Name: Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: למד את שיטת האלקטרופורציה המיקרופלואידית בסיוע וורטקס להזרקה סדרתית של מולקולות ביולוגיות לתאים עם בקרת מינון מדויקת. שיטה זו מבטיחה יעילות גבוהה ושמירה על חייות התאים לניתוחים עתידיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכת על ידי תכנית רולנד Junior העמית. המחברים מבקשים להביע את תודה למדענים ואנשי צוות במכון רולנד בהרווארד: כריס סטוקס על עזרתו בפיתוח, ההתקנה שהותקן בסיוע מחשב בקרת לחץ, דיאן Schaak, Ph.D. עבור קלטה לטיפול מדגם ביולוגי, וינפילד היל לפיתוח ההתקנה החשמלית, Alavaro סאנצ&#39;ז, Ph.D. למתן גישה לזרימת cytometer, סקוט בוויס, קני ספנסר ודון רוג&#39;רס לעיבוד רכיבי צנרת מכאניים הנדרשים להתקנת הלחץ. אדוני microfluidic היו מפוברקים במרכז למערכות ננו (CNS) באוניברסיטת הרווארד.

.1 תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 1 × 10 5 / מ&quot;ל תאים של שורת תאי סרטן שד גרורתי מד&quot;א-MB-231 בנפח של 10 מ&quot;ל לבקבוק T75 בתרבית רקמה בשל ליבוביץ L-15 בינוניים בתוספת 10% (v / v) בסרום שור העובר ו1 פניצילין, סטרפטומיצין%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מד&quot;א-MB-231 תאים בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 0% CO 2 בסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים לניסויים 2 ימים לאחר זריעה על ידי טיפול בתאים עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך 2 דקות ולהשבית את הפעילות האנזימטית של טריפסין על ידי הוספת 8 מ&quot;ל של תקשורת הצמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות בגרמו 200 × וגלול בתמיסת מלח של Dulbecco פוספט (DPBS, 1x, ללא Ca 2 + וMg 2 +) לריכוז סופי של 5 × 5 10 תאים / מ&quot;ל. </li></ol> 2 עיצוב מכשיר וייצור הערה: המסכה, בדותות עובש אב ותהליך תוחם microchannel הוא להתנהל בתוך חדר נקי בזמן שניתן לבצע תהליך ליהוק microchannel polydimethylsiloxane (PDMS) על benchtop מעבדה רגיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב מכשיר microfluidic כפי שמודגם באיור 1 עם AutoCAD. המכשיר צריך להיות מורכב של כניסה עם יציאות מרובות הזרקה, מסננים גסים ושני ערוצים מקבילים ישר מלבניים אינרציה התמקדות (L = 7 מ&quot;מ, W = 40 מיקרומטר, וH = 70 מיקרומטר). ערוץ ישר פרט מורכב 5 תאים electroporation, אשר ממוקמים 800 מיקרומטר מזה (W C = 400 מיקרומטר) עם שניים מהם דרך חורים עבור אלקטרודות אלומיניום. שני תאי electroporation transversally סמוכים חולקים את החור להאלקטרודה השלילית. שני ערוצים ישר למזג לשקע במורד הזרם של אזור electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את קובץ CAD עם מיקרו דפוסים לקובץ GDSII באמצעות LinkCAD. לכתוב מיקרו דפוסים על 5 &quot;X 5&quot; photomask ריקבאמצעות סופר מסכת לייזר. לפתח את המסכה על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן. הערה: תהליך פיתוח המסיכה כולל פיתוח photoresist, תחריט כרום ולהתנגד להסרת. לחלופין, מיקרו דפוסים מודפסים על שקיפות רזולוציה גבוהה (&gt; 20,000 dpi) ניתן לרכוש מיצרן צד שלישי ומשמש כphotomask. תכונות מיקרוסקופיות סופית על photomask צריכה להיות שקופות כדי להתאים את הקוטביות של photoresist שלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק עובש הליהוק של עיצוב המכשיר תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיה רכה סטנדרטית 23 עם מעיל photoresist השלילי הסתובב על פרוסות סיליקון 4 אינץ ב2,000 סל&quot;ד כדי לקבל את העובי הסופי של 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prebake הרקיק עם photoresist השלילי עבור 20 דקות על 95 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את המסכה עם הרקיק ולחשוף למקור UV (17.4 mJ / 2 סנטימטר) ל80 שניות באמצעות aligner מסכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את הרקיק החשוף למשך 4 דקות במפתח SU-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד אתעובי photoresist מפותח באמצעות profilometer משטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקפדנות לערבב 10: 1 יחס של אלסטומר לסוכן ריפוי (ערכת אלסטומר סיליקון) ויוצקים את התערובת על תבנית היציקה כדי ליצור העתקים PDMS. דגה אלסטומר הליהוק ל30 דקות ולרפא את תבנית היציקה עם אלסטומר degassed בתנור על 70 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Delaminate העתק PDMS נרפא עם דפוסי microchannel מחורי העובש ואגרוף להוספות פתחי הכניסה, יציאה ואלקטרודה באמצעות צבת סיכה. הערה: קוטר חוד החנית הרגיל של צבת הסיכה צריכה להיות 0.76 מ&quot;מ, מתאים לחוזקה מחזיק צינורות הצצה (OD של 1/32 &quot;) ואלקטרודות