Name: יחיד קרא מותאמים mRNA-Seq סוף Illumina ספריות מ -10 ננוגרם RNA סך הכל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: למדו להכין ספריות mRNA-Seq של Illumina מ-10 ננוגרם RNA בלבד באמצעות שכפול לינארי T7. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ביטוי גנים מאוכלוסיות תאים מוגבלות בקלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממכון Morgridge למחקר באוניברסיטת ויסקונסין קרן. אנו מודים קריסטה איסטמן לסיוע העריכה.

<ol><li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRT-seq+amplification-free%2C+strand-specific+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li>
<li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+consistent%2C+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li>
<li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn">http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn</a> Forthcoming.</li>
<li>ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epibio.com/item.asp?id=578">http://www.epibio.com/item.asp?id=578</a> Forthcoming.</li>
</ol>

החוקרים לגלות כי ג&#39;ת הוא מייסד, stockowner, יועץ וחבר מועצת המנהלים של נייד Dynamics International (CDI). הוא גם משמש כיועץ מדעי ויש לו אינטרסים פיננסיים טקטיקות תא גזע ונצ&#39;רס II.

פרוטוקולים נוכחי להכנת ספריות סוף לזווג דורשים בין 1 מיקרוגרם 9-2.5 10 מיקרוגרם סכום התחלתי של RNA מוחלט. כאן אנו מציגים T7 מבוסס ליניארי שלנו הגברה (T7LA) שיטה להכין גם אחד לקרוא לזווג Illumina סוף ספריות רצף ולהראות כי שיטה זו מאפשרת לדור של ספריות מ ng נמוך כמו 10 של רנ&quot;א הכל, הפקת נתונים דומה לזה של הגברה מינימלית (MinAmp) ספריות עשוי מחומר 1000 החל לקפל יותר (10 מיקרוגרם RNA סה&quot;כ). 10 ספריות ng לא רק לזהות את המספרים הכוללים דומה של גנים, אלא גם לייצר חתימות התבטאות גנים דומים (איורים 3 א ו - ב). יתר על כן, גם ספריות יחיד סוף לקרוא לזווג המיוצר על ידי השיטה T7LA דומים מאוד זה לזה (איור 3c), אשר מאפשרת לחוקרים להשוות נתונים שנוצרו על ידי ספריות עשויות גם פרוטוקול. מכיוון שמדובר בספריות היו מוכנים מן האדם RNA לתא גזע עובריים, חיפשנועבור 30 גנים תא גזע מסוים בין הספריות למצוא שכמעט כל הגנים האלה (93-100%) מזוהים הספריות עשוי לפחות 10 ng להתחיל RNA הכולל (איור 4), ובכך אימות פרוטוקול שלנו. אנו מאמינים פרוטוקול שלנו יהיה מאוד שימושי עבור חוקרים, במיוחד בנסיבות כגון תאים זרימת מיון או לייזר מיקרו גזור רקמת שם חומר המוצא היא מגבילה. בנסיבות כאלה, פרוטוקול שלנו תאפשר הדור של נתונים ביטוי גנים דומים ספריות עשוי כמויות הרבה יותר גדול מאז החל פרוטוקול שלנו מייצרת פרופילי ביטוי דומה על פני לפחות 3 סדרי גודל של רנ&quot;א ההתחלה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חברה </td><td> קיט / מגיב </td><td> קטלוג # </td><td> מיוחד תגובות </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> פיצול מגיב </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Liner Acrylamide </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC ללא טיפול במים nuclease חינם </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP להגדיר </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> מפוגל dNTPs </td><td> R0431 </td><td> עבור הכנה יחיד מדגם לקריאה בלבד </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR אשכול הדור ערכת v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> עבור הכנה יחיד מדגם לקריאה בלבד </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq ערכת v5 36 מחזורים </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> שבב Seq מדגם Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> עבור הכנה יחיד מדגם קריאה בלבד. יכול להיות מוחלף עם חוד מערבבים DNA הכנה המדגם מאסטר סט 1 # חתול E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE אשכול הדור ערכת v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> עבור הכנה לזווג מדגם רק בסוף </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> מותאמים לדוגמא סוף Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> עבור הכנה לזווג מדגם רק בסוף </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb סולם בתוספת </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli Rnase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rnase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> גדיל חוצץ 2 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA פולימראז </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-ג&#39;ל SYBR% בטוח 2 </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> כתב עילי אניהשני (עם 5X FS חיץ 0.1M DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit assay ערכת </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS קיוביט assay ערכת </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli האנזים DNA </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 DNA פולימראז </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> אולטרה טהורים מים Dnase Rnase </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> כתב עילי כפול II תקועים ערכת סינתזה cDNA </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> פריימר אקראית (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> עבור הכנה לזווג מדגם רק בסוף </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer תחל ב </td><td> N / A </td><td> עבור יחיד קראו סםple הכנה בלבד </td></tr><tr><td> IDT </td><td> אוליגו DT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> חוד </td><td> Not1 העיכול ערכת </td><td> R0189S </td><td> עבור הכנה יחיד מדגם לקריאה בלבד </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute ערכת </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy מיני קיט (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> ג&#39;ל לטיהור ערכת </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Dnase להגדיר </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute ערכת </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo מחקר </td><td> ה-DNA נקי concentrator (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

