זיהוי העדינה של סמנים ביולוגיים באמצעות הטבעה מולקולרית מבוסס ביוסנסור קיבולי

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לזהות ולכמת ביומולקולות בשפע נמוך בדגימות מורכבות ביותר עם רגישות גבוהה, פשטות, עלות נמוכה, מהירות וללא שימוש בתיוג כלשהו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביוטכנולוגיה, הביוכימיה והביו-רפואה, כגון ניטור סביבתי, בטיחות מזון, איכות מי שתייה ואבחון רפואי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם המהירות הטבועה בה, הפשטות, הרגישות הגבוהה, העלות הנמוכה, המניפולציה הקלה והזיהוי בזמן אמת ללא שימוש בריאגנטים לתיוג.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון מחלות בשל יכולתה לכמת ביומולקולות בשפע נמוך. לדוגמה, סמנים ביולוגיים שונים בזמן אמת. כדי לנקות את כיסויי הזכוכית, טבלו אותם ב -10 מיליליטר של 1.0 HCl מולארי למשך 10 דקות בחומר ניקוי קולי בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, טבלו אותם במים נטולי יונים ונתרן הידרוקסיד 1.0 מולארי באותם תנאים. יבש את כיסויי הזכוכית בגז חנקן. לאחר מכן, טבלו את הכיסויים הנקיים והיבשים ב-10 מיליליטר של תמיסת APTES למשך שעה אחת כדי להכניס קבוצות אמינו על משטח זכוכית הכיסוי בטמפרטורת החדר.

שטפו את הכיסויים במים נטולי יונים לפני ייבושם שוב בגז חנקן. טבלו את הכיסויים ששונו על ידי APTES בתמיסה של 10 מיליליטר של גלוטרלדהיד למשך שעתיים כדי להפעיל את קבוצות האמינו על פני השטח בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את הכיסויים עם מאגר פוספט של 10 מילי-מולרי כדי להסיר עודפי גלוטרלדהיד מפני השטח.

יבש את הכיסויים בגז חנקן. לאחר מכן, הכינו 1.0 מיליליטר של תמיסת תבנית במאגר פוספט של 10 מילי-מולרי בריכוז של 0.1 מיליגרם למיליליטר. זרוק 200 מיקרוליטר של תמיסת תבנית זו על החלקות הכיסוי ששונו ודגר בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

כדי לנקות את האלקטרודות, טבלו תחילה את האלקטרודות בכוס קטנה המכילה חמישה מיליליטר של אתנול 70% למשך 10 דקות בחומר ניקוי קולי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, טבלו את האלקטרודות ברצף במים נטולי יונים, אצטון, מים נטולי יונים, תמיסת פיראנה חומצית ומים נטולי יונים באותם תנאים. יבש את האלקטרודות בגז חנקן.

כדי לבצע אלקטרופולימריזציה של טירמין, הכינו שמונה מיליליטר של תמיסת טירמין של 10 מילי-מולרית במאגר פוספט של 10 מילי-מולרית המכילה שני מיליליטר אתנול. בצע 15 מחזורים של סריקות וולטמטריות מחזוריות בפתרון זה באמצעות פוטנציוסטט המכסה תחום פוטנציאל של אפס עד 1.5 וולט וקצב סריקה של 50 מילי-וולט לשנייה. לאחר מכן, שטפו את האלקטרודות במים נטולי יונים לפני ייבוש האלקטרודות בגז חנקן.

טבלו את האלקטרודות בתמיסה המכילה 30 מילי-מולרי אקרילויל כלוריד ו-30 מילי-מולרי טרימתילאמין בטולואן בטמפרטורת החדר במהלך הלילה לפני שטיפה וייבוש האלקטרודות שוב. לפני הפילמור, הכינו תמיסת מונימר המכילה מונומרים וקרוס-לינקר ב-820 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. לאחר מכן, הכינו TEMED בנפח של 5% לנפח במים טהורים במיוחד.

