Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale
7 באוגוסט 2014
פלטפורמת electroporation סייע מערבולת microfluidic פותחה למסירה רציפה של מולקולות מרובות לתוך אוכלוסיות תאים זהות עם שליטה מדויקת ובלתי תלויה מינון. electroporation צעד טיהור תא המטרה שקדמו מבוסס גודל של המערכת סייע לשפר את יעילות אספקה מולקולרית וכדאיויות תא מעובד.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להחדיר סוגים שונים של מולקולות בעלות משמעות ביולוגית באופן סדרתי ובמינון שניתן לבקרה ביעילות גבוהה באמצעות פורר מיקרופלואידי בעזרת מערבולות (Vortex assisted microfluidic porer). דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת ארבעה מבחנות צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר, המכילות כל אחת תמיסות DPBS עם תאים ומולקולות ביולוגיות, וחיבור כל מבחנה למחזיק הבקבוק המתאים המחובר למערכת בקרת הזרימה הפנאומטית. השלב השני הוא להחדיר את צינורות הכניסה מכל בקבוק בהתאמה אל תוך ההתקן המיקרופלואידי הכולל אלקטרודות של 15 פינים. לאחר מכן, התאים זורמים אל תוך ההתקן שבו הם נלכדים במערבולות במיקרו-קנה מידה הנוצרות בתאי האלקטרופורציה.
השלב הסופי הוא הפעלת פולסים חשמליים קצרים על התאים הלכודים, ולאחריהם מיד הזרקת התמיסות המכילות את הביומולקולות המיועדות למסירה לתוך הציטוזול. לבסוף, ניתן לשחרר ולאסוף את התאים שהתקבלו מתהליך זה לצורך אנליזות המשך. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהטכניקה המוצעת מסוגלת להעביר באופן רצפי כמויות מבוקרות של מולקולות מרובות לתוך אוכלוסיית תאים זהה שנבחרה מראש, ביעילות גבוהה ובשמירה על חיוניות התאים.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי חילוף הנוזלים קשים ללמידה בשל כך שהתזמון של שלב הזרימה הקרה בכל שלב של החלפת התמיסות קובע את יציבות לכידת התאים. בניסוי זה תישמש שורת תאי סרטן שד גרורתיים M-D-A-M-B 2 31 בריכוז של 10⁵ תאים למילליליטר בנפח של 10 מילליליטר לכל בקבוק תרבית רקמה T 75 בתווך Leibovitz's L 15 מועשר ב-10% v/v סרום עגל עוברי ו-1% פניצילין.
הדגרירו את התאים בסטריפטומייצין באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובסביבה של 0% carbon dioxide. יומיים לאחר הזריעה, קצרו את התאים לצורך הניסויים. לאחר שטיפת התאים בבופר פוספט סלין (PBS) או DPBS, טפלו בתאים ב-0.25% trypsin EDTA למשך שתי דקות.
הוסיפו שמונה מיליליטר של מצע גידול כדי לנטרל את הפעילות האנזימטית, השקיעו את התאים על ידי סרטיפוגציה למשך חמש דקות ב-200 ×g וסספندو מחדש במצע לריכוז סופי של 5 × 10⁵ תאים למיליליטר. התכנון והבנייה של התקן האלקטרופורציה מיקרופלואידי לא יוצגו בסרטון זה, אך הם מתוארים בכתב היד הנלווה. המערכת כוללת כניסות עבור תאים, מולקולות ותמיסת שטיפה.
שני תעלות ישרות שבהן מתרחש מיקוד אינרציאלי. 10 תאי אלקטרופורציה עם אלקטרודות ופתח יציאה להקמה של ניסויי זרימה. הכנס פתח יציאה, צינורית poly ether ether ketone או PEEK, ואת אלקטרודת האלומיניום בעלת 15 הפינים להפעלת מתח גבוה בפולסים קצרים, אל המקומות הייעודיים דרך החורים במיקרו-תעלה.
