Name: פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למד שיטת ריצוף גנומי בתא יחיד בקנה מידה גבוה באמצעות מכשירים מיקרו-נוזליים. השיטה מאפשרת אנקפסולציה, פירוק וקידוד ברקוד של תאים בנפרד תוך שמירה על הטרוגניות גנומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע דרך פרס הקריירה (גרנט מספר DBI-1253293); במכון הלאומי של בריאות (NIH) (מענק מספרים HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); והתוכנית הגנה מתקדמת מחקר פרויקטים סוכנות חיים יציקה (חוזה מספרים HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

<ol><li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li>
<li>Schmidt, H., Hensel, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14726454">Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).</li>
<li>Martínez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection%3A+pathogenicity+epidemicity%2C+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+for+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li>
<li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+labeling+%28Hi-SCL%29+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li>
<li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784(2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li>
<li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Internation+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li>
<li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li>
<li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).</li>
<li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Optic+Letters%22%5BJournal%5D)">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472(2012).</li>
<li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li>
<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
<li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550(2013).</li>
<li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li>
<li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+metagenomic+sequences%3A+methods+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86(2015).</li>
<li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+helix+in+a+haystack%3A+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li>
</ol>

הפטנטים הנוגעים זרימת עבודה זו עשוי להיות מורשה ביו המשימה, של אבטה רבי איזה אדם הוא מניות.

SiC-seq microfluidic זרימת העבודה יוצרת נתונים רצף הגנום בתא יחיד מתוך אלפי תאים חיידקיים. ברקודים דיגיטלי משולבים לתוך הגנום של תאים microgel-אנקפסולציה מאפשרים סיליקו deconvolution של הגדרות נתונים לקבוצות הקריאות לבר-קוד שמקורם באותו התא. ניסוי שליטה עם קהילה מיקרוביאלית של ההרכב ידוע יש צורך להעריך את הטוהר של הקבוצות ברקוד. חלק גדול של קבוצות נמוך-טוהר מציין כי שיעור עיטוף התא הוא גבוה מדי או שיש זיהום משמעותי droplet המתרחשים במהלך השלבים בעיבוד microfluidic. לפי נתוני פואסון, ברקודים של תאים צריך להיות אנקפסולציה ביחס למטרה של חלקיק 1 עבור כל 10 טיפות להגביל את הקצב של אירועים מרובים כימוס פחות מ 5% של כל טיפות שאינן ריקות. שיעור עיטוף גבוה יותר מאשר זה מגביר את שערי doublets באופן אקספוננציאלי, אז האימות של היחס כימוס במהלך תהליך dropmaking הוא בעל חשיבות קריטית. המשתמשים צריכים להיות זהירים במיוחד הסגירות של תאים מרובים ב- microgel יחיד כי קריאות של תאים שונים שיתוף אותו רצף ברקוד לא יכול להיות bioinformatically מופרדים. במקרה שתא 1 מקבל 2 ברקודים שונים, טוהר קבוצה ברקוד הוא מושפע למרות שפע מדדים מוטים בעת ספירה לפי רצף ברקוד.
זיהום צולב droplet שעלולים להתעורר גם בשל תנאי המיזוג שיוצרת. במהלך מבצע מוצלח, המכשיר המיזוג microfluidic (איור 5) ניתן לשייך מכאנית ופיקודית droplet ברקוד 1 עם 1 microgel ונפח של ריאגנט PCR. Non-אידיאלי זרימה המחירים יביא droplet זיווג-לא נכונים ratios: ברקוד 1 יכול להיות משויך עם 2 microgels, למשל. כל המחירים הזרימה הרשום בפרוטוקול נועדו להיות הערכות וצריך יותאם בהתאם סטיות במידות גאומטריה ו רביב המכשיר. למשתמשים בעלי גישה למצלמות עם יכולות הקלטה במהירות גבוהה (> מסגרות לשנייה 10,000) עליך לוודא המיזוג droplet נכונה בתחילת ובמהלך הפעולה microfluidic. משתמשים ללא גישה מצלמת מהירות גבוהה ניתן לאסוף את נפח קטן של הפלט הממוזג, באופן ידני למדוד את גודל droplet תחת מיקרוסקופ. גודל droplet צריך להיות אחיד: עודף של ברקודים שלא מוזג או טיפות microgel מציין כי שיעור reinjection צריך להיות מופחת בהתאם.
מספר כללי זהירות יש לנקוט בעת טיפול microgels ו- microdroplets כדי לשמר את שלמות שלהם. Microgels, למרות מכנית חזקה, חייב להיות מספיק מקורר לפני שבירת ושטיפת צעדים כדי להבטיח gelation מלאה. Microgels שאינה כדורית הם סימן לכך agarose לא היה נתון מספיק זמן כדי לחזק. כאשר הכביסה microgels, לסובב את המתלים למטה במהירויות הנדרשים כדי למנוע אובדן של המוצר. Agarose הידרוג בעל אינדקס השבירה מקרוב ההתאמה של מים, ייתכן שתתקשה לראות צינור22, כך שמשתמשים בקפידה צריך לזהות את הגבול ג'ל נוזלי לפני השאיפה. טיפות מים בתוך שמן רגישים coalescence על ידי הצטברות של כוחות סטטיים23 על כפפות מעבדה, אבובים. מסיבה זו, אנו ממליצים להתייחס כל הקווים reinjection עם אקדח אנטי סטטי לפני לקרקע המשאבה וטעינה של מזרקים reinjection droplet בידיים חשופות. טיפות התמזגו גדולים ניתן להסיר על ידי סובבים לאיטם את אמולסיות בתוך מזרק ידנית כ רפה בעברית את טיפות גדולות יותר, אשר לצבור קרוב לצמרת עקב שלהם כוח גדול יותר קליל.
SiC-seq היא הטכנולוגיה הראשונה כדי להדגים את רצף הגנום בתא יחיד של > 50,000 תאים חיידקיים. פלטפורמה זו יתרונות משמעותיים בהתפוקה על גישות קיימות, ומאפשרת דגימה עמוק יותר של קהילות מיקרוביאלי הטרוגנית. עד כה, microfluidic טכנולוגיות רצף הגנום בתא יחיד המועסקים microchambers9 ו- microwells24 לתא הבידוד, הגברה, אך עם תפוקות בטווח של רק עשרות מאות תאים. זרימה המיון של תאים בודדים לתוך5,wellplates6 דורש אין מכשור microfluidic מיוחדים אך בעל תפוקה נמוכה באופן דומה. בהתחשב בכך דגימות קרקע ומים מהסביבה יש בדרך כלל הבדלים אלפא של > 1,000-המין רמה25,26, SiC-seq יש יתרון מאוד בזכות יכולתה לדגום מספר גדול בהרבה של אורגניזמים. SiC-seq זרימת העבודה היא יכולת הסתגלות תא תשומות מעבדה התרבות, הסביבה הטבעית או גוף חי. דגימת תאים צריך רק להיות בתרחיף, ללא חלקיקים גדולים (> 10 מיקרומטר) לאבן המתאימה microfluidic אנקפסולציה. לדוגמה, שיטת הוחל בעבר למדגם של מי-ים באמצעות סדרה של שטיפת וסינון צעדים כדי לעבד מראש את התאים לפני כימוס17.
פרוטוקול SiC-seq מייצר כמות רצף נתונים דליל יחסית של כל תא ותא, לא יכול להיות מתאים עבור כל היישומים. כמה אלגוריתמים ביואינפורמטיקה כגון דה נובו הגנום הרכבה או משתנה נוקלאוטיד יחיד (SNV) מתקשר דורשים במעמקי כיסוי גבוה יותר לעבוד ביעילות. במקום זאת, ברקוד קבוצות יכולים להיות מקובצים באשכולות סיליקו מאת בטקסונומיה שיטות binning27 כך אלגוריתמים יכול להיות מיושם על קבוצות גדולות של קריאות. היעילות barcoding הכוללת נמוכה יחסית של זרימת העבודה SiC-seq יכול גם להציג אתגרים במקרים בהם הזמינות של המדגם קלט נמוכה. SiC-seq מסתמך על צעד כימוס ברקוד פואסון-מבוזרות, לכן כ- 10% של התאים מקבלים ברקוד מולקולרית, הם מוגבר במהלך השלב הסופי ספריית הכנה. אמנם זה להשוות ערכות barcoding מבוסס-microdroplet10, משתמשים העובדים עם דגימות תאים יקר שיש קושי להשיג את התשואה ספריית נאותה של רצף, ייתכן שתצטרך להגדיל את מספר מחזורי PCR בגמר שלב הגברה. פתרון פוטנציאלי נוסף עבור משתמשים בעלי מומחיות microfluidic הוא למיין טיפות ברקוד חיובי לאחר השלב ה-PCR דיגיטלי, ובכך להביא את היעילות הכוללת barcoding > 85%28.
כיוון עתידי פוטנציאלי SiC-seq טכנולוגיה מתאימה את זרימת העבודה עבור שימוש עם תאי יונקים, לסלול את הדרך החדשה מחקרים קליניים של תא בודד. לדוגמה, ניתוח של וריאציית עותק מספר בין אחד סרטן תאים מאי לקדם את ההבנה שלנו של התפקיד של הטרוגניות הפתולוגיה סרטן2. לחלופין, שילוב SiC-seq עם שיטות קיימות בדיקה ולהעשיר רצפי DNA של עניין29 תאפשר את רצף תא בודד יישוב של subpopulations או זנים נדירים של תאים. עם דגימות סביבתיים, הגנים בתוך מסלול מטבולי ידוע יכול להיות ממוקד וניתח התרגום לצד השכנה גנים לזהות את הרומן איי גנומית. מ בתוך סביבה הפונדקאי. האנושי, חיידקים פתוגניים כייל נמוך יכול להיות מבודד ודוגמאות וסודרו ברמת תא בודד כדי לבחון יותר מקרוב את מקורם genotypic של התקפה אלימה.