הוסף 20 מיקרוליטר מתמיסת TEMED לתמיסת המונומר, וטהר בגז חנקן למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של APS טרי שהוכן לתמיסת המונומר. פיפטה 1.5 מיקרוליטר של תמיסת המונומר על פני אלקטרודת הזהב ששונה.

כעת, התחל את הפילמור על ידי הבאת חותמת התבנית למגע עם המשטח המטופל במונומר, והשאיר אותו למשך חמש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר פילמור, הסר את חותמת התבנית מהמשטח בזהירות, באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, יש לשטוף את האלקטרודה במים נטולי יונים ולייבש בגז חנקן.

טבלו את האלקטרודות במיליליטר אחד של עשרה מילומר של דודקנתאול אחד שהוכן באתנול למשך עשרים דקות על מנת לכסות חורים על פני האלקטרודה. לבסוף, שטפו את האלקטרודות במים נטולי יונים וייבשו את האלקטרודות בגז חנקן לפני אפיון פני השטח שלהן במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. הכנס את אלקטרודות הזהב הקיבוליות המוטבעות לתא הזרימה האלקטרוכימי המשולב בחיישן ביולוגי קיבולי.

הכן 100 מיליליטר של מאגר התחדשות וליטר אחד של מאגר פועל. התחל את הניתוח עם הזרקת מאגר התחדשות כדי ליצור מחדש את המערכת ומאגר הפעלה כדי לאזן מחדש את המערכת למשך 25 דקות. הכן פתרונות תבנית סטנדרטיים בטווח הריכוז הרצוי במאגר פועל.

לאחר מכן, הזרקו 250 מיקרוליטר של תמיסות סטנדרטיות אלה ברצף למערכת בתנאים אופטימליים. אפיון פני השטח של אלקטרודות הזהב מתבצע על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. משטח הזהב החשוף מוצג.

כמו כן, מוצגים בקטריופאג'ים הנצמדים לפני השטח של האלקטרודה בהגדלות שונות. מוצג כאן קשר בקטריופאג'ים בזמן אמת לאלקטרודת הזהב המוטבעת באמצעות סנסוגרמה. קו בסיס יציב נוצר לאחר התחדשות ושיווי משקל מחדש של המערכת לפני הזרקת הדגימה.

ישנם חללים ספציפיים לפאג'ים על האלקטרודה. הזרקת הבקטריופאג'ים מעוררי הדגימה מביאה לקיבול מופחת, עקב קשירת בקטריופאג'ים מטרה לחללים המוטבעים על פני אלקטרודות הזהב. עקומות כיול מראות את הקיבול המשתנה לעומת הזרקת חלבון בהזרקת בקטריופאג'ים.

מהמשוואות בגרפים אלה ניתן לחשב את ריכוז הבקטריופאג' או החלבון בדגימה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח מערכת זיהוי רגישה במיוחד, מהירה ובזמן אמת. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות ושלושים דקות, לא כולל זמני ההמתנה שביניהם.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להכין את כל התרופות טריות, באותו יום. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מדדים אחרים כמו מיקרוסקופ כוח אטומי, מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת, אליפסומטר ומדידות זווית קוונטית כדי לקבוע אם הפילמור או ההטבעה היו מוצלחים, וכדי לזהות הבדל משמעותי בין פני השטח של אלקטרודות זהב חשופות ומוטבעות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביוכימיה, הביוטכנולוגיה והביו-רפואה לחקור זיהוי רגיש במיוחד של ביומולקולה בבטיחות מזון ואבחון רפואי.

אל תשכח שעבודה עם מונומרים פונקציונליים, מקשרים צולבים, יוזמים וסוכנים אחרים יכולה להיות מסוכנת ביותר. ואמצעי זהירות כמו לבישת כפפות, חלוקי מעבדה וביצוע ניסויי הפילמור בתוך מכסה האדים, תמיד צריכים להינקט בזמן ביצוע הניסויים האלה.