אלקטרודת 15 הפינים מורכבת מ-10 אלקטרודות חיוביות וחמש אלקטרודות שליליות. המרחק בין כל אלקטרודה חיובית לאלקטרודה שלילית הוא 1.5 millimeters, והמרחק בין כל שתי אלקטרודות בעלות קוטביות זהה הוא 1.35 millimeters. חברו את הציוד החשמלי ליצירת פולסי גל ריבועי קצרים במתח גבוה לאלקטרודות האלומיניום שנמצאות במגע עם התמיסות הזורמות.
בתבנית ה-PDMS, הציוד צריך לכלול מחולל פולסים ומגבר מתח גבוה שנבנה במעבדה. הכין ארבעה מבחנות צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר המכילות בנפרד DPBS ותמיסות עם תאים ומולקולות. חבר כל מבחנה למחזיק המבחנות המתאים המחובר למערכת הבקרה הפניאומטית של הזרימה.
חברו את צינורות הכניסה מהתושבות של הבקבוקונים אל חורי הכניסה המתאימים במכשיר המיקרופלואידי. לאחר מכן, הגדירו את עוצמת פולסי גל הריבוע ל-100 volts.
כדי להשיג עוצמת שדה חשמלי של 0.7 kV/cm לאורך תא האלקטרופורציה, יש לכוון את וסת הלחץ ל-40 PSIA. נעשה שימוש במקור חנקן בודד בעל כיוון ידני כדי להפעיל לחץ אחיד על כל מבחנות הדגימה, ובסעפת (manifold) במהירות גבוהה כדי להפעיל את פתחי התמיסות הבודדים בתוזמניות מדויקת. השליטה בשסתומים מתבצעת באמצעות תוכנת LabVIEW שנבנתה במיוחד למטרה זו.
פתחו את תוכנת ה-lab view המסומנת כ-valve runner ולחצו על run מהתפריט הנפתח שנקרא Operate. לחצו על סמל השסתום המתאים valve one כדי לפתוח את השסתום עבור מאגר ה-DPBS, במטרה להגיע למהירות זרימה הנדרשת ליצירת vortex יציבה ללכידת תאים למשך 1.5 דקות. סמל השסתום אמור להפוך מאפור לירוק בעת הפעלתו; הזרים הן את תמיסות השטיפה והן את תמיסות התאים דרך המכשיר בו-זמנית למשך 10 שניות לפני שלב לכידת התאים.
כדי להבטיח זרימה רציפה במהלך שלב החלפת התמיסות, יש לחזור על שלב זרימה משותפת קצר זה בכל שלב של החלפת תמיסות. העבר את פתח התמיסה הפעיל מתמיסת השטיפה לתמיסת התאים כדי ללכוד תאים בתא האלקטרופורציה למשך 30 seconds. בסרטון זה, האותות הפלואורסצנטיים הכחולים מייצגים ווים חיוניים.
תאים בשלבים 3, 3, 3, 4, 5. הפעילו את פתח השטיפה ושטפו את המכשיר למשך 20 שניות. כדי להסיר תאים מזהמים שלא נלכדו, הזרים את התמיסה המכילה את המולקולה הראשונה המבוקשת.
הזרקת Propidium iodide אל תוך המכשיר למטרות ויזואליזציה. בהדגמה זו, נעשה שימוש בצבעים לחומצות גרעיניות במקום בחוטי DExT המסומנים פלואורסצנטית, וזאת בשל יחס הרעש לאות העדיף של הצבעים; יש להפעיל חמישה פולסים קצרים מיד לאחר הזרקת התמיסה המולקולרית, לנטר את העוצמה ומספר הפולסים החשמליים שהופעלו בזמן אמת באמצעות אוסצילוסקופ. ניתן להמחיש את האותים הפלואורסצנטיים של המולקולות תחת המיקרוסקופ; דגרו את התאים למשך 100 שניות בתמיסה המולקולרית. לאחר מכן, הזרים אל תוך המכשיר את התמיסה המכילה את המולקולה השנייה, הצבע לחומצות גרעיניות yo-yo one.
