ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

פרוטוקול זה מפרט את יצירת קווי תאי דגם עם רפורטר לוסיפראז (luciferase reporter) ואת הניטור העוקב של מקצבים צירקדיים אוטונומיים של ביולומינסנציה בתאים. ראשית, יש לבנות רפורטרים לביטוי לוסיפראז באמצעות וקטורים לנטיביריאליים ולהפיק חלקיקי לנטיבירוס, ולאחר מכן להדביק את התאים הרלוונטיים ולהגדיל תרביות נבחרות. לבסוף, יש לנטר את ביטוי הביולומינסנציה בתאי דגם מסונכרנים באמצעות מכשיר הקלטה מתאים.

בסופו של דבר, הקלטת ביו-לומינסנציה משמשת להדגמת מקצבים צירקדיים אוטונומיים של תאים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טרנספקציה זמנית והגנה על קו הנבט (germline protection), הוא ש-VIR מתווכת את התהליך. הגן מספק אינטגרציה יציבה לתוך הגנום של התאים, וכן יעילות וורסטיליות גבוהות יותר.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחום מחקר השעון הצירקדיאני. לדוגמה, האם קיימים שעונים צירקדיאניים הספציפיים לרקמה? אם כן, מהם המאפיינים של שעונים צירקדיאניים ספציפיים לרקמה?

אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני השעון הביולוגי, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרים, כגון דינמיקה של מחזור התא, תהליכי קרצינוגנזה וכדומה. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר החלטנו לחקור שעונים ביולוגיים הספציפיים לרקמה או לסוג תא מסוים.

את הפרוצדורה ידגימו ד"ר Chita Norm Napkin, פוסט-דוקטורנטית, וסנדרה, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלי, Atory. בדרך כלל, מבנה של רפורטר לצמיאות יוממיות ביונקים מכיל קסטת ביטוי שבה מקדם צמיאות יוממי מחובר לגן הלוציפראז. ברפורטר הלנטי-ויראלי הזה, הלוציפראז הבלתי יציב נמצא תחת בקרה של מקדם per2 של עכבר.

להוראות מפורטות על בניית וקטורים רפורטרים באמצעות תגובת רקומבינציה, עיינו בכתב היד המצורף להעברה יעילה (transfection). התחילו עם תרבית של תאי כליה עובריים אנושיים עם מספר מעברים נמוך, שהם בדרגת התמזגות (confluency) של 90% עד 100%. כעת, יש לצפות פלטות תרבית בעלות שישה בארות.

עבור הטרנספקציה, הוסיפו מיליליטר אחד של 0.001% poly L lycine לכל באר, הדגירו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ושטפו פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, קצרו את התאים באמצעות trypsin וזרעו אותם בכל באר של הפלטות המצופים מראש. סובבו את הפלטות כדי להשיג התפלגות אחידה של התאים.

וודאו שהתאים שנזרעו הגיעו למסנכרניות (confluence) של 80% עד 90% בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliters. הכינו תערובת טרנספקציה של פלסמיד דורש (reporter plasmid) לנטיבירי, DNA ושלושת וקטורי האריזה כשליטה הן לטרנספקציה והן להדבקה העוקבת. הוסיפו באר נוספת עבור וקטור ביטוי לנטיבירי של GFP הנושא את החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר תחת בקרתו של מקדם CMV.

לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של calcium chloride בריכוז 0.25 M לפלסמידים וערבבו היטב. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת two XBBS וערבבו בעדינות אך ביסודיות. דגרו את תערובת ה-DNA בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

בזמן ההמתנה, החליפו את המצע של תאי 2 9 3 T בשני מיליליטרים של מצע טרי. החזירו את הפיתה לאינקובטור למשך 10 דקות לפחות כדי לאפשר התאמה של ה-pH של המצע. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת הטרנספקציה לתאים בטיפות, סובבו את הפיתה בעדינות, עקבו אחר היווצרות החלקיקים תחת מיקרוסקופ, ואז הכניסו את התאים לאינקובטור למשך הלילה.

כ-16 שעות לאחר הטרנספקציה, יש להשלים את המצע באמצעות שני מיליליטרים של DMEM טרי ולגדל למשך לילה. לאחר מכן, כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה, יש לבחון את ביטוי ה-EGFP בתאי הבקרה לטרנספקציה. יעילות טרנספקציה של 90% עד 100% עם ביטוי גבוה של EGFP היא מנבא מהימן להכנה ויראלית טובה.

אספו את המצע המכיל חלקיקי נגיף זיהומיים מופרשים, סנטריפוגו כדי להסיר את תאי ה-2 9 3 T השאריים ואספו את העל-נוזל (supernatant) המכיל את הנגיף. ביום השלישי, זרעו כ-12, 003 תאי T three בצלחת 12 בארות, תרבתו למשך לילה עד להגעה ל-20% עד 30% התכנסות (confluency) ובחנו את התאים ביום הרביעי. עדיין ביום הרביעי, הוסיפו poly brain למצע שנאסף המכיל את חלקיקי הנגיף וערבבו היטב באמצעות פיפוט.

כעת יש לשאוב את המצע משלושת תאי ה-T3 ולהוסיף מיליליטר אחד של תערובת נגיפית לכל באר. לאחר דגירה ב-37 degrees Celsius למשך לילה ושטיפת התאים פעם אחת עם PBS, יש להחליף את המצע ולדגור את התאים ב-37 degrees Celsius למשך לילה לצורך התאוששות וצמיחה. כאשר התאים יגיעו למצב של התלכדות (confluence), יש לפצל אותם ולתרבם למשך לילה ביום למחרת.