הגנום משמשת מעין טביעת אצבע של זהות הסלולר ותפקוד, המכיל מכלול של אורגניזם של קידוד פוטנציאל. הבנה של ביולוגיה תאית ברמת הגנום יכול להסביר את המגוון פנוטיפי שנצפה בתוך אוכלוסיות הטרוגניות התא. הטרוגניות זו ניכר במערכות ביולוגיות, ויש לו השלכות רחבות על מחלה ובריאות האדם. לדוגמה, ג'ין עותק מספר וריאציות בין תאים סרטניים מקושרים את התפתחות והתפשטות של סרטן1,2. זיהומים חיידקיים, פתוגניות האיים נוכח חלק קטן של הגנום יועבר בצורה אופקית, להוביל לשגשוג חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה3,4. אתגר ראשוני בלימוד הגנום ברמת תא בודד הוא כמויות נמוכות של DNA זמינים, כמו גם את הצורך לנתח את אלפי תאים כדי לדגום את המגוון המלא של אחרים. מסיבות אלו, מגבלות תפוקה ניסיוני יש הפריע את האפקטיביות של מחקרים מתא בודד, ממתח תוצאות לכיוון תאי הנפוץ ביותר. בידוד תא בודד טכניקות כגון זרימת מיון5,6, מלקחיים אופטיים7, embedment בתפזורת ג'לים8ולאחר מיקרופלואידיקה9 מסוגלים עיבוד מאות תאים עבור רצף; עם זאת, זה מייצג רק חלק קטן של דוגמאות לרוב. שיטה של רצף הגנום בתא יחיד עם תפוקה גבוהה במידה ניכרת תאפשר עמוק יותר ושלמה יותר פרופיל של אוכלוסיות תאים, ובכך הבהרת בתפקיד של גיוון genotypic בתוך קהילות אלה.
מיקרופלואידיקה droplet מאפשר מניפולציה תפוקה גבוהה של תאים, ריאגנטים הביולוגי בתוך מיליוני כורים בקנה מידה picoliter. עד כה, microdroplet טכנולוגיות השתמשו ללמוד דפוסי ביטוי דיפרנציאלי בין תאים ברקמות הטרוגנית10,11,12, עמוק רצף מולקולות ארוכות13,14 ,15, וניתוחים התנהגות כרומטין immunoprecipitation רצף (צ'יפ-seq) על תאים בודדים16. אכן, microdroplets מסוגלים תפוקה גבוהה, ממודר פעולות, שהופך אותם נוטה יישומים גנומיקה תא בודד. פיתוח טכנולוגיה זו מציג אתגרים טכנולוגיים ייחודיים משלו, עם זאת. תאים חייב להיות lysed, טהור, מוגבר עם הטיה מינימלי, לאוכלוסיות בצורה אחידה דגימת תאים. בנוסף, בשונה polyadenylated תעתיקים mRNA בתאים בתרבית של, יש מוטיב מולקולרי דומה אין הגנום כדי להקל על לכידתו של חומצות גרעין היעד. מסיבות אלו, רצף הגנום בתא יחיד היה קשה ליישם ב microdroplet פלטפורמות.
בעבודה זו, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של גישת שדווחה בעבר microfluidic תא בודד מסוגל רצף הגנום של עשרות אלפי תאים ניסוי יחידה17. באמצעות טכנולוגיה זו, הנקראת SiC-seq, תאים חיידקיים נמצאים במארז בקנה מידה מיקרון hydrogels בנפרד lysed, tagmented, ואת התמזגה עם microdroplet המכיל ברקוד oligonucleotide ייחודי, אשר הוא משולבים על גבי DNA גנומי של התא דרך חפיפה בודדת סיומת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR). Hydrogels לשמש מיכלים מבודדים שבהם DNA גנומי גבוהה משקל מולקולרי הוא sterically עטוף, ומאפשר מולקולות קטנות יותר כגון דטרגנטים, אנזימים lytic כדי לגשת ולטהר את הדנ א לפני barcoding18. פרוטוקול זה מעבד > 50,000 תאים בודדים תוך מספר שעות, וכתוצאה מכך ספרייה לבר-קוד מוכן רצף. בעקבות הרצף, הקריאות הם demultiplexed לפי הרצף תא בודד ברקוד שלהם, וכתוצאה מכך dataset מכיל מיליוני קוראת, כל אחד עם מדד הסלולר.