בהדגמה זו, המולקולה השנייה מועברת ללא יישום של פולסים חשמליים נוספים. סרטון זה מאשר כי התאים מבטאים כעת את שלושת האותים הפלואורסצנטיים: ירוק עבור yo-yo one, אדום עבור propidium iodide, וכחול עבור hooks.
3, 3, 3, 4, 5. שחררו את התאים לתוך פלטת 96 בארות לצורך אנליזה המשכית על ידי הורדת לחץ העבודה למטה מ-five PSI. מכל שחרור נאספים כ-100 microliters של תמיסה המכילה 100 תאים.
יש לחזור על הליך האלקטרופורציה לפחות שלוש פעמים כדי לאסוף מספיק תאים עבור סבוב נציר (centrifuge) של ציטומטריה של זרימה. את פלטת 96 הבארים המכילה את התאים המעובדים יש לסובב במהירות של 228 ×g למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, יש להסיר את הנוזל העליון (supernatant) המכיל מולקולות פלואורסצנטיות עודפות ולהשעות שוב את התאים ב-DPBS.
במידה והוחדרו גדילי DExT המסומנים פלואורסצנטית, התאים נותחו לאחר מכן לבדיקת הספיגה המולקולרית. יעילות הספיגה נבדקה באמצעות פלוו ציטומטריה. מסירה מולקולרית מוצלחת נקבעה באופן איכותני על ידי ניטור שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה של תאים שעברו אלקטרופורציה ב-C two, מה שאישר כי 90% מהתאים המטופלים ספגו מולקולת גדיל DExT אניונית במשקל 70,000 Dalton.
היעילות עבור כל מולקולת דקסטראן שהועברה, שהוגדרה כיחס בין מספר התאים שקלטו בהצלחה את המולקולה המבוקשת למספר התאים הכולל שעובדו, לא השתנתה באופן משמעותי בהתאם למשקל המולקולרי או למטענים החשמליים. כל מולקולות הדקסטראן שנבחנו הועברו לציטוזול ביעילות גבוהה מ-70%. מוצגים כאן פרופילי ציטומטריה של זרימה מייצגים עבור תאים שלא טופלו באלקטרופורציה. סף הפלואורסצנציה המציין העברה מולקולרית מוצלחת נקבע מהנתונים כך שהאותות מדגימות הביקורת נמצאים מתחת לסף.
נתוני ציטומטריית הזרימה המייצגים אלו עבור תאים שעברו אלקטרופורציה רצפית מציגים את תרשים ציטומטריית הזרימה לצד תמונות הפסים הפלואורסצנטיים; המארבים הירוקים מייצגים אותות מתאים שספגו dextran ניטרלי של 3000 Dalton בלבד, והמארבים האדומים מייצגים אותות מתאים שספגו גדיל DExT יוני של 3000 Dalton; אותות פלואורסצנטיים בלבד מתאים שספגו את שני גדילי ה-DExT המוצגים בצהוב מעידים על יעילות הובלה של שני מולקולות של 56%. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תהיה שימושית עבור חוקרים בתחומי הרפואה, הביוטכנולוגיה והפרמקולוגיה לבחינת שילובים של ריאגנטים טיפוליים להשגת השפעות סינרגטיות בטיפול במחלות מורכבות.
זכרו כי עבודה עם פולסים חשמליים במתח גבוה עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הבטחת הארקה, בעת ביצוע פרוצדורה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פלטפורמת אלקטרופורציה בסיוע מערבולת מיקרופלואידית מאפשרת הובלה רצפית של מולקולות מרובות אל תוך אוכלוסיות תאים זהות עם בקרת מינון מדויקת. שיטה זו משפרת את יעילות ההובלה המולקולרית תוך שמירה על חיוניות התאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרופלואידיקה
- אלקטרופורציה
- ביולוגיה של התא
רקע
- אלקטרופורציה היא טכניקה המשמשת להחדרת מולקולות לתאים.
