Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק סוגים שונים של מולקולות בעלות משמעות ביולוגית באופן רציף וניתן לבקרת מינון ביעילות גבוהה באמצעות נקבוביות מיקרופלואידיות בסיוע מערבולת, זה מושג על ידי הכנה ראשונה של ארבעה צינורות צנטריפוגות של 50 מיליליטר המכילים בנפרד תמיסות DPBS עם תאים וביו-מולקולות, והצמדת כל צינור למחזיק הבקבוקון המתאים לו המחובר למערכת בקרת הזרימה הפנאומטית. השלב השני הוא הכנסת צינורות הכניסה מכל בקבוקון מתאים למכשיר המיקרופלואידי עם האלקטרודות המוטבעות בעלות 15 פינים. לאחר מכן, התאים מוזרמים לתוך המכשיר, שם הם נלכדים במערבולות בקנה מידה מיקרו הנוצרות בתאי האלקטרופורציה.

השלב האחרון הוא להחיל פולסים חשמליים קצרים על התאים הלכודים מיד ולאחר מכן הזרקת התמיסות המכילות את הביו-מולקולות שיועברו לציטוזול. בסופו של דבר, ניתן לשחרר את התאים המתקבלים מתהליך זה ולאסוף אותם לניתוח במורד הזרם. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהטכניקה המוצעת מסוגלת להעביר ברצף כמות מבוקרת של מולקולות מרובות לאוכלוסיית תאים זהה שנבחרה מראש עם יעילות וכדאיות גבוהות.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי חילופי הנוזלים מכיוון שהעיתוי של שלב הזרימה הקרה בכל פתרון. שלב ההחלפה קובע את יציבות השמנת התאים. קו תאי סרטן שד גרורתי M-D-A-M-B 2 31 ישמש בצלחת ניסוי זו אחת כפול 10 עד חמישית תאים למיליליטר בנפח של 10 מיליליטר ל-T 75 בקבוק תרבית רקמה במדיום L 15 של לייבוביץ בתוספת 10% נפח לנפח, סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין.

סטרפטומיצין דוגר את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סביבה של 0% פחמן דו חמצני. יומיים לאחר הזריעה, קצרו את התאים לניסויים. לאחר שטיפת התאים בתמיסת מלח בוקוס פוספט או DPBS יש לטפל בתאים עם 0.25% טריפסין EDTA למשך שתי דקות.

הוסף שמונה מיליליטר של מצע גידול כדי לנטרל את תאי הגלולה האנזימטיים על ידי צנטריפוזיה למשך חמש דקות ב-200 פעמים G והמדיה המושהית לריכוז סופי של חמש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר. התכנון והייצור של מכשיר האלקטרופורציה המיקרופלואידית לא יוצגו בסרטון זה, אלא מתוארים בכתב היד הנלווה. המערכת מורכבת מכניסות לתאים, מולקולות ותמיסת שטיפה.

שני ערוצים ישרים שבהם מתרחש מיקוד אינרציאלי. 10 תאי אלקטרופורציה עם אלקטרודות ויציאה להתקנה לניסויי הזרימה. הכנס שקע, פולי אתר, אתר קטון או צינורות שיא, ואת אלקטרודת האלומיניום 15 פינים לדופק קצר, יישום מתח גבוה למקומות המיועדים דרך החורים במיקרו-ערוץ.

האלקטרודה בעלת 15 הפינים מורכבת מ-10 אלקטרודות חיוביות וחמש אלקטרודות שליליות. כל אלקטרודה חיובית מרוחקת 1.5 מילימטרים מאלקטרודה שלילית, וכל אלקטרודה באותה קוטביות מרוחקת 1.35 מילימטרים זו מזו. חבר את הציוד החשמלי ליצירת פולסים של גל מרובע קצר במתח גבוה לאלקטרודות האלומיניום שנמצאות במגע עם פתרונות זורמים.

בתבנית PDMS, הציוד צריך להיות מורכב ממחולל דופק ומגבר מתח גבוה שנבנה בבית. הכן ארבעה צינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר המכילים בנפרד DPBS ותמיסות עם תאים ומולקולות. חבר כל צינור למחזיק הבקבוקון המתאים לו המחובר למערכת בקרת הזרימה הפנאומטית.

חבר את צינורות שיא הכניסה ממחזיקי הבקבוקון לחורי הכניסה המתאימים במכשיר המיקרופלואידי. לאחר מכן, הגדיר. גודל פעימות הגל המרובע הוא וולט עד 100 וולט.

על מנת שעוצמת השדה החשמלי על פני תא האלקטרופורציה תהיה שווה ערך ל-0.7 קילו-וולט לסנטימטר. הגדר את ווסת הלחץ ל-40 PSIA מקור חנקן יחיד המתכוונן ידנית משמש ללחץ אחיד על כל בקבוקוני הדגימה ומשתמש בסעפת במהירות גבוהה כדי להפעיל בזמן יציאות פתרון בודדות. שימוש בתוכנת תצוגת המעבדה המותאמת אישית לבקרת שסתומים.

