דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

הפרוטוקול מדגים כיצד להפיק ביעילות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם מארבעה מיליליטר של דם פריפריאלי. ביום אפס, בודדים ומרבים את התאים חד-גרעיניים מדגימת הדם הפריפריאלית. מבצעים טרנסדוקציה של התאים הראשוניים באמצעות וקטור השבחה (reprogramming stem co vector).

ביום התשעי, העבירו את התאים שעברו טרנסדוקציה לצלחות עם פיברובלסטים עובריים של עכבר שאינם פעילים, וטפחו אותם למשך כשלושה שבועות. בחרו מושבות דמויות HESC להרחבה ולאפיון. תוצאות צביעה אימונופלורסצנטית לבדיקת ביטוי של סממני פלוריפוטנציה כגון SSEA4, TRA-1-60 ו-TRA-1-81.

הדגמה של יצירה יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מושריים. השימוש בווקטור אנטי-ויראלי לתאי גזע כדי לייצר תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מושריים מציע מספר יתרונות על פני שיטות קיימות אחרות. ייתכן שהיתרון המושך ביותר הוא הפשטות הכוללת של הגישה, שכן היא דורשת גישה קלה לרקמת תורם, ובכך אני מתכוון לדגימות נגישות של דם פריפריאלי.

המאפיינים החשובים ביותר של שיטה זו הם היעילות של תכנות ה-rep ואיכותם של שיבוטי תאי ה-IPS שהתקבלו. את הפרוצדורה ידגימו Andrea January Summer, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי, ו-Sarah Rozelle, סטודנטית לתואר מתקדם במעבדתו של George Murphy. הכל ביום אפס.

שאבו ארבעה מיליליטרים של דם פריפרי באמצעות וקו-טיינר (vacutainer) להכנת תאים עם נתרן ציטראט. הפכו את המבחנה שמונה עד 10 פעמים בתוך שעתיים מרגע האיסוף. סובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 1,800 G למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את התאים המונונוקליאריים.

שאבו את הפלזמה והעבירו בעזרת פיפט את ה-buffy coat (שכבת התאים הנמצאת בין מחסום הג'ל לפלזמה). העבירו את ה-buffy coat לפרועת צנטריפוגה קונית סטרילית בנפח 15 מיליליטר והביאו את הנפח הכולל ל-10 מיליליטר באמצעות PBS סטרילי. הפכו את הפרועות מספר פעמים וסובבו בצנטריפוגה ב-300 G למשך 15 דקות.

יש להשעות מחדש את משקע התאים ב-10 milliliters של PBS סטרילי, לבצע ספירת תאים ולאחר מכן להעביר 1-2 × 10⁶ תאים למבחנה צנטריפוגית סטרילית של 15 milliliters. יש לאסוף את התאים באמצעות צנטריפוגציה ולהשעות מחדש את המשקע ב-2 milliliters של מצע הרחבה (expansion medium). לאחר מכן, יש לזרוע את התאים המונונוקליאריים המבודדים בבאר אחת של פלטת 12 בארות ולגדל בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.

קצרו את התאים הנותרים באמצעות סנטריפוגציה והקפיאו מלאים של כ-2×10⁶ תאים למבחנה ב-FBS המכיל 10% DMSO בימים השלישי והשישי. העבירו את התאים למבחנה קונית סטרילית של 15 מיליליטר ושטפו את הבאר פעם אחת עם מיליליטר אחד של מצע תאי גזע QBSF 60. כדי לאסוף את התאים הדבקים.

קצרו את התאים באמצעות סנטריפוגציה, וסספנדו מחדש את משקע התאים בשני מיליליטר של em. לאחר מכן, העבירו את סספנדת התאים לבאר אחת בלוחית 12 Well והחזירו את התרבית לאינקובטור ביום התשעה. העבירו את התאים למבחנה קונית סטרילית של 15 מיליליטר ושטפו את הבאר פעם אחת במיליליטר אחד של מצע תאי גזע QB SF 60. כדי לאסוף את התאים הדבקים, סנטריפוגו את התרבית ב-300 G למשך 10 דקות.

בשלב הבא, השעו שוב את משקע התאים במיליליטר אחד של EM טרי המכיל 5 µg/mL של poly brain ו-STEM lentivirus עבור MOI של 1 עד 10. לאחר מכן, העבירו את התרחוף לבאר אחת בלוח של 12 בארות וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 2,250 RPM למשך 90 דקות בטמפרטורה של 25 °C. הוסיפו מיליליטר אחד נוסף של EM טרי המכיל 5 µg/mL של poly brain, כך שיהיו סך הכל 2 mL של EM, והעבירו את הלוח לאינקובטור תרביות תאים ביום ה-10.