יחיד קרא מותאמים mrna-seq סוף illumina ספריות מ -10 ננוגרם rna סך הכל

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

רצף transcriptome שלמות על ידי Seq-mRNA משמש כיום באופן נרחב לבצע ביטוי גנים מוטציה העולמי, ספציפית אלל הביטוי ושאר הגנום כולו מנתח. mRNA-Seq אפילו פותח את השער לצורך ניתוח גנטי הביטוי של אי - רצף הגנום. mRNA-Seq מציע רגישות גבוהה, טווח דינמי גדול המאפשר מדידה של מספרים עותק תמליל במדגם. הגנום של Illumina מנתח מבצע רצף של מספר גדול (&gt; 10 7) של רצף קצר יחסית קורא (&lt;150 נ&quot;ב). &quot;לזווג סוף&quot; הגישה, לפיה לקרוא ארוך אחד הוא רצף בשני הקצוות שלה, מאפשרת מעקב בצמתים אחוי חלופי , הוספות ומחיקות, והוא שימושי להרכבה transcriptome דה נובו. אחד האתגרים העיקריים העומדים בפני החוקרים היא כמות מוגבלת של חומר המוצא. לדוגמה, בניסויים שבהם התאים נקצרים על ידי לייזר מיקרו לנתיחה, הכל זמין החל מ-RNAאיי למדוד ננוגרם. הכנת ה-mRNA-Seq ספריות דגימות כאלה תוארו 1, 2, אך כרוך הגברה משמעותית PCR שעשויים להציג את ההטיה. אחרים RNA-Seq הליכי הבנייה ספריה עם הגברה PCR מינימלי פורסמו 3, 4, אבל דורשים כמויות מיקרוגרם של החל RNA מוחלט. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור פלטפורמת הגנום Illumina השנייה Analyzer עבור סידור-mRNA Seq להכנת ספריה נמנע משמעותי הגברה PCR דורש רק 10 ננוגרם של רנ&quot;א הכל. אמנם זה פרוטוקול תוארה בעבר תוקף עבור יחיד סוף רצף 5, שם הוצגה לייצר ספריות כיוונית ללא החדרת הטיה הגברה משמעותית, הנה אנחנו לאמת אותו עוד יותר לשימוש בפרוטוקול סוף לזווג. אנחנו סלקטיבי להגביר RNAs שליח polyadenylated החל מ RNA סך באמצעות שיטה המבוססת T7 Eberwine הגברה ליניארית, שטבע &quot;T7LA &quot;(הגברה T7 ליניארי). מוגבר מרובה mRNAs הם מפוצלים, הפוכה יתוכתבו מתאם ligated לייצר ספריית רצף הסופי. עבור שתי ריצות יחיד סוף לקרוא יחד, רצפים ממופים transcriptome האנושי 6 ו מנורמל כך נתוני פועל מרובים ניתן להשוות. אנחנו הדו&quot;ח ביטוי גנים המדידה ביחידות של תמלילי למיליון (TPM), המהווה מדד מעולה RPKM כאשר משווים דגימות 7.