אלומיניום (OD של 0.029&quot;) במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור ערוצי microfluidic מוקפים העתקים PDMS מליטה לשקופיות זכוכית שטופלו בשואב חמצן פלזמה ל7 שניות בלחץ חלקי כוח וחמצן בתדר רדיו של 75 W ו500 mTorr, בהתאמה. </li></ol> .3 ניסויי זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנסאלקטרודות אלומיניום (0.029 &quot;OD) וצינורות הצצה לשקע (1/32&quot; OD) למקומות המיועדים באמצעות חורים בmicrochannel (ראו איור 3 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור הציוד החשמלי 18 האחראי ליצירת פולסים מרובע גל קצר במתח גבוה לאלקטרודות האלומיניום (ראה איור 3 ג) שנמצאים בקשר עם זורם פתרונות בעובש PDMS. הערה: הציוד צריך להיות מורכב של גנרטור דופק ומגבר מתח גבוה שנבנה בבית 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ארבעה 50 צינורות מ&quot;ל צנטריפוגות בנפרד מכילים DPBS, פתרונות עם תאים ומולקולות ביולוגיים, ולצרף כל צינור לבעל הבקבוקון שלו בהתאמה מחוברת למערכת בקרת זרימת פנאומטי (ראה איור 3 א). 18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור צינורות הצצה כניסה ממחזיקי הבקבוקון לתוך חורי כניסה המתאימים במכשיר microfluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את סדר הגודל של פולסים מרובעים גל, V, ל100 V כדי שיהיה לי אוף החשמליכוח ld, דואר E = V / L, על פני תא electroporation להיות שווה ערך ל0.7 ק ו / סנטימטר. הערה: הנה, דואר L הוא המרחק בין שתי נקודות שבן אלקטרודות החיוביות ושליליות נמצאות בקשר עם הפתרון הזורם (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את וסת לחץ 40 psi. הערה:. מקור חנקן להתאמה באופן ידני אחת משמש לחצים באופן אחיד את כל בקבוקוני המדגם וסעפת במהירות גבוהה היא מנוצלת להפעלה בזמן יציאות פתרון בודדות באמצעות תוכנת LabVIEW שהותקן 18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבקרת שסתום, לפתוח את תוכנת LabVIEW שהותקן שכותרת Valve ראנר, ולחץ לרוץ מהתפריט הנפתח הזכאי לפעול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל סתום על ידי לחיצה על כל אחד מסמלים שסתום המתאימים. הערה: סמל השסתום צריך להפוך ירוק כאשר הוא מופעל. לחיצה על הסמל הפעיל לבטל ולסגור את הברז. סמל השסתום הסגור צריכה להאפיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את השסתום למאגר DPBS (כלומר., פתרון כביסה) לראש מהירות זרימה הנדרשת לדור מערבולת תא לכידה יציב ל1.5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את יציאת פתרון הפעילה מפתרון הכביסה לפתרון התא לתאי מלכודת בתא electroporation ל30 שניות (כלומר, צעד לכידת התאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרום פתרונות הכביסה ותא הן באמצעות המכשיר בו זמנית עבור 10 שניות לפני צעד לכידת התאים כדי להבטיח זרימה בלא הפרעה במהלך שלב מיתוג הפתרון. הערה: שיתוף זרימת צעד קצר זה יש לחזור בכל שלב מיתוג פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את יציאת הכביסה ולשטוף את המכשיר ל20 שניות כדי להסיר שאינם לכודים תאים מזהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק התמיסה המכילה את המולקולה הראשונה של ריבית (0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של 3,000 מולקולות דה dextran הניטרלי ואניוני או 1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של 70,000 מולקולת dextran הניטרלי Da) לתוך המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל חמישה פולסים קצרים (Δt = 30 אלפיות שניים עם 2 מרווחי שניות) מייד לאחר ההזרקה שלפתרון ומולקולרי לפקח על הגודל ומשך הזמן של פולסים החשמליים המיושמים בזמן אמת באמצעות אוסצילוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיימסר חזור על שלב 3.10 כמה פעמים שמספר מולקולות נוספות. עבור כל משלוח מולקולרי, תאי דגירה ל100 של בפתרון המולקולרי אז לשטוף את המכשיר עם פתרון הכביסה ל100 של להסיר מולקולות עודפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את התאים בצלחת 96 היטב לניתוח במורד הזרם על ידי הורדת לחץ ההפעלה מתחת ל -5 psi. הערה: כ 100 μl של פתרון עם 100 תאים שנאספו מכל מהדורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הניסוי על השלבים 3.9 דרך 3.16 שלוש פעמים כדי לאסוף מספיק תאים לcytometry זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 96 גם הצלחת המכילה תאי מעובד במשך 5 דקות ב228 × גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant המכיל מולקולות ניאון עודפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בDPBS לניתוח cytometry זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי עומס בזרימה cytometer עבור U המולקולריptake ניתוח יעילות. </li></ol>

