פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לייצר נתוני ריצוף גנומי מקודדים מעשרות אלפי תאים בודדים באמצעות סדרה של מכשירים מיקרופלואידיים. שיטה זו משיגה תפוקת ריצוף של תא יחיד שאין שני לו. אנו משתמשים במיקרופלואידיקה כדי לעטוף, ליז ולברקוד תאים בנפרד, תוך שמירה על הטרוגניות גנומית בסיסית, שאובדת בהלם קונבנציונלי במחקרי ריצוף.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא בעלת תפוקה גבוהה ומסוגלת לייצר נתונים של תא בודד מעשרות אלפי תאים. למרות שאנו עובדים עם מיקרובים בהדגמה זו, ניתן להתאים את זרימת העבודה לשימוש עם סוגי תאים שונים באמצעות שינויים קלים במידות המכשיר המיקרופלואידי. כדי להתחיל את הפרוטוקול, הכינו מיליליטר אחד של 3% משקל לנפח טמפרטורת התכה נמוכה במאגר 1X Tris-EDTA, או TE.

שמור את תמיסת האגרוז על גוש חום של 90 מעלות צלזיוס רק עד לטעינת המזרק. השעו מחדש תאים במיליליטר אחד של מי מלח עם חוצץ פוספט, או PBS, וסובבו את התאים. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של 17% נפח למדיום שיפוע צפיפות נפח ב-PBS, והשאירו את התאים על הקרח עד לטעינת המזרק.

לאחר מכן, טען מזרק של שלושה מיליליטר בשמן פלואור, או HFE, המכיל חומר פעילי שטח PFPE-PEG של 2% משקל למשקל. התקן אותו עם מחט בגודל 27, והנח אותו במשאבת מזרק. טען את מתלה התאים ואת האגרוז המותך למזרקים של מיליליטר אחד, שניהם מתאימים למחטים בגודל 27, והנח אותם במשאבות מזרק.

לאחר מכן, הגדר את מחמם החלל לגבוה, ומקם את משטח החימום במרחק של 10 סנטימטרים מהמזרק. ודא שהטמפרטורה הנמדדת במזרק היא כ-80 מעלות צלזיוס. לפני הכנסת הצינורות למכשיר, הפעל את המשאבות כדי להוציא את האוויר מהקו.

חבר את מחטי המזרק לכניסות המכשיר המיקרופלואידי באמצעות חתיכות צינורות פוליאתילן, או PE. חבר חתיכת צינור לשקע, והנח את הקצה החופשי בצינור איסוף של 15 מיליליטר. לאחר הטיפה, הנח את צינור האיסוף בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להבטיח ג'לציה מלאה של האגרוז.

הסר את שכבת השמן התחתונה מצינור האיסוף באמצעות מזרק של שלושה מיליליטר המצויד במחט בגודל 20, תוך הקפדה לא להפריע לשכבה העליונה של טיפות האגרוז. הוסף מיליליטר אחד של 10% נפח לנפח PFO ב-HFE כדי לשבור את טיפות האגרוז משכבת פעילי השטח שלהן. פיפטו את התמיסה למעלה ולמטה למשך דקה אחת כדי לצפות היטב את האמולסיות, שאמורות להיות הומוגניות וללא גושים.

סובב את הצינור החרוטי ב -2, 000 פעמים גרם למשך דקה אחת כדי לאסוף את המיקרוג'לים של האגרוז. שאפו את הסופרנטנט PFO/HFE, וודאו שהמיקרוג'לים נקיים כעת משכבת פעילי השטח שלהם והם שקופים. לאחר שטיפת המיקרוג'לים, ודא את עטיפת התאים במיקרוג'לים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 400 על ידי צביעת 10 מיקרוליטר של ג'לים בצביעה של חומצת גרעין 1X.

חבר את כניסת התאים של מכשיר טיפת זרימה משותפת עם חתיכה קטנה של הלחמת עופרת. לפני הכנסת הצינורות למכשיר, הפעל את המשאבות כדי להוציא את האוויר מהקו. חבר חתיכת צינור לשקע, והנח את הקצה החופשי בצינור PCR בנפח 0.2 מיליליטר.

השתמש בקצבי הזרימה על המסך לביצוע טיפות. אסוף את הטיפות לתוך צינורות ה-PCR עם כ-50 מיקרוליטר טיפות בכל צינור. לאחר הטיפה, הסר בזהירות את השכבה התחתונה של שמן HFE מהאמולסיות באמצעות קצות פיפטה לטעינת ג'ל, והחלף אותה בשמן פלואור FC-40 המכיל חומר פעילי שטח PFPE-PEG במשקל של 5%.

