חישת שדה מבוססת ביוסנסור של גרפן לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון

אינטראקציות חלבון-חלבון, PPIs, הן קריטיות בוויסות רוב התהליכים הביולוגיים.

כדי לזהות PPIs באמצעות חישה ביולוגית של אפקט שדה, התחל עם שבב טרנזיסטור אפקט שדה גרפן. השבב מורכב ממשטח גרפן פונקציונלי קרבוקסיל כתעלה מוליכה למחצה בין אלקטרודות המקור לניקוז.

דגרו את השבב עם תמיסה טרייה של קרבודימיד ו-N-hydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS, במאגר zwitterionic. מאגר זה יוצר pH מתאים, המאפשר לקרבודימיד וסולפו-NHS להפעיל את קבוצות הקרבוקסיל הפונקציונליות של השבב, וליצור אסטרים מגיבים לאמין.

הוסף את תמיסת חלבון היעד. האמינים הראשוניים מגיבים עם האסטרים המגיבים לאמין, ומשתקים את החלבונים על השבב באמצעות היווצרות קשרי אמיד. הוסף תמיסת מרווה המכילה אמין כדי לחסום אסטרים מגיבים לאמינים לא קשורים, ולמנוע קשירה לא ספציפית.

הכנס את השבב לקורא האלקטרוני וכייל אותו עם מאגר. הקורא מפעיל מתח קבוע בין האלקטרודות. נמדדת זרימת הזרם החשמלי המתקבלת בין האלקטרודות במצב האנליט הלא מאוגד.

הוסף את ריכוז האנליט הנמוך ביותר. האינטראקציה בין חלבוני האנליט לבין המטרות המשותקות על השבב משנה את התפלגות המטען המקומית של משטח הגרפן, שנרשמת כתגובת I - השינוי בזרימת הזרם בין האלקטרודות.

לאחר ההקלטה, שטפו עם חוצץ כדי לנתק את האנליטים הקשורים. חזור על הניתוח עם הגדלת ריכוזי האנליטים.

עלייה הדרגתית בתגובת I עם עלייה בריכוזי האנליטים מצביעה על PPIs חזקים בין המטרה לאנליט

התחל בערבוב נפחים שווים של תמיסת EDC וסולפו-NHS על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הנח את שבבי החיישן הביולוגי שסופקו על ידי החברה בצלחת פטרי מזכוכית עם מכסה מותאם. כל שלבי הפונקציונליזציה הכרוכים בהפעלת השבב מוצעים להיעשות בתוך צלחת הפטרי. החל 50 מיקרוליטר של מאגר MES מולארי אחד על שבב החיישן הביולוגי. דוגרים למשך דקה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שאפו את המאגר ומרחו 50 מיקרוליטר של תמיסת EDC/sulfo-NHS מיד על שבב החיישן. מכסים את צלחת הפטרי ודוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שאב את תמיסת ה-EDC/sulfo-NHS מהשבב, והחל 50 מיקרוליטר של מאגר MES מולארי אחד.

שאפו את מאגר MES ושטפו את השבב פעמיים עם 50 מיקרוליטר של 1x PBS. שואבים את ה-PBS מהשבב, ומוסיפים את מולקולת המטרה Hsp90. מכסים את צלחת הפטרי מזכוכית, ודוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את התמיסה המכילה את מולקולת המטרה, ושטפו שלוש פעמים עם 50 מיקרוליטר של 1x PBS.

שאפו את תמיסת ה-1x PBS מהשבב, והוסיפו 50 מיקרוליטר מתמיסת Quench 1. מכסים את צלחת הפטרי מזכוכית, ודוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את תמיסת Quench 1 מהשבב, והוסיפו 50 מיקרוליטר מתמיסת Quench 2. מכסים את צלחת הפטרי מזכוכית ודוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את תמיסת ה-Quench 2 מהשבב, ושטפו את השבב חמש פעמים באמצעות 50 מיקרוליטר של 1X PBS והשאירו את טיפת ה-PBS האחרונה על החיישן.

הכן את סדרת דילול האנליטים עבור Cdc37 בטווח הריכוז הרצוי. תכנן את הניסוי כך שיכלול לפחות שמונה ריכוזי אנליטים שונים כדי להשיג קבוע דיסוציאציה אמין או ערך K_d, והכין את הדילולים השונים הללו באותו מאגר המשמש לכיול וחלבון מטרה.

הנח את השבב בזהירות לתוך המכשיר. ודא שהתוכנה דולקת ונורית ה-LED הופכת לירוקה. לאחר מכן, לחץ על מודול "הפעל ניסוי" בתוכנה האוטומטית ובחר "10 נקודות עם התחדשות" או כל פרוטוקול רצוי אחר. מלא את הפרטים, כגון שם המפעיל, שם הניסוי, התאריך, מאגר ההתחדשות, היעד המשותק והאנליט בפתרון. לחץ על כפתור "התחל ניסוי" המוצג בתוכנה, ופעל לפי ההוראות המוצגות על ידי התוכנה האוטומטית.

כדי לבצע את כיול המכשיר, שאפו את תמיסת ה-PBS שנותרה מהשבב ומרחו 50 מיקרוליטר ממאגר הכיול. לחץ על כפתור 'המשך' והמתן חמש דקות עד לסיום שלב הכיול. התוכנה מציגה את נקודת הסיום שנקבעה לשלב הכיול עם אזעקת אזהרה למעקב.

לאחר מכן, בצע אסוציאציה אנליטית על ידי שאיבת מאגר הכיול מהשבב והחלת 50 מיקרוליטר מריכוז האנליט הנמוך ביותר. לחץ על כפתור 'המשך' והמתן חמש דקות עד לסיום שלב השיוך. התוכנה מציגה את נקודת הסיום של שלב האסוציאציה עם אזעקת אזהרה להמשיך.

כדי לבצע דיסוציאציה אנליטית, שאפו את תמיסת האנליט מהשבב ומרחו 50 מיקרוליטר ממאגר הדיסוציאציה. לחץ על כפתור 'המשך'. לאחר משך שלב הניתוק, התוכנה מציגה את נקודת הסיום של שלב הדיסוציאציה עם אזעקת אזהרה.

לאחר מכן, בצע התחדשות שבב על ידי שאיבת תמיסת הדיסוציאציה מהשבב, והחלת 50 מיקרוליטר של מאגר ההתחדשות. לאחר מכן, לחץ על כפתור 'המשך'. שלב ההתחדשות אורך בדרך כלל כ-30 שניות. לאחר מכן, התוכנה מציגה את נקודת הסיום של שלב ההתחדשות עם אזעקת האזהרה למעקב.

לבסוף, כדי לשטוף את השבב שאפו את תמיסת ההתחדשות מהשבב, ומרחו 50 מיקרוליטר ממאגר הכביסה. שאפו את התמיסה מהשבב וחזרו על כך חמש פעמים. השאירו את הטיפה האחרונה של מאגר הכביסה על השבב. לאחר מכן, לחץ על כפתור 'המשך' והמתן 30 שניות עד לסיום משך שלב הכביסה בתצוגת התוכנה.

חזור על השלבים עבור כל ריכוז אנליט בשימוש. חמשת השלבים של הכיול, האסוציאציה האנליטית, הדיסוציאציה, ההתחדשות והכביסה חמש פעמים מהווים מחזור אחד.