ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

פרוטוקול זה מפרט את יצירת קווי התאים המדווחים של לוציפראז והניטור הבא של מקצבים צירקדיים אוטונומיים של תאים של ביטוי ביולומינסנציה. ראשית, לבנות מדווחי ביטוי לוציפראז לנטי-ויראלי ולייצר חלקיקים לנטי-ויראליים, להמשיך להדביק את התאים המעניינים ולהגביר תרביות נבחרות. לאחר מכן עקוב אחר ביטוי הביו-לומינסנציה בתאי דיווח מסונכרנים באמצעות מכשיר הקלטה מתאים.

בסופו של דבר, הקלטת ביולומינסנציה משמשת להדגמת מקצבים צירקדיים אוטונומיים של תאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טרנספקציה חולפת והגנת קו הנבט הוא ש-VIR מתווך. הגן מספק אינטגרציה יציבה בגנום התאים, כמו גם יעילות ורבגוניות רבה יותר.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר השעון. לדוגמה, האם יש שעונים ביולוגיים ספציפיים לרקמות? אם כן, מהן התכונות של שעונים ביולוגיים ספציפיים לרקמות?

אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני שעון. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון דינמיקה של מחזור התא, גידול וכו'. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר החלטנו לחקור שעוני אבטחה ספציפיים לרקמות או לסוג תא.

ידגימו את ההליך ד"ר צ'יטה נורם מפקין, פוסט-דוקטורנטית, וסנדרה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי Atory. בדרך כלל, מבנה מדווח צירקדי של יונקים מכיל קלטת ביטוי שבה מקדם צירקדי מתמזג עם הגן לוציפראז. בדיווח לנטי-ויראלי זה, הלוציפראז המעורער נמצא בשליטת העכבר לשני מקדמים.

להנחיות מפורטות על בניית וקטורי מדווח על ידי תגובת רקומבינציה, עיין בכתב היד הנלווה לטרנספקציה יעילה. התחל בתרבית של תאי כליה עובריים אנושיים בעלי מספר מעבר נמוך שהם 90 עד 100% מתלכדים. עכשיו לציפוי שש, ובכן צלחות תרבות.

לצורך הטרנספקציה, הוסף מיליליטר אחד של 0.001% פולי L ליצין לכל אחד, דגר אותו היטב בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ושטוף פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, קצרו את התאים באמצעות טריפסין וזרעו את התאים על כל באר של הצלחות המצופות מראש. סובב את הצלחות כדי לקבל פיזור אחיד של תאים.

ודא שהתאים שנזרעו הגיעו למפגש של 80 עד 90% בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הכן את תערובת טרנספקציית הפלסמיד של פלסמיד מדווח לנטי-ויראלי, DNA ושלושת וקטורי האריזה כבקרה הן לטרנספקציה והן לזיהום שלאחר מכן. כלול באר נוספת עבור וקטור ביטוי GFP lentiviral המכיל את החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר בשליטת מקדם ה-CMV.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של 0.25 סידן כלורי מולרי לפלסמידים וערבב היטב. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר של שתי תמיסות XBBS ומערבבים בעדינות אך ביסודיות. דגרו את תערובת ה- DNA בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

בזמן ההמתנה, החלף את המדיום מתאי 2 9 3 T בשני מיליליטר מדיום טרי. החזירו את הצלחת לחממה למשך 10 דקות לפחות כדי לאזן את ה-pH הבינוני. לאחר מכן, בצורה טיפתית, הוסיפו את תערובת הטרנספקציה לתאים, סובבו את הצלחת בעדינות והתבוננו בהיווצרות חלקיקים תחת מיקרוסקופ, ולאחר מכן הניחו את התאים באינקובטור למשך הלילה.

כ-16 שעות לאחר הטרנספקציה ממלאים את המדיום בשני מיליליטר של DMEM טרי ותרבית למשך הלילה. לאחר מכן, כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה, הערך את ביטוי ה-EGFP בתאי הבקרה של הטרנספקציה. יעילות טרנספקציה של 90 עד 100% עם ביטוי EGFP גבוה היא מנבא אמין להכנה ויראלית טובה.

קצור את המדיום המכיל צנטריפוגה של חלקיקים נגיפיים זיהומיים המופרשים כדי להסיר את שאריות תאי ה-T 2 9 3 ולאסוף את הנגיף המכיל סופרנט. ביום השלישי זרע כ-12,003 T שלושה תאים בתרבית צלחת של 12 בארות למשך הלילה לשטף של 20 עד 30% וצפה בתאים ביום הרביעי. עדיין ביום הרביעי, הוסף מוח פולי למדיום שנאסף המכיל חלקיקים נגיפיים וערבב היטב על ידי פיפטינג.

