונות. במקרה זה, אנו מזינים כניסה אדומה, התופסת את מקומה של כל התמיסה הירוקה. היום הצגתי בפניכם כיצד להכין התקנים מבוססי שסתום מיקרו-פסיח (micro-footed valve) והדגמתי ערבוב של שני צבעים ביחסים שונים בנפחים של פחות מליטר באופן מדויק.

כריס מהמעבדה שלנו הדגים גם מערכות מיקרופלואידיות משולבות עבור פרופוזיה (profusion) של תמיסות שונות. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.