- התקנים מיקרופלואידיים מאפשרים בקרה מדויקת של זרימת נוזלים ומניפולציה של תאים.
- החדרה רצפית של ביו-מולקולות יכולה לשפר את תוצאות הניסוי.
- שמירה על חיות התאים במהלך התהליך היא קריטית ליישומים המשכיים.
מטרת המחקר
- פיתוח פלטפורמה למסירה מבוקרת של מספר במולקולות.
- שיפור היעילות של מסירת מולקולות לתוך תאים.
- הבטחת חיוניות תאים גבוהה לאחר אלקטרופורציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תמיסות DPBS עם תאים וביומולקולות.
- שימוש במערכת בקרת זרימה פנאומטית להזרקת נוזלים.
- יצירה של מערבולות במיקרו-קנה מידה בתאי אלקטרופורציה.
- הפעלת פולסים חשמליים קצרים כדי להקל על ספיגה מולקולרית.
תוצאות עיקריות
- החדרה מוצלחת של מספר במולקולות לתאים.
- יעילות גבוהה וחיוניות של התאים שעובדו.
- יכולת מוכחת למינון רצפי ומבוקר.
- פוטנציאל לניתוחים המשכיים של התאים המטופלים.
מסקנות
- הפלטפורמה שפותחה מציעה התקדמות משמעותית בטכניקות להולכת מולקולות.
- היא מאפשרת שליטה מדויקת במינון ובתיזמון של הולכת biomolecules.
- ניתן ליישם שיטה זו במגוון מחקרים ביולוגיים הדורשים חיות תאים גבוהה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
פלטפורמת אלקטרופורציה מיקרופלואידית זו נותנת מענה לצורך בהגשה מדויקת וסדרתית של מספר במולקולות לאוכלוסיות תאים הומוגניות, יכולת קריטית לסריקת טיפולים משולבים ולהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי מוקדמים. על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה בזמן אמת וכיוונון פרמטרים in situ, המערכת מגבירה את הביטחון החזוי ביעילות הספיגה המולקולרית תוך שמירה על חיוניות גבוהה, ובכך תומכת בקבלת החלטות go/no-go מהימנות בתהליכי תיקוף מטרות. יכולתה של הטכנולוגיה להגשים מקרו-מולקולות טעונות וניטרליות ביעילות עקבית (>70%) על פני משקלים מולקולריים שונים, מספקת בסיס ניתן להרחבה ולשחזור לפיתוח בדיקות במחקר בתחומי האונקולוגיה והפרמקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השפעות מולקולריות קומבינטוריים על תאי סרטן שד גרורתיים באמצעות הובלה רצפית, במינון נשלט, של מולקולות דקסטראן בגדלים ובמטעיים משתנים.
- ערך תפעולי: מבודד אוכלוסיות תאים אחידות באמצעות מערבולות במיקרו-קנה מידה, מה שמפחית את השונות ביעילות האלקטרופורציה ומשפר את השחזוריות בין חזרות.
- ערך ניבוי: ניטור פלואורסצנציה בזמן אמת מאפשר אופטימיזציה מיידית של פרמטרי הפולס, ובכך משפר את יעילות ההובלה ואת איכות הנתונים עבור בדיקות תפקודיות בהמשך התהליך.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מקל על הכנת דגימות תאים סטנדרטיות שעברו אלקטרופורציה, המתאימות לכימות של ספיגה מולקולרית המבוסס על ציטומטריה של זרימה, ובכך מאפשר קריאות בדיקה מהימנות.
- ערך תפעולי: משלב בקרת זרימה פנאומטית ואוטומציה של שסתומים להחלפת נוזלים עקבית, ובכך תומך במערכי אספקה רצופים של מולקולות בתפוקה גבוהה.