<table><tbody><tr><td>פרוסות סיליקון 3 אינץ', סוג P, דרגת בדיקה בתולית</td><td>פרוסות אוניברסיטה</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 פוטו-רזיסט</td><td>Microchem</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>מערכות ציפוי מיוחדות</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Photomasks</td><td>CadArt Servcies</td> <td>(מותאם אישית)</td><td>ראה קבצים משלימים לעיצובי מסכות</td></tr> מפתח <tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>484431 Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>תא הסרת גז</td><td>Bel-Art</td><td>42025</td><td></td></tr><tr><td>0.75 מ"מ אגרוף ביופסיה</td><td>World Precision Instruments 504529</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ זכוכית (75 מ"מ x 50 מ"מ)</td><td>קורנינג</td><td>294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel (טיפול בזכוכית הידרופובית)</td><td>Pittsburgh Glass Works</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>PE-2 צינורות פוליאתילן</td><td>Scientific Commodities</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרקים</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 מחטים מד</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td> New <td>Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500 שמן פלואור ( HFE)</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>FC-40 שמן פלואור</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>PEG-PFPE</td> פעילי שטח <td>רן ביוטכנולוגיות</td><td>008-FluoroSurfactant</td><td></td></tr><tr><td>מחמם חלל</td><td>Lasko&nbsp;</td><td>CD09250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז, טמפרטורת ג'ל נמוכה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>a9414</td><td></td></tr><tr><td>TE (10X)</td><td>רוקלנד</td><td>mb-007</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X, pH 7.4</td><td>E& K Scientific Products</td><td>EK-65083</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (מדיום שיפוע צפיפות)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>d1556</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H-פרפלואורו-1-אוקטנול (PFO)</td>טווח <td>370533</td><td></td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td></tr><tr><td>80 (סורביטן מונואולאט)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>הקסאן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20 (פוליסורבט 20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme Type IV</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase (אנזים ליטי שמרים)</td><td>Zymo Research</td><td>e1004</td><td></td></tr><tr><td>Lysostaphin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7386</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Teknova</td><td>d9750</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום דודציל סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>ניו אינגלנד ביוסיינסס</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, 200 הוכחה (100%)</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I (כתם חומצת גרעין)</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (אוקטילפנול אתוקסילט)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex Master Mix (מיקס מאסטר התחלה חמה בנאמנות גבוהה)</td><td>ניו אינגלנד ביוסיינסס</td><td>m05365</td><td></td></tr><tr><td>פלטינום מולטיפלקס PCR מאסטר מיקס (Taq Master Mix)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart 2.0 Bst פולימראז (פולימראז איזותרמי)</td><td>New England Biosciences</td><td>m0538m</td><td></td></tr><tr><td>NT buffer מערכת Nextera XT (מאגר נטרול)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>מהפך פלואורסצנטי קתודה קרה</td> <td>(מותאם אישית)</td> <td>(מותאם אישית)</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח DC</td><td>Mastech</td><td>HY1503D</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 3 אקדח אנטי סטטי</td><td>Milty</td><td>5036694022153</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מזרק צנטריפוגה מודפס בתלת מימד</td> <td>(מותאם אישית</td><td>) (מותאם אישית)</td> <td>ראה קבצים משלימים לקובץ הדפסת תלת מימד</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & רכז-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr></tbody></table>