<ol><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+Past+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Diff%22%5BJournal%5D)">Electroporation Past present and future.</a> Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).</li>
<li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).</li>
<li>Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+electro-microfluidic+channel+for+single+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation.</a> Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).</li>
<li>Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+electroporative+dye+uptake+by+mouse+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells.</a> Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+anticancer+agents+mediated+by+electroporation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro.</a> Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).</li>
<li>Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells+by+an+improved+version+of+MultiRound+Gateway+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology.</a> Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).</li>
<li>Heller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+interleukin-12+plasmid+DNA+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation.</a> DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Effects+of+Nanosecond+Pulsed+Electric+Fields+Combined+with+Low+Concentration+of+Gemcitabine+on+Human+Oral+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma.</a> In Vitro PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electroporation+chip+using+multiple+electric+field+zones+in+a+single+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel.</a> Appl Phys Lett. 101, (2012).</li>
<li>Wang, S. N., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanofluidics+based+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanofluidics based cell electroporation.</a> Biomicrofluidics. 7, (2013).</li>
<li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).</li>
<li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, U649-U693 (2009).</li>
<li>Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-encapsulation+of+two+plasmids+in+chitosan+microspheres+as+a+non-viral+gene+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle.</a> J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, U311-U313 (2007).</li>
<li>Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+size-based+rare+cell+enrichment+using+microscale+vortices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li>
<li>Yun, H. Y., Hur, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+multi-molecule+delivery+using+vortex-assisted+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation.</a> Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).</li>
<li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+theory+and+methods%2C+perspectives+for+drug+delivery%2C+gene+therapy+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand%22%5BJournal%5D)">Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).</li>
<li>Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vortex-assisted+DNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Vortex-assisted DNA delivery.</a> Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).</li>
<li>Jia, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+minicircle+vector+for+deriving+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells.</a> Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).</li>
<li>Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+hematopoietic+stem+cells+Implications+for+gene+therapy+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease.</a> Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem-Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).</li>
<li>Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Unlabeled+Proteins+into+Living+Cells+by+Electroporation+and+Isolation+of+Viable+Protein-Loaded+Cells+Using+Dextran+Fluorescein+Isothiocyanate+as+a+Marker+for+Protein-Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake.</a> Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Electroporation-Fast+Molecular-Exchange+by+Electroosmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).</li>
<li>Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+electrophoretic+DNA+transfer+into+cells.+The+effect+of+DNA+interaction+with+electropores%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores.</a> Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).</li>
<li>Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+large+molecules+into+viable+fibroblasts+by+electroporation+Optimization+of+loading+and+identification+of+labeled+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments.</a> Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).</li>
<li>Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+specific+antibodies+into+electropermeabilized+cells+is+a+valuable+tool+for+eliminating+specific+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Function%22%5BJournal%5D)">Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions.</a> Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