כאן אנו מתארים שיטה להכנת שני יחיד לקרוא לזווג Illumina סוף mRNA-Seq ספריות לניתוח רצפי גנים הביטוי מבוסס על הגברה T7-RNA ליניארי. פרוטוקול זה דורש רק 10 ננוגרם של רנ&quot;א הכל החל ומייצר ספריות עקבי מאוד המייצגים תמלילי כולו.

יחיד קרא מותאמים mRNA-Seq סוף Illumina ספריות מ -10 ננוגרם RNA סך הכל

ריצוף של התעתוק כולו (Whole transcriptome sequencing) באמצעות mRNA-Seq נמצא כיום בשימוש נרחב לביצוע ניתוחים של ביטוי גנים גלובלי, מוטציות, ביטוי ספציפי לאלל ו...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ליצור ספריות רצפי mRNA של Illumina מכמויות קטנות של חומר התחלתי. השלב הראשון של הפרוצדורה הוא שכתוב הפוך (reverse transcription) של RNA כולל באמצעות שבעה פריימרים של DTT כדי להפיק cDNA. ה-cDNA משמש להגברה של ה-RNA באמצעות תמלול במקום (in vitro transcription). לאחר מכן, ה-RNA המוגבר עובר פרגמנטציה אקראית.שעתוק הפוך של ה-RNA המקטע מייצר cDNA, העובר ליגציה של אפדפטורים, ברירת גודל והגברה באמצעות PCR. לבסוף, פרוטוקול זה מציג את פרופיל ביטוי הגנים של הדגימה באמצעות מדידת מספר העותקים של הגנים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת רק 10 nanograms של RNA סך הכל כחומר מוצא.כמות זו נמוכה בסדרי גודל ממה שנדרש בפרוטוקולים קיימים אחרים. יתרה מכך, ניתן לייצר בעזרתה ספריות זוגיות מכמויות קטנות כל כך של RNA התחלתי. שיטה זו תאפשר למדעים לחקור שאלות ביולוגיות חדשניות, בכך שתאפשר קביעת פרופילי ביטוי גנים מאוכלוסיות תאים שקשה להשיגן, כגון תאים שהופקו באמצעות לכידה בלייזר, מיקרו-דיסקציה או פליו Cytometry.הרעיון לפיתוח שיטה זו עלה כאשר נדרשנו לבצע פרופיל ביטוי גנים ממספר מוגבל מאוד של תאים שהובדלו מתאי גזע של שליה אנושית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי הטיפול ב-RNA קשים ללמידה בשל הכמות הקטנה מאוד של RNA שעלולה להתפרק בקלות. את הפרוצדורה ידגימו Angela Elwell, Jennifer Bolen ו-Baal Kimm Wynn מהמעבדה שלי.השיטה להכנת ספריות ריצוף של קריאה בודדת (single read) ושל קריאה זוגית (paired end) במקביל היא הליך רב-שלבי, כפי שמוצג בתרשים הזרימה זה. ראשית, RNA כולל מבודל מהתאים או מהרקמות הרלוונטיים ומשמש להכנת cDNA דו-גדילי. לאחר מכן, messenger RNAs פולי-אדנולטוריים מועשרים באופן סלקטיבי מה-cDNA באמצעות שיטת הגברה ליניארית של T7. בשלב הבא, ה-poly A המוגבר עובר פרגמנטציה אקראית.לאחר ניקוי ה-RNA המפוצל, הוא עובר תעתוק הפוך ל-cDNA. ה-cDNA עובר תיקון קצוות והוספת בסיים A לקצה ה-3' של מקטעי ה-DNA. לאחר מכן, מתבצעת ליגציה של מתאמים ועיכול באמצעות NotI. במקרה של ספריית Single-Read, ספריית ה-DNA מבודלת באמצעות טיהור בג'ל ומועשרת על ידי PCR כדי ללגט את מתאמי Illumina.לבסוף, לאחר כימות ספריית ה-DNA, היא מוכנה לריצוף. לצורכי סרטון זה, יוצגו רק נהלים נבחרים מתוך פרוטוקול זה. תעתוק הפוך של ה-polyA mRNAs המקטעים ל-cDNA כולל סינתזה של הגדיל הראשון והגדיל השני.לסינתזה של הגדיל הראשון עבור ספריית קריאה בודדת (single read library), הוסיפו למבחנת PCR את הרכיבים הבאים: 10 µL של poly mRNA מפוצמנט ו-1 µL של פריימר not one random nonamer. הרצף של פריימר not one nonamer מוצג כאן. הרצף הפרוקסימלי לקצה ' 5 המוצג בירוק הוא אתר ההגבלה של not one.בעוד שהרצף המוצג בכחול הוא המשלימה ההפוכה של רצף המתאם B של illumina מתוך ערכת רצף השבבים, דגרו את התערובת בטמפרטורה של 70 °C למשך חמש דקות בתרמוסייקלר ולאחר מכן קררו במהירות על קרח. בעוד התערובת על הקרח, הוסיפו את הרכיבים הבאים מתוך ערכת superscript 3: 4 µL של 5x first strand buffer,‏ 2 µL של DTT ו-1.5 µL של תערובת DNTP. בתערובת ה-DNTP, השתמשו ב-5-methyl-dCTP במקום dCTP. העבירו את המבחנה לתרמוסייקלר בטמפרטורה של 42 °C למשך שתי דקות ולאחר מכן הוסיפו 1 µL של superscript 3, reverse transcriptase ודגרו בטמפרטורה של 42 °C למשך שעה אחת.