פלטפורמת microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

טכנולוגיות רצף עברו שינוי פרדיגמה של צובר לרזולוציה תא בודד בתגובה הבנה המתפתחת של התפקיד של הטרוגניות הסלולר במערכות ביולוגיות. עם זאת, תא בודד רצף של אוכלוסיות גדולות יש כבר הקשו על ידי מגבלות בעיבוד הגנום עבור רצף. בנייר זה, אנו מתארים שיטה של רצף הגנום בתא יחיד (SiC-seq) אשר משתמשת מיקרופלואידיקה droplet כדי לבודד, להגביר, ברקוד הגנום של תאים בודדים. תא אנקפסולציה בתוך microgels מאפשר טיהור ממודר tagmentation של ה-DNA, בזמן מיזוג microfluidic זוגות ביעילות כל הגנום עם ברקוד ייחודי oligonucleotide תא בודד, ומאפשר > 50,000 תאים בודדים היה לסדרם לכל הפעלה. רצף הנתונים demultiplexed על ידי ברקוד, יצירת קבוצות של קריאות שמקורם תאים בודדים. כשיטת תפוקה גבוהה ולא נמוכה-הטיה של תא בודד רצף, SiC-seq יאפשר מגוון רחב יותר של גנומית מחקרים מכוון אוכלוסיות מגוונות תא.