עם הפלטפורמה החדשה parallelized electroporation, השיפור של פי 10 בתפוקה ויעילות של משלוח מרובה מולקולה הושגה, בנוסף לכל היתרונות שהמערכת אחת קאמרית שפותחה בעבר מספקת. 18 יתרונות זמינים בעבר כוללים (i) לפני טיהור יעד תאים עם התפלגות אחידה גודל לשיפור כדאיות, (ii) שליטת מינון מולקולרית מדויקת ופרטנית, וכן (iii) זרם חשמלי תפעולי נמוך. Fluorescently dextrans שכותרתו נבחר כמולקולות של עניין, כי הם זמינים במגוון רחב של משקלים מולקולריים, סוגים מצומדות fluorophore, ומטענים חשמ...

בשנים האחרונות, השימוש בפולסים חשמליים כדי להקל על משלוח cytosolic של מולקולות תאיים הפך אמצעי אטרקטיבי של מניפולציה תאי יונקים. 1 תהליך זה, המכונה גם electroporation, הפיך permeabilizes קרום התא, המאפשר למולקולות בלתי חדירים קרום מטבע כדי לקבל גישה לסביבה תאית של התאים. כי כמעט כל מולקולה יכולה להיות מוחדר cytosol באמצעות הנקבוביות שנוצרו זמניות בקרום של כל סוג של תאים באמצעות electroporation, הטכניקה דווחה כיותר לשחזור, ישים באופן אוניוורסלי, ויעיל יותר מאשר שיטות אחרות, כוללים וירוס בתיווך, כימי וגישות אופטיות. 2-3 טכניקה זו נוצלה להציג את מולקולות ניאון, 4 תרופות 5 וחומצות גרעין 6-7, תוך שמירה על תאי קיימא ושלמים. בהתחשב ביתרונות הללו, electroporation אומצה כעבודה משותפתטכניקת atory לtransfection DNA, in vivo ריפוי גנטי 8 ומחקרי חיסון תא. היא, לעומת זאת, עדיין קשה למערכות electroporation קונבנציונליות כדי להשיג בו זמנית יעילות מעשית ויכולת קיום לדגימות עם הטרוגניות גדולה בגודלם ועוצמת השדה החשמלי הנדרשת לelectroporation המוצלח בקורלציה הדוקה עם הקוטר של התא. יתר על כן, מערכות אלה אינן מאפשרים שליטה מדויקת של הכמויות מולקולריות מרובות מועברת עקב הסתמכות על תהליך משלוח בתפזורת סטוכסטיים מולקולרי. 9 על מנת לטפל בבעיות אלה, קבוצות רבות פיתחו פלטפורמות electroporation microfluidic, המציעות את היתרון של מתחי poration נמוכים יותר, יעילות טובה יותר transfection, ירידה גדולה בתמותת תאים, והיכולת לספק מולקולות מרובות. 10-13 יתרונות אלה התאפשרו הודות לטביעות הרגליים הקטנות של מערכות electroporation microscale אלקטרודה שהמגרשאורכים הם תת מילימטרים, באופן דרמטי ירידת מתח הנדרש למשלוח מוצלח. יתר על כן, מערכות electroporation microscale אלה יכולים להשיג הפצת שדה חשמלית אחידה ובמהירות לפזר חום שנוצר, מניב תמותת תא מופחת תוך שיפור יעילות משלוח. הניצול של חומרים שקופים לשבבים אלה נוספים מאפשר בתצפית באתרו של תהליך electroporation לשינויים פרמטר הפקודה. 2,12 עם זאת, שליטה במינון מדויקת ושליטה פרמטר מולקולרית ותאית תלויה, הנדרשת למחקר חדש ויישומים טיפוליים, 6, 14-16 עדיין נותר לא פתור. עבודה זו מציגה מערכת microfluidic בסיוע מערבולת electroporation, מסוגל לספק מולקולות מרובות ברצף לאוכלוסייה זהה שנבחר מראש של תאי מטרה. תאים עם התפלגות גודל האחיד מבודדים לפני electroporation באמצעות si שדווח בעברמנגנון ze סלקטיבי השמנה. 17-18 על ידי בעל התפלגות אחידה בגודל, פחות וריאציה ביעילות electroporation וכדאיות משופרת לעוצמת שדה חשמלית נתון הושגו. 19 יתר על כן, ברציפות התססה תאים לכודים באמצעות מערבולות microscale אפשר למסירה אחידה של מולקולות על פני cytosol כל, בהסכם עם התוצאות שדווחה בעבר באמצעות פלטפורמה אחרת electroporation בסיוע מערבולת. 