לאחר מכן, תכנת את המחזור התרמי. לפני הכנסת הצינורות למכשיר, הפעל את המשאבות כדי להוציא את האוויר מהקו. חבר את המזרקים המכילים HFE, תערובת תיוג ומיקרוג'ל לכניסות המכשיר המיקרופלואידי באמצעות חתיכות צינורות PE.

חבר חתיכת צינור לשקע, והנח את הקצה החופשי במזרק ריק של מיליליטר כשהבוכנה נמשכת לקו המיליליטר. לאחר מכן, ודא את קצב עטיפת המיקרוג'ל תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 400. התקן את המזרק המכיל את תחליבי התיוג בעזרת מחט, ודגר אותו זקוף בבלוק חום או בתנור למשך שעה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס כדי לפצל את ה-DNA הגנומי.

הכן את טיפות הברקוד למיזוג על ידי החלפת שבר השמן FC-40 ב-HFE 2% משקל למשקל PFPE-PEG. העבירו בזהירות את הטיפות למזרק של מיליליטר, הכניסו אותו למחט והניחו אותו במשאבת מזרק. טען את מזרק טיפות המיקרוג'ל המודגר והמתויג לתוך משאבת מזרק.

לאחר מכן, חבר את שלושת מזרקי הנתרן הכלורי לשני כניסות האלקטרודות וכניסת החפיר היחיד באמצעות חתיכות צינורות PE. לפני הכנסת הצינורות למכשיר, הפעל את המשאבות כדי להוציא את האוויר מהקו. חבר את שלושת מזרקי ה-HFE המותקנים על המשאבות לשני כניסות השמן המרווחות וכניסת השמן לייצור טיפות באמצעות חתיכות צינורות PE.

לאחר מכן, ירה בכל צינורות ההזרקה מחדש של טיפות עם אקדח אנטי סטטי לפני חיבור הצינור למחטי המזרק. חבר את מזרק תערובת ה-PCR, מזרק טיפת המיקרוג'ל ומזרק טיפת הברקוד לכניסות שלהם עם צינורות PE. חבר את המחט של מזרק האלקטרודה למהפך פלואורסצנטי קתודה קרה באמצעות קליפ תנין.

הגדר את ספק הכוח DC של הממיר לשני וולט. הפעל את התקן המיזוג הכפול עם קצבי הזרימה המומלצים. אסוף את הטיפות לצינורות PCR עם כ-50 מיקרוליטר תחליב בכל צינור.

לפני המחזור התרמי, הסר בזהירות את השכבה התחתונה של שמן HFE מהאמולסיות באמצעות קצות פיפטות טעינת ג'ל, והחלף אותם בשמן פלואור FC-40 המכיל חומר פעילי שטח PFPE-PEG במשקל של 5%. לאחר מכן, תכנת את המחזור. כדי לשחזר את ה-DNA מטיפות המחזור התרמי, אסוף את הטיפות לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה, ושבר את האמולסיות באמצעות 20 מיקרוליטר של PFO.

מערבלים אותם למשך 10 שניות לערבוב. סובב את הצינור. הסר בזהירות את השכבה המימית העליונה מהצינור באמצעות פיפטה, והעביר אותה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.

השלך את שלב השמן. לאחר מכן, המשך לבסוף לשלבי הכנת הספרייה, הרצף והניתוח. היסטוגרמה של ספירת הברקודים לעומת גודל הקבוצה מראה שחלק ניכר מקבוצות הברקוד החוקיות נמצא מעט מעל 7.5 זוגות קילו-בסיס לגודל סף קבוצה, מה שאינו כולל את היתומים שעברו מוטציה ב-PCR.

השפע היחסי של סוגי התאים מקהילה סינתטית של 10 תאים של שלושה חיידקים גרם שליליים, חמישה חיידקים גרם חיוביים ושני שמרים חושב על ידי ספירת הקריאות הגולמיות וקבוצות הברקוד. מפת כיסוי מעגלית של קריאות B.subtilis מכל קבוצות הברקוד ממחישה את האחידות של קריאות SiC-seq, ללא אזורי נשירה נצפים, שבהם הכיסוי הממוצע היה פי 5.55. אחידות הכיסוי אומתה באמצעות התפלגות תדרים של ערכי כיסוי מנורמלים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על קצב אנקפסולציה של כברקוד או תא אחד לכל 10 טיפות. זה מגביל את הסבירות לאירוע אנקפסולציה כפול, שיכול לסובב את נתוני התא הבודד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להגדיר ולהפעיל את המכשירים המיקרופלואידיים המשמשים ליצירת נתוני ריצוף של תא בודד.

לאחר שליטה, ניתן להפעיל טכניקה זו תוך שמונה שעות או יומיים של ארבע שעות.