SiC-seq ניסיוני זרימת העבודה מכיל 3 מכשירים microfluidic PDMS מפוברק באמצעות הליך ליתוגרפיה רך (איור 1). Dropmaker זרימה ושיתוף (איור 3 א) יוצר מיקרומטר 25 של טיפות ברקוד דיגיטלי עבור תיוג הדנ א עם מזהה ייחודי של תא בודד. Oligonucleotides הברקוד מורכב bp 15 מנוונת רצף ולצדו PCR ידיות הגברה (טבלה 2, בר פריימר). הברקודים נמצאים מדולל כדי ריכוז femtomolar כדי להשיג את עטיפת מולקולה בודדת, ולקבל כל טיפות fragment(s) ברקוד או 0 או 1. טיפות המכילות ברקוד הם מוגבר, מניב עותקים רבים של גדילי כפול הברקוד amplicons. כתם חומצת גרעין משמש כדי לוודא הגברה מוצלחת ולכמת את קצב עיטוף של השברים ברקוד (איור 4B). Microgels הנוצרים על-ידי שיתוף זורם השעיה תא החיידק, ג'ל agarose מותכת במחירים שווים זרימה (איור 2 א). Agarose מוכן-פעמיים הריכוז הסופי הרצוי, כמו תהליך dropmaking זרימה משותפת ביעילות מדללת את הפתרונות מימית בפקטור של 2. כפי agarose מתקררת, הוא עפור לתוך microgel בקוטר 25 מיקרומטר שיתפסו נפח כדורית של ה-droplet.
סדרה של צעדים רוחצים את פירוק מטהרת את הדנ א הגנומי ב microgels (איור 2B) גבוהה משקל מולקולרי. לאחר שבירת את אמולסיות, שוטף מימית מתבצעות בכמויות גדולות כדי לדלל את עקבות ממיסים אורגניים אשר יכול לעכב את הטיפולים אנזימטי במורד הזרם. Microgels שטף שנצפו תחת מיקרוסקופ כדי לאמת את קצב עיטוף תא (איור 4A). קוקטייל של אנזימים עם פעילות lytic רחב נוסף המתלה microgel לעכל את קירות התא של חיידקים, חיידקים האיקריוטים19. טיפול השנייה עם Proteinase K ודטרגנט ונמחקות החלבונים, solubilizes שאריות תאים.
Tagmentation של ה-DNA מטוהרים מתבצעת טיפות כדי למנוע זיהום צולב פוטנציאלי הנובע פעפוע של tagmented קטן שברי DNA בין microgels18. מכשיר כימוס droplet (איור 3B) compartmentalizes כל microgel עם אנזים מאגר ו tagmentation, אשר בו זמנית קטעים כפול גדילי DNA בעת גם "מסמן" אותה עם oligonucleotide שנטענו מראש20. Microgels נטענים לתוך טיפות כמו חלקיקים לזינוק, להשגת המחירים כימוס מתקרב microgel 1 עבור כל טיפה עם כמה doublets21 (איור 4C).
בשלב הסופי של זרימת העבודה microfluidic (איור 2C), התקן מבצע פעולה המיזוג זוגי המשלב טיפה ברקוד 1 טיפה המכילות microgel 1, את הגברה התמהיל בתהליך בן שני שלבים מבוקרים. ראשית, droplet המכיל PCR ריאגנט לזווג, התמזגה עם טיפה ברקוד באזור שמוצג צהוב (איור 5). אלקטרודות מים מלוחים בערוץ microfluidic לייצר מעבר צבע גבוהה שדה חשמלי אשר מפעיל את המיזוג droplet. באופן דומה, ה-droplet הממוזג הראשון הוא מזווג עם טיפונת microgel, התמזגה בפעם השנייה באזור מוצגים בצבע אדום. טיפות נאספים, תרמי רכב על אופניים מחוץ שבב ב סיומת יחיד-חפיפה (SOE) PCR. בקצות משלימים וחופפים הברקוד ואת הדנ א הגנומי tagmented מאפשרים היתוך הגברה מעריכית של בונה לבר-קוד רק כראוי.
רצף הנתונים קודם המסוננות לפי איכות קריאה וכי אז מנותח על ידי קיבוץ של הקריאות לפי הרצף שלהם 15-bp תא בודד ברקוד. עבור קבוצה ברקוד להיחשב חוקיים, עליה להכיל מספר מינימלי של קריאות; סף זה מגביל את הניתוח לתאים עם כמות רצף נתונים שימושי ומסירה את הברקוד מוטציה ב- PCR "יתומים" ערכת הנתונים. במדגם זה לרוץ, הסכום המינימלי מוגדר כ- 7.5 קילו לכל קבוצה (50 קריאות של 150 bp כל). היסטוגרמה של הסעיפים ברקוד לעומת גודל הקבוצה מראה כי חלק ניכר של הקבוצות ברקוד תקף מעל גודל הסף (איור 6A).
בניסוי שליטה שבהן ידוע הרכב הקהילה מיקרוביאלי, משמשים את הטוהר ואת השפע היחסי מדדים כדי להעריך את איכות משחק ההמ-SiC לרוץ. . הנה, קהילה 10-תא סינתטי של חיידקים גראם שליליים 3, 5 חיידקים גראם חיוביים, שמרים 2 הוא ניתח. הטוהר של קבוצת ברקוד נתון מוגדר מספר קריאות מיפוי הגנום הנפוץ ביותר בקבוצה מחולק על ידי המספר הכולל של קריאות בקבוצה. הרוב המכריע של הקבוצות ברקוד יש purities גדול מ- 0.95 (איור 6B). שפע יחסי של סוגי תאים מחושבת על ידי ספירת את קריאות raw, על ידי ספירת קבוצות ברקוד, שבו הקבוצות מוקצים סוג התא המתאים הקונצנזוס הקריאות חבר שלה (איור 6C). השפע של קריאות וקבוצות ברקוד לעקוב אחר בפרופורציות שווה בערך, המציין כי הם להיות שנדגמו האוכלוסיות תא כזה כי מינים מסוימים לא כלולים בקבוצות קטנות או גדולות פרופורציה ברקוד. התוויית בסקירה צבירה של קבוצות ברקוד כל בזן אחד מציין כיסוי גבוהה ברחבי הגנום כולו, עם אזורי הנשירה כמה או לא (איור 7). ניתנת לאימות כמקורית האחידות של כיסוי עם התפלגות שכיחויות של ערכים כיסוי מנורמל, עם ערכים רוב ממורכזת סביב הממוצע (איור 7, הזחה).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> איור 1 : ייצור של microfluidic התקנים על ידי פוטוליתוגרפיה. (א) מאסטר תבניות עם תכונה אחת לגובה מיוצרים על ידי סחרור ציפוי שכבה של סו-8 photoresist על גבי רקיק סיליקון. Photoresist הוא בדוגמת ואז עם מסכה photolithographic, UV אור, crosslinking SU-8 חשוף. לבסוף, uncrosslinked סו-8 הוא מומס אמבט מפתח. העובש שנוצר משמש להטיל PDMS אשר מודבקת על שקופית מזכוכית כדי לייצר את המכשיר microfluidic מלאה. (B) עבור התקן שכבה כפולה, הזיוף באופן דומה מתחיל בצעדים ציפוי וחשיפה ספין. שלבים אלה חוזרים לאחר מכן ליצור התקן דו שכבתי. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> איור 2: סקירה של זרימת העבודה SiC-seq. המתלה מיקרוביאלית (א) A הוא מעורקיה משותפת עם agarose מותכת במכשיר dropmaker כדי לכמס תאים בודדים ב- microgels. (B) microgels נחשפים לסדרת שוטף לטהר את ה-DNA גנומי חיידקי. Lytic אנזימים מעכלים את קירות התא של חיידקים גראם חיוביים, שמרים, אבקת solubilizes ההריסות הסלולר. Microgels הם מחדש שעברו אנקפסולציה לתוך טיפות עבור tagmentation להקטין זיהום צולב. (ג) המיזוג microfluidic משלב ברקוד PCR דיגיטלי הגנום microgel tagmented, שילוב הגברה בקצב &gt; קילוהרץ. את שבב דליה כליף-PCR splices ברקוד תא בודד ייחודי על גבי הגנום tagmented והגדלה באופן סלקטיבי לחלוטין בונה לבר-קוד. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> איור 3: Microfluidic התקנים לצורך כימוס מחדש dropmaking ו- microgel. (א) לוח זה מראה dropmaker זרימה ושיתוף (25 מיקרומטר של תכונה גובה). מותכת agarose והתאים הם הציגו לתוך המכשיר במחירים שווים זרימה כדי לייצר 25 טיפות מיקרומטר בצומת מיקרומטר מיקרומטר x 25 25. עבור ברקוד דיגיטלי dropmaking, מפרצון תא מחובר לחשמל ולאחר שילוב PCR מוחדרים לים agarose. (B) לוח זה מציג מכשיר כימוס מחדש microgel (25 מיקרומטר של תכונה גובה). Microgels לזרום לתוך מפרץ צר בצורת משפך לשמור על הזמנת לזינוק שלהם ולקבל נפח של tagmentation לערבב לפני העטיפה מחדש-צומת מיקרומטר מיקרומטר 25 x 30. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> איור 4 : Micrographs של טיפות, microgels. (א) לוח זה מראה שטף microgels מיקרומטר 25 לפני פירוק אנזימטי. החיידק fluorescently מוכתמים על כימות של קצב עיטוף. פואסון טעינת נתונים סטטיסטיים להכתיב כי התאים להיות שעברו אנקפסולציה בקצב של 1 ב 10 טיפות או פחות כדי למזער את התדירות של אירועים מרובים-כימוס. (B) לוח זה מציג תמונת מיקרוסקופ זריחה של 25 טיפות ברקוד דיגיטלי של מיקרומטר, מטופלים עם כתם חומצת גרעין. טיפות המכיל קטעים ברקוד מוגבר לייצר אות חזק זריחה. (ג) לוח זה מראה microgels מחדש במארז 50 טיפות מיקרומטר. סגור-האריזה של microgels מאפשר כימוס המחירים מתקרבת ג'ל 1 לכל טיפה עם כמה doublets. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> איור 5 : Microfluidic התקן המיזוג כפול עבור barcoding הגנום בתא יחיד. מבצע מיזוג של שני שלבים זוגות ברקוד טיפות עם הגנום tagmented ב תפוקה גבוהה. Droplet של PCR מיקס ראשון שנוצר, התמזגה עם טיפונת ברקוד באזור שמוצג צהוב באמצעות אלקטרודות מים מלוחים. בשלב הבא, droplet המכיל microgel הציג, התמזגה בפעם השנייה באזור מוצגים בצבע אדום. שמן אינלטס מאפשרים שליטה מדויקת של המרווח בין טיפות reinjected. תא reinjection ברקוד ושמן מרווח שלה ממוקמים על השכבה מיקרומטר 25 קצר יותר, מוצללים בכחול. כל שאר התכונות המכשיר שייך לשכבה עבה יותר עם 45 מיקרומטר של גובה מוחלט. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> איור 6 : ברקוד המדדים קבוצה עבור קהילה מיקרוביאלי סינטטי 10-תא. (א) לוח זה מציג ההתפלגות של הברקוד גודל הקבוצות. מספר קבוצות של גודל נתון יורדת אקספוננציאלית כמו עליות גודל הקבוצה. הסף המינימלי של 7.5 קילו לכל קבוצה מגביל את הניתוח לקבוצות עם כמות מספקת של מידע ומסיר את רצף ה-PCR-מוטציה "יתומים". (B) לוח זה מציג ההתפלגות של ברקוד קבוצה purities. הרוב המכריע (&gt; 90%) של הקבוצות הן של טוהר גבוהה מאוד (&gt; 95%). (ג) לוח זה מציג שפע יחסי של 10 מינים החישוב ברמת הקבוצה קריאה ו ברקוד. 2 שיטות ספירה לייצר תוצאות דומות, המציין כי גודל קבוצה ברקוד יהיו עקביים ברחבי מינים. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> איור 7 : צבירה גנומית סיקור Bacillus subtilis קבוצות ברקוד. קורא כל הקבוצות ברקוד מיפוי החיידק B. subtilis (N = 9,398) הם איחדו וניתח במצטבר. מפת כיסוי מעגלית מדגים אחידות כיסוי הקריאות SiC-seq, עם אזורים לא נושרת מבית הנצפה. קו מקווקו סביב המעגל מציין את הכיסוי הממוצע (5.55 x). ההיסטוגרמה שיבוץ של התדרים כיסוי יחסית מציגה בכמויות גדולות של הבסיסים מכוסים בעומק בקרבת הממוצע הגנום כולו, המיוצג על-ידי הקו המקווקו. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>התקן</td>
			<td>גובה השכבה הראשונה (מיקרומטר)</td>
			<td>הראשונה שכבת ספין מהירות (rpm)</td>
			<td>בשכבה 2nd גובה (מיקרומטר)</td>
			<td>2 שכבת ספין מהירות (rpm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>שיתוף זרימה dropmaker</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>ג'ל encapsulator מחדש</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>המיזוג כפול</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: פרמטרי ייצור ההתקן Microfluidic. טבלה זו מציגה רשימה של התקנים microfluidic שנמצאים בשימוש בזרימת העבודה SiC-seq שלהם במהירויות הנדרש לסיבוב photoresist ציפוי (מבוסס על מפרטי היצרן עבור 3025 SU-8).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תווית</td>
			<td colspan="5">רצף (5' &gt; 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>בר</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: פריימר רצף.
משלימה קובץ 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
קובץ משלים 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