20 כדי להוכיח כי מערכת זו תהיה ישימה למגוון רחב של המולקולות בשימוש הנרחבים ביישומים ביולוגיים, מקרומולקולות עם מגוון רחב של משקלים מולקולריים הועברו ל תאי סרטן השד גרורתי. בנוסף, בעזרת ניטור תהליך בזמן אמת, עבודה זו מספקת ראיות נוספות כדי לשים קץ לוויכוח הארוך הימים בנוגע למנגנון של משלוח מולקולרי לבמהלך electrporation, מכיוון שרוב תושבי אלקטרופורזה בתיווך מול בתיווך דיפוזיה. 14 </sup&gt; בניגוד למערכות electroporation אחרים, פלטפורמה ייחודית זה מספקת יתרונות בשילוב של מסירה מדויקת מרובה מולקולה, יעילות אספקה ​​מולקולרית גבוהה, תמותת תאים מינימאלית, תוחלת רחבה של גודל וחיובים של מולקולות נמסרו, כמו גם להדמיה בזמן אמת של electroporation תהליך. בהתחשב ביכולות אלה, מערכת electroporation פיתחה יש פוטנציאל מעשי ככלי תכליתי ללימודי תכנות מחדש של תאים, אספקת יישומי 6,14,21-22 תרופה 10,19 ויישומים הדורשים להבנה מעמיקה של מנגנוני אספקה ​​מולקולריים electroporation.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 קו תאי סרטן</td><td>אוסף תרביות סוג אמריקאי (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>לייבוביץ' s L-15</td><td>Medium Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט חוצץ (DPBS) של Dulbecco</td> <td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer easyCyte</td><td>HT Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr>טכניקת<td>מנקה פלזמה חמצן</td><td>Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M פרופיל משטח</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 סיליקון אלסטומר KIT</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גז חנקן דחוס</td><td>Airgas</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>רגולטור בלחץ גבוה</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>רגולטור במורד הזרם</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>סעפת שסתום 3/2way-8 במהירות גבוהה</td><td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שסתום סימון מוטבע</td><td>Idex בריאות ומדע</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32 אינץ' OD x 3/32 אינץ' ID צינורות פוליאוריתן</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4 אינץ' OD X 0.17 אינץ' ID צינורות פוליאוריתן</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>1/16 אינץ' צינורות PEEK</td><td>Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>1/32 אינץ' צינורות PEEK</td><td>Idex בריאות ומדע</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>איגודי צינורות PEEK</td><td>Idex בריאות ומדע</td><td>P881</td><td></td></tr><tr><td>מחולל דופק</td><td>HP</td><td>8110A</td><td></td></tr><tr><td>חוט אלומיניום</td><td>בוב מרטין חברה</td><td>6061 ALUM</td><td></td></tr><tr><td>אוסילוסקופ</td><td>Agilent</td><td>DSO3062A</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>T75 בקבוק תרבות</td><td>VWR</td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרן, טטרמתילרודמין, 3,000 מגה-וואט, גיבקו אניוני</td><td>, Life Technologies</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרן, טטרמתילרודמין, 70,000 מגה-וואט, ניטרלי&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, טקסס אדום, 3,000 MW, גיבקו ניטרלי</td><td>, Life Technologies</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table>

electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Electroporation זכתה לתשומת לב הולכת וגובר בשנים האחרונות, כי זה הוא טכניקה חזקה מאוד להחדרה פיזית בדיקות מולקולריות אקסוגני שאינו permeant לתוך תאים. עבודה זו מדווחת פלטפורמת electroporation microfluidic מסוגל לבצע משלוח מולקולה מרובה לתאי יונקים עם שליטה מדויקת ומולקולרית תלויה פרמטר. היכולת של המערכת לבודד את התאים עם התפלגות גודל אחידה מאפשרת פחות וריאציה ביעילות electroporation לעוצמת שדה חשמלית נתון; מכאן משופר כדאיות מדגם. יתר על כן, תכונת ההדמיה תהליך שלה מאפשרת להתבוננות בתהליך הניאון המולקולרי הספיגה בזמן אמת, המאפשר התאמות פרמטר מסירה מולקולריות מהירה באתר לשיפור יעילות. כדי להראות את היכולות עצומות של הפלטפורמה דיווחה, מקרומולקולות עם גדלים שונים ומטענים חשמליים (למשל, Dextran עם MW של 3,000 ו -70,000 Da) היהנמסר לתאי סרטן השד גרורתי עם יעילות גבוהה משלוח (&gt; 70%) עבור כל המולקולות שנבדקו. הפלטפורמה שפותחה הוכיחה את הפוטנציאל שלה לשימוש בהרחבה של תחומי מחקר שבו טכניקות electroporation יכולות להיות על שבב מועילות.

Electroporator microfluidic המקביל פיתח נמסר מקרומולקולות עם גדלים מגוונים ומטענים חשמליים לתוך תאי חיים סרטן השד גרורתי. משלוח מולקולרי מוצלח נקבע איכותי על ידי מעקב אחר שינויים בעוצמת ניאון של electroporated תאים המקיפים באתר ואושר על ידי מדידות כמותיות באמצעות ניתוח cytometry זרימה. איור 4A מראה כי 90% מתאים שטופלו ספיגים dextran הניטרלי דה 70,000. לניתוח הסטטיסטי, סף עוצמה עבור כל fluorophore הוקם כך שהרוב (&gt; 99%) של תאי חיים לא מעובדים נספר מתחת ל...

פלטפורמת electroporation סייע מערבולת microfluidic פותחה למסירה רציפה של מולקולות מרובות לתוך אוכלוסיות תאים זהות עם שליטה מדויקת ובלתי תלויה מינון. electroporation צעד טיהור תא המטרה שקדמו מבוסס גודל של המערכת סייע לשפר את יעילות אספקה ​​מולקולרית וכדאיויות תא מעובד.

Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להחדיר סוגים שונים של מולקולות בעלות משמעות ביולוגית באופן סדרתי ובמינון שניתן לבקרה ביעילות גבוהה באמצעות פורר מיקרופלואידי בעזרת מערבולות (Vortex assisted microfluidic porer). דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת ארבעה מבחנות צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר, המכילות כל אחת תמיסות DPBS עם תאים ומולקולות ביולוגיות, וחיבור כל מבחנה למחזיק הבקבוק המתאים המחובר למערכת בקרת הזרימה הפנאומטית. השלב השני הוא להחדיר את צינורות הכניסה מכל בקבוק בהתאמה אל תוך ההתקן המיקרופלואידי הכולל אלקטרודות של 15 פינים. לאחר מכן, התאים זורמים אל תוך ההתקן שבו הם נלכדים במערבולות במיקרו-קנה מידה הנוצרות בתאי האלקטרופורציה.השלב הסופי הוא הפעלת פולסים חשמליים קצרים על התאים הלכודים, ולאחריהם מיד הזרקת התמיסות המכילות את הביומולקולות המיועדות למסירה לתוך הציטוזול. לבסוף, ניתן לשחרר ולאסוף את התאים שהתקבלו מתהליך זה לצורך אנליזות המשך. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהטכניקה המוצעת מסוגלת להעביר באופן רצפי כמויות מבוקרות של מולקולות מרובות לתוך אוכלוסיית תאים זהה שנבחרה מראש, ביעילות גבוהה ובשמירה על חיוניות התאים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי חילוף הנוזלים קשים ללמידה בשל כך שהתזמון של שלב הזרימה הקרה בכל שלב של החלפת התמיסות קובע את יציבות לכידת התא

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מערכת microfluidic הרומן פותחה באמצעות תופעת שאיבה פסיבית נוזל מבוקר המשתמש מערכת המסירה. מערכת זו microfluidic יש פוטנציאל לשמש במגוון רחב של יישומים ביולוגיים נתון, עלות נמוכה שלה וקלות השימוש, דיוק נפחי, מהירות גבוהה, הדירות ואוטומציה.

מהירות גבוהה Droplet מבוססי משלוח מערכת פסיבי שאיבה מכשירים microfluidic

כלי ו chemistries מתוארים ברצף כדי לבודד חומצות גרעין ואחריו חלבונים ממדגם ללא צורך בחשמל. כלי מורכב sorbent שנערך בתוך פיפטה העברת בעוד chemistries בידוד מבוססים על עקרונות מוצק בשלב החילוץ. מקרומולקולות את בודדים ניתן לנתח על ידי מבחני חיסונית מבוססי PCR מבוסס.

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

מתואר הפרוטוקול לייצור ותפעול של התקני הרטבת שדה (Field-DW), כמו גם המחקרים הראשוניים של השפעות השדות החשמליים על תכולת הטיפות.

ניצול של אינטראקציה אגל-פני השטח מופחת למטב תחבורה של Bioanalytes במיקרופלואידיקה הדיגיטלי

פרוטוקול זה מתאר ארכיטקטורת מערכת לביצוע הפרדות חלקיקים אוטומטיות בנפח קטן (0.15-1.5 מ"ל) באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, ודן בשיטות לייעול הביצועים והתפעול של מכשיר אקוסטופלואידי.

פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי

תא בודד רצף חושף הטרוגניות genotypic במערכות ביולוגיות, אך טכנולוגיות הנוכחי חוסר התפוקה הכרחי עבור פרופיל עמוק של הקהילה הרכב ותפקוד. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה microfluidic עבור רצף &gt; הגנום בתא יחיד 50,000 מ מגוונות תא אוכלוסיות.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

עבודה זו מספקת שיטה הזיוף של פלטפורמות מבוססות-droplet microfluidic לבין היישום של microspheres לזיהוי עבור הגברה ננו-ספירה-PCR. שיטת ננו-ספירה-PCR מאפשר לקבל חד גדילי DNA amplicons מבלי המפריד בין שני גדילי ה-DNA.