פתח את המעבדה view תוכנה שכותרתה רץ שסתומים ולחץ על הפעל מהתפריט הנפתח שכותרתו הפעל. לחץ על שסתום סמל השסתום המתאים אחד כדי לפתוח את השסתום למאגר DPBS כדי להגביר את מהירות הזרימה הנדרשת ליצירת מערבולת לכידת תאים יציבה למשך 1.5 דקות. סמל השסתום אמור להפוך מאפור לירוק כאשר הוא מופעל זרימה, הן כביסה והן תמיסות תאים דרך המכשיר בו זמנית למשך 10 שניות לפני שלב לכידת התאים.

כדי להבטיח זרימה ללא הפרעות במהלך שלב מיתוג הפתרון, יש לחזור על שלב הזרימה המשותפת הקצר הזה בכל שלב מיתוג פתרון. העבירו את יציאת התמיסה הפעילה מתמיסת הכביסה לתמיסת התא כדי ללכוד תאים בתא האלקטרופורציה למשך 30 שניות. בסרט זה, האותות הפלואורסצנטיים הכחולים מייצגים ווים ברי קיימא.

3, 3, 3, 4, 5 תאי שלב. הפעל את יציאת הכביסה ושטוף את המכשיר למשך 20 שניות. על מנת להסיר תאים מזהמים שאינם לכודים זורמים התמיסה המכילה את המולקולה הראשונה המעניינת.

פרופידיום יודיד למכשיר למטרות הדמיה. בהדגמה זו, נעשה שימוש בצבעי חומצות גרעין במקום גדילי DExT מתויגים פלואורסצנטיים בגלל יחס הרעש לאות המעולה של הצבעים מפעילים חמישה פולסים קצרים מיד לאחר הזרקת התמיסה המולקולרית, עוקבים אחר גודל ומספר הפולסים החשמליים המופעלים בזמן אמת באמצעות אוסצילוסקופ, ניתן לדמיין את האותות הפלואורסצנטיים של המולקולות תחת המיקרוסקופ, דגרו על התאים למשך 100 שניות בתמיסה המולקולרית. לאחר מכן, התמיסה המכילה את המולקולה השנייה, חומצת הגרעין צובעת יו-יו אחת לתוך המכשיר.

בהדגמה זו, המולקולה השנייה מועברת ללא יישומי פולסים חשמליים נוספים. הסרט הזה מאשר שהתאים מבטאים כעת את כל שלושת האותות הפלואורסצנטיים. ירוק ליו-יו, אחד, אדום לפרופידיום, יודיד וכחול לווים.

3, 3, 3, 4, 5. שחרר את התאים לצלחת 96 בארות לניתוח במורד הזרם על ידי הורדת לחץ ההפעלה מתחת לחמישה PSI. מכל שחרור נאספים כ -100 מיקרוליטר תמיסה עם 100 תאים.

יש לחזור על הליך האלקטרופורציה לפחות שלוש פעמים כדי לאסוף מספיק תאים לצנטריפוגה ציטומטרית זרימה. צלחת 96 הבאר המכילה תאים מעובדים ב -228 פעמים G למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את הסופרנטנט המכיל עודף מולקולות פלואורסצנטיות והשהה מחדש את התאים ב-DPBS.

אם נמסרו גדילי DExT מתויגים פלואורסצנטית, התאים מנותחים לאחר מכן לספיגה מולקולרית. יעילות על ידי ציטומטריית זרימה. אספקה מולקולרית מוצלחת נקבעה באופן איכותי על ידי ניטור שינויים בעוצמת הקרינה של תאים במסלול אלקטרופוטרי ב-C שתיים, שאישרו כי 90% מהתאים המטופלים סופגים את 70,000 דלטון, מולקולת גדיל DExT יונית.

היעילות של כל מולקולת דקסטרן שהועברה שהוגדרה כיחס בין מספר התאים שקלטו בהצלחה את המולקולה המעניינת למספר הכולל של התאים המעובדים לא השתנתה באופן מהותי בהתאם למשקל המולקולרי או למטענים החשמליים. כל מולקולות הדקסטרן שנבדקו הועברו לציטוזול ביעילות של יותר מ-70%מוצג כאן, פרופילי ציטומטריית הזרימה המייצגים שלנו לתאים שלא טופלו באלקטרופורציה. הסף הפלואורסצנטי המצביע על אספקה מולקולרית מוצלחת נקבע מהנתונים כך שהאותות מדגימות הבקרה נמצאים מתחת לסף.

נתוני ציטומטריית זרימה מייצגים אלה עבור תאים אלקטרופוטרים ברצף מציגים את תרשים ציטומטריית הזרימה לצד תמונות הפס הפלואורסצנטי, הקופסאות הירוקות מייצגות אותות מתאים הקולטים 3000, דקסטרן ניטרלי של דלטון בלבד, והקופסאות האדומות מייצגות אותות מהתאים. קליטת 3000 דלטון, גדיל DExT יוני, רק אותות פלואורסצנטיים מהתאים הקולטים, שתי מולקולות גדיל DExT המוצגות בצהוב מצביעות על יעילות העברת מולקולה כפולה של 56% לאחר פיתוחו. טכניקה זו תהיה שימושית לחוקרים בתחום הרפואה, הביוטכנולוגיה והפרמקולוגיה כדי לחקור שילוב של ריאגנטים טיפוליים כדי להשיג השפעות סינרגטיות בטיפול במחלות מורכבות.

אל תשכח שעבודה עם פולסים חשמליים במתח גבוה עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הקפדה על הארקה בעת ביצוע הליך זה.