תא בודד רצף חושף הטרוגניות genotypic במערכות ביולוגיות, אך טכנולוגיות הנוכחי חוסר התפוקה הכרחי עבור פרופיל עמוק של הקהילה הרכב ותפקוד. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה microfluidic עבור רצף > הגנום בתא יחיד 50,000 מ מגוונות תא אוכלוסיות.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לייצר נתוני ריצוף גנומי מקודדים מעשרות אלפי תאים בודדים באמצעות סדרה של מכשירים מיקרופלואידיים. שיטה זו משיגה תפוקת ריצוף של תא יחיד שאין שני לו. אנו משתמשים במיקרופלואידיקה כדי לעטוף, ליז ולברקוד תאים בנפרד, תוך שמירה על הטרוגניות גנומית בסיסית, שאובדת בהלם קונבנציונלי במחקרי ריצוף.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא בעלת תפוקה גבוהה ומסוגלת לייצר נתונים של תא בודד מעשרות אלפי תאים. למרות שאנו עובדים עם מיקרובים בהדגמה זו, ניתן להתאים את זרימת העבודה לשימוש עם סוגי תאים שונים באמצעות שינויים קלים במידות המכשיר המיקרופלואידי. כדי להתחיל את הפרוטוקול, הכינו מיליליטר אחד של 3% משקל לנפח טמפרטורת התכה נמוכה במאגר 1X Tris-EDTA, או TE.שמור את תמיסת האגרוז על גוש חום של 90 מעלות צלזיוס רק עד לטעינת המזרק. השעו מחדש תאים במיליליטר אחד של מי מלח עם חוצץ פוספט, או PBS, וסובבו את התאים. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של 17% נפח למדיום שיפוע צפיפות נפח ב-PBS, והשאירו את התאים על הקרח עד לטעינת המזרק.לאחר מכן, טען מזרק של שלושה מיליליטר בשמן פלואור, או HFE, המכיל חומר פעילי שטח PFPE-PEG של 2% משקל למשקל. התקן אותו עם מחט בגודל 27, והנח אותו במשאבת מזרק. טען את מתלה התאים ואת האגרוז המותך למזרקים של מיליליטר אחד, שניהם מתאימים למחטים בגודל 27, והנח אותם במשאבות מזרק.לאחר מכן, הגדר את מחמם החלל לגבוה, ומקם את משטח החימום במרחק של 10 סנטימטרים מהמזרק. ודא שהטמפרטורה הנמדדת במזרק היא כ-80 מעלות צלזיוס. לפני הכנסת הצינורות למכשיר, הפעל את המשאבות כדי להוציא את האוויר מהקו.חבר את מחטי המזרק לכניסות המכשיר המיקרופלואידי באמצעות חתיכות צינורות פוליאתילן, או PE. חבר חתיכת צינור לשקע, והנח את הקצה החופשי בצינור איסוף של 15 מיליליטר. לאחר הטיפה, הנח את צינור האיסוף בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להבטיח ג'לציה מלאה של האגרוז.הסר את שכבת השמן התחתונה מצינור האיסוף באמצעות מזרק של שלושה מיליליטר המצויד במחט בגודל 20, תוך הקפדה לא להפריע לשכבה העליונה של טיפות האגרוז. הוסף מיליליטר אחד של 10% נפח לנפח PFO ב-HFE כדי לשבור את טיפות האגרוז משכבת פעילי השטח שלהן. פיפטו את התמיסה למעלה ולמטה למשך דקה אחת כדי לצפות היטב את האמולסיות, שאמורות להיות הומוגניות וללא גושים.סובב את הצינור החרוטי ב -2, 000 פעמים גרם למשך דקה אחת כדי לאסוף את המיקרוג'לים של האגרוז. שאפו את הסופרנטנט PFO/HFE, וודאו שהמיקרוג'לים נקיים כעת משכבת פעילי השטח שלהם והם שקופים. לאחר שטיפת המיקרוג'לים, ודא את עטיפת התאים במיקרוג'לים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 400 על ידי צביעת 10 מיקרוליטר של ג'לים בצביעה של חומצת גרעין 1X.חבר את כניסת התאים של מכשיר טיפת זרימה משותפת עם חתיכה קטנה של הלחמת עופרת. לפני הכנסת הצינורות למכשיר, הפעל את המשאבות כדי להוציא את האוויר מהקו. חבר חתיכת צינור לשקע, והנח את הקצה החופשי בצינור PCR בנפח 0.2 מיליליטר.השתמש בקצבי הזרימה על המסך לביצוע טיפות. אסוף את הטיפות לתוך צינורות ה-PCR עם כ-50 מיקרוליטר טיפות בכל צינור. לאחר הטיפה, הסר בזהירות את השכבה התחתונה של שמן HFE מהאמולסיות באמצעות קצות פיפטה לטעינת ג'ל, והחלף אותה בשמן פלואור FC-40 המכיל חומר פעילי שטח PFPE-PEG במשקל של 5%.לאחר מכן, תכנת את המחזור התרמי. לפני הכנסת הצינורות למכשיר, הפעל את המשאבות כדי להוציא את האוויר מהקו. חבר את המזרקים המכילים HFE, תערובת תיוג ומיקרוג'ל לכניסות המכשיר המיקרופלואידי באמצעות חתיכות צינורות PE.חבר חתיכת צינור לשקע, והנח את הקצה החופשי במזרק ריק של מיליליטר כשהבוכנה נמשכת לקו המיליליטר. לאחר מכן, ודא את קצב עטיפת המיקרוג'ל תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 400. התקן את המזרק המכיל את תחליבי התיוג בעזרת מחט, ודגר אותו זקוף בבלוק חום או בתנור למשך שעה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס כדי לפצל את ה-DNA הגנומי.הכן את טיפות הברקוד למיזוג על ידי החלפת שבר השמן FC-40 ב-HFE 2% משקל למשקל PFPE-PEG. העבירו בזהירות את הטיפות למזרק של מיליליטר, הכניסו אותו למחט והניחו אותו במשאבת מזרק. טען את מזרק טיפות המיקרוג'ל המודגר והמתויג לתוך משאבת מזרק.לאחר מכן, חבר את שלושת מזרקי הנתרן הכלורי לשני כניסות האלקטרודות וכניסת החפיר היחיד באמצעות חתיכות צינורות PE. לפני הכנסת הצינורות למכשיר, הפעל את המשאבות כדי להוציא את האוויר מהקו. חבר את שלושת מזרקי ה-HFE המותקנים על המשאבות לשני כניסות השמן המרווחות וכניסת השמן לייצור טיפות באמצעות חתיכות צינורות PE.לאחר מכן, ירה בכל צינורות ההזרקה מחדש של טיפות עם אקדח אנטי סטטי לפני חיבור הצינור למחטי המזרק. חבר את מזרק תערובת ה-PCR, מזרק טיפת המיקרוג'ל ומזרק טיפת הברקוד לכניסות שלהם עם צינורות PE. חבר את המחט של מזרק האלקטרודה למהפך פלואורסצנטי קתודה קרה באמצעות קליפ תנין.הגדר את ספק הכוח DC של הממיר לשני וולט. הפעל את התקן המיזוג הכפול עם קצבי הזרימה המומלצים. אסוף את הטיפות לצינורות PCR עם כ-50 מיקרוליטר תחליב בכל צינור.לפני המחזור התרמי, הסר בזהירות את השכבה התחתונה של שמן HFE מהאמולסיות באמצעות קצות פיפטות טעינת ג'ל, והחלף אותם בשמן פלואור FC-40 המכיל חומר פעילי שטח PFPE-PEG במשקל של 5%. לאחר מכן, תכנת את המחזור. כדי לשחזר את ה-DNA מטיפות המחזור התרמי, אסוף את הטיפות לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה, ושבר את האמולסיות באמצעות 20 מיקרוליטר של PFO.מערבלים אותם למשך 10 שניות לערבוב. סובב את הצינור. הסר בזהירות את השכבה המימית העליונה מהצינור באמצעות פיפטה, והעביר אותה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.השלך את שלב השמן. לאחר מכן, המשך לבסוף לשלבי הכנת הספרייה, הרצף והניתוח. היסטוגרמה של ספירת הברקודים לעומת גודל הקבוצה מראה שחלק ניכר מקבוצות הברקוד החוקיות נמצא מעט מעל 7.5 זוגות קילו-בסיס לגודל סף קבוצה, מה שאינו כולל את היתומים שעברו מוטציה ב-PCR.השפע היחסי של סוגי התאים מקהילה סינתטית של 10 תאים של שלושה חיידקים גרם שליליים, חמישה חיידקים גרם חיוביים ושני שמרים חושב על ידי ספירת הקריאות הגולמיות וקבוצות הברקוד. מפת כיסוי מעגלית של קריאות B.subtilis מכל קבוצות הברקוד ממחישה את האחידות של קריאות SiC-seq, ללא אזורי נשירה נצפים, שבהם הכיסוי הממוצע היה פי 5.55. אחידות הכיסוי אומתה באמצעות התפלגות תדרים של ערכי כיסוי מנורמלים.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על קצב אנקפסולציה של כברקוד או תא אחד לכל 10 טיפות. זה מגביל את הסבירות לאירוע אנקפסולציה כפול, שיכול לסובב את נתוני התא הבודד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להגדיר ולהפעיל את המכשירים המיקרופלואידיים המשמשים ליצירת נתוני ריצוף של תא בודד.לאחר שליטה, ניתן להפעיל טכניקה זו תוך שמונה שעות או יומיים של ארבע שעות.