גישה Microfluidic המבוססות על Droplet ו ננו-ספירה-PCR הגברה עבור חד גדילי DNA Amplicons

פרוטוקול זה מתאר את העברת הפלסטיות הגבוהה ביותר של תאי היונקים בצלחת 384-היטב באמצעות טכנולוגיית הפליטה האקוסטית של ה-droplet. הזמן גוזלת, שגיאות-DNA לחילוק ו ריבוב, אבל גם התרגום המקביל מגיב, הם תוכנה מונחה ומבוצעת על ידי מכשיר ננו. התאים הם הנזרע לאחר מכן בארות מלאות אלה.

התפוקה הגבוהה של DNA פלאגיסינג ומעבר באמצעות טכנולוגיית ננו-לחילוק אקוסטית

בדיקות טיפות מים בשמן שימושיות לכימיה אנליטית, התפתחות אנזימים וניתוח תאים בודדים, אך בדרך כלל דורשות מיקרופלואידיקה כדי ליצור את הטיפות. כאן, אנו מתארים תחליב בתבנית חלקיקים, גישה נטולת מיקרופלואידים לביצוע בדיקות טיפות.

תחליב בתבנית חלקיקים מאפשר בדיקות טיפות נטולות מיקרופלואידים

פרוטוקול זה מתאר את טכניקות המיקרו-פבריקציה הנדרשות לבניית התקן אלקטרופורציה מיקרופלואידי במעבדה על שבב. מערך הניסוי מבצע טרנספקציות מבוקרות ברמת תא בודד בזרימה רציפה וניתן להרחיב אותן לתפוקות גבוהות יותר עם בקרה מבוססת אוכלוסייה. ניתן ניתוח המציג את היכולת לעקוב באופן חשמלי אחר מידת החדירה של קרום התא בזמן אמת.

ייצור והפעלה של זרימה רציפה, מערכת מיקרו-אלקטרופורציה עם זיהוי חלחול

שלפוחיות חוץ-תאיות טומנות בחובן הבטחה עצומה ליישומים ביו-רפואיים, אך שיטות הבידוד הנוכחיות גוזלות זמן רב ואינן מעשיות לשימוש קליני. במחקר זה אנו מציגים מכשיר מיקרופלואידי המאפשר בידוד ישיר של בועיות חוץ-תאיות מכמויות גדולות של נוזלים ביולוגיים באופן רציף ובמינימום צעדים.

בידוד חד-שלבי של בועיות חוץ-תאיות מדגימות בנפח גדול באמצעות התקן מיקרופלואידי A4F מפוצל

פרוטוקול זה מתאר עריכת גנום CRISPR–Cas9 מוקטנת של קולטן TCRα/β בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות 'DMF-ection', פלטפורמת אלקטרופורציה דיגיטלית מיקרופלואידית (DMF). השיטה מאפשרת עריכת גנים מקבילה עם קלט נמוך עם יכולת היתכנות גבוהה, והיא גמישה עוד יותר להעברת mRNA לספירואידים תלת-ממדיים רב-תאיים.

פלטפורמת אלקטרופורציה מיקרופלואידית דיגיטלית לעריכת גנום CRISPR בקלט נמוך וטרנספקציה של mRNA בתאי T תלוי-תלת-ממדיים ובמודלים של תאי תלת-ממד

למד את שיטת האלקטרופורציה המיקרופלואידית בסיוע וורטקס להזרקה סדרתית של מולקולות ביולוגיות לתאים עם בקרת מינון מדויקת. שיטה זו מבטיחה יעילות גבוהה ושמירה על חייות התאים לניתוחים עתידיים.

Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale

גלה סרטונים נוספים