בשלב הבא, הכינו את התגובה לסינתזה של הגדיל הראשון עבור ספריית קצבי ה-para. הוסיפו למבחורת PCR את הרכיבים הבאים: 10 µL של poly NNA מפוצל ו-1 µL של random hexamer primer. דגרו בטמפרטורה של 65 °C למשך חמש דקות בטרמוסייקלר ולאחר מכן קררו במהירות על קרח.תוך שמירת המבחנה על קרח, הוסיפו את הרכיבים הבאים מהערכה SuperScript III First Strand: 4 µL של First Strand Buffer 5x, 2 µL של DTT ו-1.5 µL של dNTPs. דגרו בטרמוסייקלר בטמפרטורה של 45 °C למשך דקה אחת. לאחר מכן, הוסיפו 1 µL של SuperScript III Reverse Transcriptase ודגרו בטמפרטורה של 45 °C למשך שעה אחת.שתי התגובות מוכנות לסנתזת הגדיל השני. הוסיפו לכל אחת מהתערובות על קרח את הרכיבים הבאים מהערכה (superscript two): 91 µL של מים מזוקקים, 30 µL של 5x second strand buffer, 3 µL של DN NTPs, 1 µL של E. coli DNA Ligase, 4 µL של E. coli DNA polymerase ו-1 µL של E. coli RNase H. ערבבו כל מבחנה על ידי היפוך, לאחר מכן סובבו קצרt בצנטריפוגה והדגרירו בטמפרטורה של 16 °C למשך שעתיים.עבור תיקון קצוות של ה-cDNA עבור ספריית קריאה בודדת (single read library), הוסף ל-40 µL של cDNA מטוהר את הרכיבים הבאים: 5 µL של T4 DNA ligase buffer עם 10 mM ATP, 2 µL של DNTP Mix, 1 µL של T4 DNA polymerase, 1 µL של Klenow enzyme ו-1 µL של T4 PNK לתיקון קצוות של ה-cDNA. עבור ספריית קצוות זוגיים (paired end library), הוסף ל-30 µL של cDNA מטוהר את הרכיבים הבאים: 45 µL של RNase-free water.10 µL של תמיסת בופר ל-T4 DNA ligase עם 10 mM ATP, ארבעה מיקרוליטרים של תערובת dNTPs בריכוז 10 mM, חמישה מיקרוליטרים של T4 DNA polymerase, מיקרוליטר אחד של אנזים Klenow וחמישה מיקרוליטרים של T4 PNK. יש להדגיר את שני המבחנות בטרמוסייקלר בטמפרטורה של 20 °C למשך 30 דקות לאחר תיקון הקצוות (end repair).השלב הבא בפרוטוקול זה הוא הוספת בסיסי אדנין לקצה ה-3' של מקטעי ה-DNA עבור ספריית קריאה בודדה (single read library). הכינו את תערובת התגובה הבאה: 34 µL של דגימת DNA, 5 µL של תמיסת klino buffer, 10 µL של dATP ו-1 µL של klino exo. עבור ספריית קריאה זוגית (paired end library), הכינו את תערובת התגובה הבאה: 32 µL של דגימת DNA ו-5 µL של תמיסת clin out buffer.הוסיפו 10 µL של DATP ושלושה µL של clin out exo והדגירו את שתי תערובות התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות לפני הכנת התגובות לליגציה של האדפטורים. הפשיקו את האדפטורים על קרח ודללו אותם ביחס של 1:20 עבור ספריית הקריאה הבודדת (single read library). השתמשו בערכת Illumina chip sequence sample prep להכנת תערובת התגובה הבאה: 10 µL של דגימת DNA, מיקרוליטר אחד של תערובת אוליגו-אדפטורים, 15 µL של באפר DNA Ligase בריכוז 2X ו-4 µL של DNA Ligase; הדגירו למשך 15 דקות.בטמפרטורת החדר, עבור ספריית הקצוות המזווגים (paired end), השתמש בערכת הכנת הדגימות Illumina paired end כדי להכין את התגובה הבאה. ערבב 10 µL של דגימת DNA, 10 µL של תערובת האוליגואים של מתאם PE, 25 µL של תמיסות DNA ligase buffer בריכוז 2X ו-5 µL של DNA Ligase. דגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 20 °C בסיום הדגורים הרלוונטיים. נקה את שתי תגובות הליגציה באמצעות עמודי XMO.