an-ultrahigh-throughput-microfluidic-platform-for-single-cell-genome

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

אנו מציגים גישת microfluidic לביטוי של מערכי חלבון. המכשיר מורכב מאלף תאי תגובה הנשלטים על ידי מייקרו שסתומים מכאניים. מכשיר microfluidic הוא הזדווגו לספריית גן microarray-מודפסת. גנים אלו אז מתועתקים ומתורגמים על שבב, וכתוצאה מכך מערך חלבון מוכן לשימוש ניסיוני.

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

אנחנו פיתחו תרבות תא אוטומטית וחקירת פלטפורמה לניסויי גירוי תא מיקרו בקנה מידה. הפלטפורמה מציעה שליטה פשוטה, תכליתית, ומדויקת בטיפוח ועידוד אוכלוסיות קטנות של תאים, ומחל lysates לניתוחים מולקולריים. הפלטפורמה מתאימה גם למחקרים המשתמשים בתאים ו / או חומרים כימיים יקרים.

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

מפורט במסמך זה הם הפרוטוקולים מבצע והרכבה של פלטפורמה ההקרנה microfluidic מודולרי עבור האפיון שיטתית של מוליכים למחצה colloidal nanocrystal syntheses. דרך מערכת מתכוונן במלואו הסדרים, אוסף ספקטרה יעילים ביותר עשוי להתבצע על פני 4 סדרי גודל סולמות זמן התגובה בתוך מרחב הדגימה שבשליטת העברת מסה.

טכנולוגיה Microfluidic מודולרי עבור מחקרים שיטתיים של מוליכים למחצה Colloidal Nanocrystals

רצפי זמן-קריאה מאוד להקל על ההרכבה של הגנום מורכבים ואפיון של וריאציה מבנית. אנו מתארים שיטה כדי ליצור רצפים ארוכים במיוחד על ידי רצף nanopore מבוססי פלטפורמות. הגישה מאמצת הוצאה DNA ממוטבת ואחריו ההכנות ספריית ששונה כדי להפיק מאות קריאות kilobase עם כיסוי מתון של תאים אנושיים.

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

רצף Nanopore הוא טכנולוגיה חדשנית המאפשרת רצפי בעלות חסכונית במיקומים מרוחקים והגדרות משאב-עני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור רצף של mRNAs מתוך דם שלם התואם לתנאים כאלה.

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

תהליך הייצור של מכשיר מבוסס PDMS, רב שכבתי, microfluidic המאפשר שעתוק ותרגום מבחנה (IVTT) התגובות להתבצע על פני תקופות ממושכות מתוארת. יתרה מזאת, סקירה מקיפה של החומרה והתוכנה הדרושה להפיכת תגובות אלה לאוטומטיות ולשמירה על המשך ממושך מסופקת.

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

אנו מציגים מערכת מיקרופלואידית למחקרי תפוקה גבוהה על מכונות חיים מורכבות, המורכבת מ-1500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטליות משופרות ומודולוס ערבוב באתר. השבב המיקרופלואידי מאפשר ניתוח של התנאים המיקרו-סביבתיים המורכבים והדינמיים ביותר ב-vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

תאי גידול במחזור (CTC) הם קריטיים לחקר התקדמות הסרטן והגרורות. מאמר זה מציג פרוטוקול משולב בעל תפוקה גבוהה להעשרת CTC וריצוף CTC יחיד, המשפר את יעילות הלכידה וטוהר ה-CTC תוך הפחתת עלויות הזיהום והריצוף, ובכך מקדם מחקר אונקולוגי מדויק ויישומים קליניים.

טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

למד שיטת ריצוף גנומי בתא יחיד בקנה מידה גבוה באמצעות מכשירים מיקרו-נוזליים. השיטה מאפשרת אנקפסולציה, פירוק וקידוד ברקוד של תאים בנפרד תוך שמירה על הטרוגניות גנומית.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

גלה סרטונים נוספים