- יכולת הרחבה: עיצוב הפלטפורמה מאפשר שימוש חוזר לאורך ריצות ניסיוניות מרובות עם סטייה מינימלית, ובכך תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות ברמה ארגונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומר על חיות תאים גבוהה לאחר אלקטרופורציה, מה שמבטיח שהתאים שהתאוששו מתאימים לאנליזות המשך כגון ציטומטריה עם זרימה ותיקוף פונקציונלי.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשר בדיקה מבוקרת של שילובי מולקולות להערכת השפעות סינרגיסטיות או אנטגוניסטיות, ובכך מפחית את אי-הוודאות בבחירת שילוב המוביל.
- ביטחון חיזוי: יעילות הולכה שהוכחה מעל 70% עבור מולקולות dextran של 3,000 ו-70,000 Da תומכת בהסברה אמינה עבור מקרו-מולקולות טיפוליות במודלים פרה-קליניים.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
הפלטפורמה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל (lead), כאשר הובלה רצפית של ביו-מולקולות מאפשרת הערכה שיסטית של השפעות שילוב על מערכות רלוונטיות למחלה.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): תומך בבדיקת השערות לגבי סינרגיה מולקולרית על ידי מתן אפשרות להגשה מדויקת ורצפית של גששים (probes) לאוכלוסיות תאים זהות תחת תנאים מבוקרים.
- סריקה (Screening): מספק מדדי ספיגה כמותיים המבוססים על פלואורסצנציה, המאפשרים השוואה של יעילות מולקולרית בין תכונות פיזיקו-כימיות שונות.
- אנליטיקה (Analytics): מייצר פלטים מדידים (יעילות ספיגה, עוצמת פלואורסצנציה) המתאימים לניתוח סטטיסטי ולבחירת "להיטים" (hits) במסעי סריקה.
- מחקר תרגומי (Translational Research): שומר על שלמות התאים עבור בדיקות תפקודיות, ובכך מגשר בין ממצאי הגילוי להערכה פרה-קלינית של שילובים מולקולריים.
- שימוש חוזר ארגוני (Enterprise Reuse): תוכנן כמערכת פלואידית מודולרית הניתנת להתאמה לביומולקולות ולסוגי תאים שונים, ובכך תומך בשימוש חוזר בפרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרי שילובים על ידי מתן אפשרות להחדרה מבוקרת וסדרתית של סוכנים מרובים לאוכלוסיות תאים אחידות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות בקרת זרימה מדויקת, לכידה מבוססת מערבולת (vortex) והדמיה בזמן אמת, תוך מזעור שונות התלויה במבצע.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי העלאת שיעורי ההצלחה בניסויי החדרה מולקולרית, ובכך מפחית בזבוז של ריאגנטים והרצות כושלות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של שילובים מולקולריים בהתבסס על נתוני תגובה תאית ויעילות החדרה מאומתת.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתפעול מערכות מיקרופלואידיקה, יצירת פולסים במתח גבוה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לניטור בזמן אמת.
- המערכת תלויה במערכות בקרה פנאומטיות של זרימה, מחוללי פולסים, מגברי מתח גבוה ואוסצילוסקופים לצורך בקרה חשמלית ופלואידית מדויקת.
- נדרש סטנדרטיזציה של תזמון השסתומים, הגדרות הלחץ ופרמטרי הפולס בין משתמשים שונים כדי להבטיח יצירת מערבולת (vortex) יעילה ושחזורה ודיוק באפקטיביות האלקטרופורציה.
- התאמה לסוגי תאים שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של קצבי הזרימה, משך הלכידה ופרמטרי הפולס בהתבסס על גודל התא ותכונות הממברנה.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בטיפול זהיר ברכיבי מתח גבוה ואת פוטנציאל למאמץ גזירה (shear stress) על סוגי תאים רגישים במהלך יצירת המערבולת.