כעת שאפו את המדיום משלושת תאי ה-T והוסיפו מיליליטר אחד של תערובת ויראלית לכל באר. דגירה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לאחר שטיפת תאים פעם אחת עם PBS, חידוש המדיום ודגירה של התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה להתאוששות וצמיחה. כאשר קונפלואנט פיצל את התאים ותרבית למשך הלילה למחרת.

כדי להתחיל בבחירת תאים נגועים, הוסף מדיום טרי המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר. מלבד בלסטי, חומצת הפיצוץ במכונית ההרג צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל קו תאים. מלאו את המדיום המכיל בלסטין כל יומיים-שלושה לבחירה רציפה של תאים עמידים לאנטיביוטיקה.

מבטא כתבי שעון. לאחר הפצת תרבית תאי המדווח העמידים לבלסטין לצלחות תרבית של 35 מילימטר עד להתלכדות, אנו מכינים בדרך כלל שלוש מנות או יותר לכל קו תאים מדווח בכל תנאי לפנוטיפ סארסי. לאחר שטיפה אחת עם PBS הוסף DMEM המכיל 10 פורלין מיקרומולרי או 200 ננו-מולרי דקסמתזון מודגר 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לסנכרן את התאים.

כעת הניחו את התאים במדיום הקלטה טרי. מכסים את כלי התרבות בהחלקות כיסוי סטריליות של 40 מילימטר ואוטמים במקומם בשומן ואקום למניעת אידוי. טען את הכלים על הלומינומטר של מחזור הלומוס והתחל את הביו-לומינסנציה בזמן אמת.

הקלטה להקלטת 96 לוחות ישנים. עם מכשיר ההקלטה GSR two ראה כתב יד accomp. אנו רושמים בקלות את הקצב במשך חמישה עד שבעה ימים בתוכנית ניתוח מחזור הלום.

קו הבסיס הראשון מתאים לנתונים הגולמיים. לאחר מכן השתמש בנתונים המופחתים של קו הבסיס כדי להתאים לגל סינוס ולקבוע את הפרמטרים הנדרשים עבור דגימות המציגות מקצבים מתמשכים. טוב של רגליים למעלה נתונים מ 90% מושג בקלות עקב Luminate חולף גבוה.

חוש למעלה ושינוי בינוני. בדרך כלל אנו מוציאים את המחזור הראשון של הנתונים מהניתוח שלנו להצגת הנתונים. התווה נתונים גולמיים כנגד הזמן בעת הצורך.

שרטט את הנתונים החסרים בקו הבסיס כדי להשוות משרעת ופאזה הן בטרנספקציה חולפת של 2 9 3 תאי T והן בזיהום של קווי תאים. תמונות פלואורסצנטיות של תאים המבטאים GFP שעברו טרנספטציה וטרנספורמציה מצביעות על כך שמערכת העברת הגנים המתווכת לנטי-ויראלית יעילה ביותר. לולאת המשוב המרכזית של שעון ביולוגי מורכבת מגורמי שעתוק הפועלים על מרכיבי המשפר הצירקדי כדי לייצר ביטוי גנים קצבי.

כאן, ארבעה מבני מדווח שונים בשלושה תאים T מייצרים שלבים שונים של ביטוי מדווח. ניתן ליצור שלבי ביניים חדשים עם ויסות קומבינטורי על ידי מספר אלמנטים צירקדיים באמצעות הפלת גנים באמצעות RNAi ותרכובות פעילות פרמקולוגית. ניסוי זה השתמש בלומינומטר מחזור לום לרישום ביולומינסנציה של תאים בצלחות של 35 מילימטר בתאי U2 OS.

אירנה שימשה כדי להאיר את ההשפעות של בכי אחד ובכי שני גנים. כאן נעשה שימוש בלומינומטר סינרגיה לרישום ביולומינסנציה של תאים. בצלחת 96 בארות בשלושה T שלושה תאי דיווח.

RNA שימשו להערכת ההשפעות של נוקדאון משולש על מקצבים תאיים. בדוגמה זו, מערכת UX ולומינומטר טקאן שימשו לרישום ביולומינסנציה של תאים ב-384. בעוד שצלחות כפי שצוין נבחרו, מולקולות קטנות יכולות למקד פרמקולוגית ולהפריע לתפקוד החלבון במקצבים תאיים של תאים מדווחים של U2 OS.

לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום הביולוגיה הצירקדית כדי לחקור מנגנוני שעון ופיזיולוגיה בסוגי תאים ורקמות שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, הוא אמור להבין היטב כיצד לייצר לוציפר, לדווח על קווי תאים ולפקח על אמצעי האחסון.

ואל תשכח שעבודה עם ה-VIR יכולה להיות הוראות סכנה ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי המניעה, כגון הגנות אישיות וטיהור ויראלי בעת ביצוע הליך זה.