לאחר קצירת התאים כפי שהודגם קודם לכן, השביה מחדש את משקע התאים בשני מיליליטר של תרבית EM. עבור התאים שעברו טרנסדוקציה בבאר אחת של פלטה בעלת 12 בארות ביום 11, צפה את בארות הפלטה בעלת 6 בארות ב-0.1% gelatin, ולאחר מכן זרע פיברובלסטים עובריים של עכבר מנוטרלים בריכוז של 2×10⁵ תאים לבאר בתווך meth. הכן שלוש בארות לכל זיהום.

ביום למחרת, קצרו את התאים חד-גרעיניים שעברו טרנסדוקציה כפי שהודגם קודם לכן. לאחר סנטריפוגה, השעיקו מחדש את משקע התאים בשלושה מיליליטר של מצע meth המכיל BFGF, חומצה אסקורבית וגורמי גדילה.

כעת שאבו את המצע מלוח ה-MES, בקצב של מיליליטר אחד של MCs לכל באר OFMs. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 מיליליטר של מצע meth מלא וסובבו את הלוח בצנטריפוגה במהירות של 500 RPM בטמפרטורה של 25 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך יומיים, החל מהיום ה-14 ואילך.

יש להשלים את המצע מדי יומיים ב-2.5 milliliters של מצע meth המכיל 10 nanograms per milliliter של BFGF ו-50 micrograms per milliliter של ascorbic acid, ללא גורמי גדילה. בסביבות היום ה-20, ברגע שמופיעות מושבות קטנות, יש להזין את התאים מדי יום ב-two milliliters של מצע תאי גזע עובריים אנושיים בין הימים 30 ל-40. יש לבודד כל מושבה ולהעבירה לבארים בודדות בלוח 12 Well, כאשר לפני כן יש להוסיף maths מנוטרל המכיל one milliliter per של מצע HESC בתוספת rock inhibitor, ולהזין את התאים מדי יום.

לאחר מכן, עם מיליליטר אחד של מצע HESC ללא מעכב ה-rock, תאי הגזע הפלוריפוטנטיים שהופקו ממונוציטים אנושיים מוכנים כעת לצביעה אימונופלואורסצנטית של סמני פלוריפוטנטיות וכן להוצאה של קסטת התכנות מחדש המשולבת. במהלך פרוטוקול זה, התאים עוברים מספר שינויים מורפולוגיים מ-P BMCs ועד ליצירת human I PSCs. ביום אפס, תאים חד-גרעיניים שהבודדו מדם פריפריאלי תורגש במצע הרחבה לאחר תשעה ימים.

נצפים אשכולות של ענבים הדומים לצבירי תאים, מה שמעיד על כך שהתאים בריאים ומתרבים לפני התעתוק. בסביבות היום ה-21 לאחר זריעת התאים על MAs נוצרו מושבות. ביום ה-30, מושבות ה-IPSC מראות מורפולוגיה טיפוסית הדמומה לתאי גזע עובריים אנושיים.

ניתוח אימונופלואורסצנציה זה של IPCs שהופקו מ-pbmc מראה ביטוי של סמני הרב-פוטנציאליות SSEA 4, TRA-1-60 ו-TRA-1-81. ה-iPSCs נצבעים גם באופן חיובי לפוספטאז אלקלי. תמונות אלו מראות את השלבים להפקת IPCs נטולי טרנסגן באמצעות טרנספקציה של פלסמיד המבטא CRE recombinase וגן לעמידות לפורימייצין, כפי שמתואר ב-summers et al 2010; בהשוואה ל-IPCs לפני הטרנספקציה, נצפה מוות תאי.

לאחר יומיים של סלקציה באמצעות purmycin, מוסיפות להופיע מושבות חדשות מתאים עמידים כ-10 ימים לאחר הטרנספקציה. ניתוחי southern blot של מושבות נבחרות מאשרים את כריתת הגן הזר (transgene). נמסים (lanes) 1, 3, 5 ו-7 מראים את נוכחות הגן הזר בשיבוטי iPSC לפני הכריתה. פסים אלו אינם מופיעים בנמסים 2, 4, 6 ו-8 לאחר כריתת הגן הזר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם תהיו מסוגלים לייצר באופן עקבי וחסון תאי iPSC אנושיים באיכות גבוהה, תקינים או ספציפיים למחלה, מכמויות קטנות של דם פריפרי מכל פרט.

גישה זו מפשטת את תהליך התכנות של ה-rep כדי להרכיבו לנגישות רחבה עבור קהילת תאי הגזע. במקביל, היא מספקת קו בסיס ליצירת אוכלוסייה הומוגנית יותר של קווי תאי גזע.