בצעו אלוציה לספריית הקריאה הבודדת (single read library) ו-44 µL של מים, ואלוציית ספריית הקריאות הזוגיות (paired end library) עם 6 µL של בופר elution, ולאחריה אלוציה נוספת ב-5 µL של EB. בצעו עיכול ב-Not1 עבור ספריית הקריאה הבודדת בלבד. דגרו למשך שעתיים עד לילה שלם ב-37 °C, ולאחר מכן טהרו את התגובה באמצעות עמודת ZY MO.בצעו אלוציה לספריית הקריאה הבודה (single read library) באמצעות ששה מיקרוליטרים של בופר eb, ולאחר מכן דילול שני עם חמישה מיקרוליטרים של eb. ה-DNA עם האדפטורים המקושרים עבור שתי הספריות מוכן כעת לבחירת גודל (size selection). את הליך בחירת הגודל עבור ה-DNA עם האדפטורים המקושרים מבצעים באמצעות 2%cyber safe EE מבית Vitrogen; כדי להתחיל בהליך זה, הפעילו את תוכנית zero pre-run למשך שתי דקות.לאחר ריצת המבחן (pre-run), טענו 10 µL של סולם 1 KB plus ואת דגימות ה-2D NA. מלאו את הנתיבים הריקים ב-10 µL של מים והפעילו תוכנית ריצה של ג'ל agarose 2% למשך 28 דקות.עם השלמת ההרצה, בחר את פרוסות הג'ל בטווח של 200 עד 300 base pair באמצעות להב תער חדש. מספר הגנים שזוהו על ידי הספריות השונות הוערך, וטבלה זו מציגה מידע על מספרי הצבדים (clusters). שיעור השגיאות בזיהוי הגנים ואחוז ההלימה של ספריות ה-single read וה-paired end עבור שתי ספריות ה-single read וה-paired end.ספריות T seven LA של 10 nanogram זיהו כמעט את אותו מספר של גנים כמו ספריות UN amplified של 10 microgram עם TPM של 10 ומעלה. במקרה של ספריות single read, ספריית T seven LA של 10 nanogram זיהתה 100% מה-8,500 גנים שזוהו על ידי ספריית UN amplified של 10 microgram עבור ספריות paradigm. ספריית T seven LA של 10 nanogram זיהתה 86% מהגנים שזוהו על ידי ספריית unpled של 10 microgram.ספריות שהוכנו מפחות מ-10 nanograms לא הצליחו לזהות מספר רב של גנים. לדוגמה, בפרוטוקול של קריאה בודדת, ספריית T seven LA של nanogram אחד זיהתה רק כ-50% מהגנים שזוהו על ידי ספריית min amp של 10 microgram. לפיכך, הכמות המינימלית של RNA כולל לשימוש בפרוטוקול T seven LA צריכה להיות מוגבלת ל-10 nanograms למיפוי של housekeeping gene.GA DH מראה כי כל ספריות ה-T seven LA שהוכנו עם לפחות 10 nanograms של RNA התחלתי זיהו את כל האקסונים, כולל האקסון הקצבי ב-five prime. סרגל המقياس משמאל עבור ספריות ה-single read מציין 350 קריאות כוללות. סרגל המقياس במרכז עבור ספריות ה-DEN מציין 5,000 קריאות כוללות.השוואה בין ספריות ה-single read וה-paired end של T seven LA בריכוז 10 nanogram לבין ספריות min amp מראה דרגה גבוהה של דמיון. מתאם ספירמן של 0.90 התקבל בין ספריית ה-single read של T seven LA בריכוז 10 nanogram לבין ספריית ה-min amp בריכוז 10 microgram, ומתאם של 0.95 התקבל בין ספריית ה-PEREN של T seven LA בריכוז 10 nanogram לבין ספריית ה-min amp בריכוז 10 microgram. בנוסף, בוצעה השוואה בין שתי ספריות ה-single read וה-peren שהוכנו מ-10 nanograms של total RNA, ומקדם המתאם הגבוה מאוד מוכיח כי שני סוגי הספריות שהוכנו באמצעות פרוטוקול T seven LA מניבים חתימת ביטוי גנים דומה מאוד.לבסוף, מכיוון שספריות אלו הוכנו מ-RNA של 30 תאי גזע עובריים אנושיים, בוצע חיפוש אחר גנים ספציפיים בתוך הספריות. כמעט כל הגנים הללו זוהו בספריות שהוכנו מ-10 nanograms לפחות של RNA כולל התחלתי, ובכך תוקף פרוטוקול זה. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור לטיפל בדגימות ה-small RNA בזהירות רבה כדי למנוע דגרדציה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכוש הבנה מעמיקה של אופן הכנת ספריות Illumina, Mr.Aeq single read ו-Paradigm מכמויות קטנות מאוד של חומר התחלתי.