כדי להתחיל את סלקציית התאים המודבקים, הוסיפו מצע טרי המכיל 10 µg/mL של Blasticidin. את ריכוז ה-Blasticidin הנדרש להורגת התאים יש לקבוע באופן אמפירי עבור כל סוג תא. יש להחליף את המצע המכיל Blasticidin מדי יומיים עד שלושה ימים כדי להבטיח סלקציה רציפה של תאים העמידים לאנטיביוטיקה.

ביטוי של רporters של השעון הביולוגי. לאחר העברת תרביות תאי ה-reporter העמידים ל-blastin לצלחונות תרבית של 35 מילימטר עד להגעה למצב של confluent, אנו מכינים בדרך כלל שלושה צלחונות או יותר עבור כל קו תאי reporter תחת כל תנאי לבדיקת הפנוטיפ של sarcy. לאחר שטיפה אחת עם PBS, נוסיף DMEM המכיל 10 micromolar forline או 200 nanomolar dexamethasone ונדגיר ב-37 degrees Celsius למשך שעה אחת כדי לסנכרן את התאים.

כעת העבירו את התאים למצע הקלטה שהוכן טרי. כסו את צלחוני התרבית בכיסויי זכוכית סטריליים במידה של 40 מילימטרים ואטמו אותם באמצעות גריז ואקום כדי למנוע התאיידות. העמיסו את הצלחונים בלומינומטר מסוג lumous cycle והפעילו את מדידת הביולומינסנציה בזמן אמת.

הקלטה לצורך הקלטה של 96 לוחות ישנים. עם שני מכשירי הקלטה מסוג GSR, ראו את כתב היד המצורף. הקלטנו בקלות את המקצב למשך חמישה עד שבעה ימים בתוכנת Lum Cycle Analysis.

ראשית, בצעו התאמה של קו הבסיס (baseline fit) לנתונים הגולמיים. לאחר מכן, השתמשו בנתונים לאחר חיסור קו הבסיס כדי לבצע התאמה לגלי סינוס ולקבוע את הפרמטרים הנדרשים עבור דגימות המראות מקצבים עקביים. התאמה טובה של הנתונים (goodness of fit) מעל 90% מושגת בקלות בשל לומיננסה חולפת גבוהה.

סנס-אפ (Sense up) והחלפת מצע. בדרך כלל אנו מוציאים את מחזור הנתונים הראשון מהניתוח לצורך הצגת הנתונים. יש להתוות את הנתונים הגולמיים כפונקציה של הזמן במידת הצורך.

שרטט את הנתונים לאחר הפחתת קו הבסיס כדי להשוות את האמפליטודה והמופע הן בטרנספקציה זמנית של תאי 2 9 3 T והן בהדבקה של שורות תאים. תמונות פלואורסצנטיות של תאים המבטאים GFP אשר עברו טרנספקציה וטרנסדוקציה מעידות על כך שמערכת העברת הגנים המתווכת על ידי לנטי-וירוס היא יעילה ביותר. לולאת המשוב המרכזית של השעון הצירקדי מורכבת מגורמי שעתוק הפועלים על אלמנטים משפרי צירקדיים כדי להפיק ביטוי גנים מחזורי.

כאן, ארבעה מבני רב-דיווח (reporter constructs) שונים בשלוש תאי T3 מייצרים שלבים נפרדים של ביטוי הדיווח. ניתן להפיק שלבי ביטPayout ביניים חדשניים באמצעות ויסות שילובי של מספר אלמנטים צירקדיים, תוך שימוש בהשתקה גנית באמצעות RNAi ותרכובות פעילות פרמקולוגית. בניסוי זה נעשה שימוש במד-אור (luminometer) מסוג lum cycle להקלטת ביולומינסנציה של תאי U2 OS בצלחות בקוטר 35 מילימטר.

נעזרנו ב-Irna כדי להאיר את השפעות ההש चलת (knockdown) של הגנים cry one ו-cry two. במקרה זה, נעשה שימוש בלומינומטר סינרגיה להקלטת ביולומינצנציה של תאים. בלוח של 96 בארות, בשלושה תאי דגמאי T three.

RNA-ים שימשו להערכת ההשפעות של knockdown משולש על מקצבים תאיים. בדוגמה זו, מערכת UX ומכשיר luminometer של Tecan שימשו להקלטת ביולומינצנציה של תאים בלוחיות 384. בעוד שמתבצעת בחירה בלוחיות כפי שצוין, מולקולות קטנות יכולות לטרגט באופן פרמקולוגי ולהפריע לתפקוד חלבונים במקצבים תאיים של תאי reporter מסוג U2 OS.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך למחקר בתחום הביולוגיה הצירקדיאנית לחקר מנגנוני השעון והפיזיולוגיה בסוגים שונים של תאים ורקמות. לאחר צפייה בסרטון זה, הלומד אמור להגיע להבנה טובה של האופן שבו יוצרים קווי תאים המדוחים לוסיפרהז (Luciferase) ומנטרים את הנפחים.

ואל תשכחו כי עבודה עם ה-VIR עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון מיגון אישי ודקונטמינציה ויראלית, בעת ביצוע הליך זה.