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

MicroRNAs (miRNAs) הם סוג של מולקולות רגולטוריות שנשמרו באופן נרחב. כאן אנו מתארים שיטת שיבוט miRNA המסתמכת על שני שלבי קשירה חזקים ואחריהם ריצוף תפוקה גבוהה. השיטה שלנו מאפשרת כימות מדויק בכל הגנום של miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

פרוטוקול זה מדגים כיצד לטהר חוץ-תאי מיקרו Rna מאמצעי התרבות התא עבור שיפוצים קלים של ספריית RNA ורצף הדור הבא. מחסומים בקרת איכות שונים מתוארים כדי לאפשר לקוראים להבין למה לצפות כאשר עובדים עם דגימות קלט נמוך כמו exRNAs.

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

רצף Nanopore הוא טכנולוגיה חדשנית המאפשרת רצפי בעלות חסכונית במיקומים מרוחקים והגדרות משאב-עני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור רצף של mRNAs מתוך דם שלם התואם לתנאים כאלה.

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

אנו מתארים טכניקה לפרופיל microRNAs בעוברי עכבר מוקדם. פרוטוקול זה מתגבר על האתגר של קלט תאים נמוך והעשרת RNA קטנה. תוואי זה יכול לשמש כדי לנתח שינויים בביטוי miRNA לאורך זמן בנסיגות תאים שונים של עובר העכבר המוקדם.

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

הפקת RNA מן התאים Neuroprecursor שימוש Bio-Rad סך RNA Kit

למדו להכין ספריות mRNA-Seq של Illumina מ-10 ננוגרם RNA בלבד באמצעות שכפול לינארי T7. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ביטוי גנים מאוכלוסיות תאים מוגבלות בקלות.

יחיד קרא מותאמים mRNA-Seq סוף Illumina ספריות מ -10 ננוגרם RNA סך הכל

גלה סרטונים נוספים