Name: אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: למד אופטימיזציה של הידבקות תאי גזע מזנכימליים אנושיים לסקפולדים מסיבי PCL אלקטרוספין. השיטה משווה תנאי סטטיים ודינמיים להגברת ההידבקות הראשונית בהנדסת רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות וללהכיר במועצה למחקר הרפואית למימון מחקר זה - G1000788-98812 קוד מענק MRC-DPFS.

ייצור ועיקור 1.Scaffold <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר PCL ב1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol לתת 10% w / v ריכוז. כפי שתואר בוסוורת &#39;ואח&#39;, 9 electrospin פתרון פולימרים (הפרמטרים: 20 kV, 1 מיליליטר / שעה, 20 סנטימטרים). ולאסוף מיושר סיבים על קצה mandrel מסתובב (600 סל&quot;ד). עם אזמל להסיר את הסרט של סיבים שנאספו ואז לחתוך לאורכים קצרים יותר - 3 סנטימטר (לשקתות וכלי סיבוביים) ו- 4 סנטימטר (לתרבית תאים מוסיף) אורכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים קנס להטביע רצועות בודדות במים מזוקקים ולהסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק שני הקצוות בין האגודל לאצבע; לסובב ידני את הרצועה עד שדומה חוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לצלול הפיגום דמוי חוט הזה במים מזוקקים ומניח על אי-סיבי כרטיס נקי, לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שיבש מקום, בנפרד בצינורות microcentrifuge נקיים ולהוסיף 1 מיליליטר של 50% אתנול v / v במים מזוקקים. סגור את המכסים ולהשאיר למשך 24 שעות. הערה: בצע את השלבים תחת זרימה למינרית הבאה: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות microcentrifuge בזרימה למינרית ולשאוב את פתרון v / v 50%. החלף עם 1 מיליליטר אתנול 70% v / v במים מזוקקים, קרובים מכסים ומשאירים למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור 90% ו 100% אתנול v / v במים מזוקקים (1 מיליליטר כרכים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פיגומי פעמיים עם תמיסת מלח פוספט (PBS), 24 שעות לכל לשטוף (2 x 1 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהחליף עם תקשורת ותרבות תא 1 מיליליטר. הערה: פיגומים מוכנים לשעת שימוש לאחר 24. </li></ol> 2. קביעת שטח פן פיגום ומספר התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת ההדמיה מיקרוסקופ ואור, למדוד את הקוטר של חוט electrospun לאורכו כדי לקבוע ערך ממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תניח חוט להיות מוט גלילי ולהתקרב לשטח פנים באמצעות: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפה פני שטח =, r = רדיוס וh = אורך הערה: השטח היה מחושב להיות 18902, 800 מיקרומטר 2. יתר על כן, יש לציין כי השטח בפועל יהיה גדול יותר מחישוב זה כחוט מורכב ממאות סיבים עדינים, אשר יגדילו את שטח הפנים. כתוצאה מכך מספר גדול יותר של תאים צריך להיות מסוגל לצרף אל הגרדום. עם זאת, זה לא משפיע על השוואה ישירה בין קבוצות בדיקה שנעשית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המספר המרבי של תאים שיכולים לצרף אל פני השטח הפיגום נחשף על ידי: הערה: שימוש בתוכנת מיקרוסקופ והדמיה אור, הקוטר של תאי גזע mesenchymal האדם היה נחוש להיות 20 מיקרומטר (תאי הנחה הם עגולים), ולכן במקרה זה, מספר התאים = 60200. </li></ol> 3. פיגום Set-up - Cell תרבות תוספות (איור 1 א) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הזרימה למינרית, לפתוח את התרבות מוסיף תא 6-גם סטרילי ולהפריד את הטבעות קצרות עם שיניים מהגופים רחבות מוקפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הטבעת עם שיניים מצביעות כלפי מעלה. לעטוף אחדשל פיגומי 4 סנטימטרים מעל מרכז הטבעת לוודא שזה חופף בשני הצדדים. קח את הגוף ועמדה מוקפים על טבעת השיניים ופיגום ולדחוף כלפי מטה כדי לוודא שהפיגום נשאר בעמדה והשקרים דרך המרכז של להכניס את תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום להכניס תרבית תאים עם פיגום לתוך הבאר של היטב 6, צלחת מחייבת נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של תקשורת בתרבות לפיגום. </li></ol> 4. פיגום Set-up - שוקת (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הזרימה למינרית, פולי המקום (tetrafluoroethylene) (PTFE) שקתות לצלחות פטרי אישיות ולהוסיף 10 מיליליטר של תקשורת בתרבות לשוקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים לעטוף אחד 3 פיגומי סנטימטרים לתוך השוקת, כדי לוודא שאורכו נמצא במקביל לקצה הארוך של השוקת. </li></ol> 5. פיגום Set-up - כלי Bioreactor (איור 1 ג) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הזרימה למינרית, להפריש 10 מיליליטר PBS סטרילי באמצעות כלי של bioreactorנמל ועיקרי להשאיר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS ולהחליף עם תקשורת והתרבות 8 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להכניס אחד מפיגומי 3 סנטימטר לתוך הכלי דרך היציאה הראשית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הנמל הראשי. </li></ol> ספירת 6. Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות אנושיים גזע mesenchymal (hMSC) נגזרים ממח עצם על פי פרוטוקול עד למעבר 4 לפני קציר יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מסנטימטר 75 2 בקבוק המכיל hMSCs נגזר ממח עצם (קטע 4, confluency 80%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS ולשאוב 10 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר טריפסין ודגירת הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד התאים וחילצה ממשטח הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 מיליליטר תקשורת ותרבות כדי להשבית את האנזים ולהעביר נפח זה כולל (10 מיליליטר) לצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend השעיה תא זה על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים כדי לפזר הומוגנית תאים בתוךתקשורת וagglomerates תא גבול (10 פיפטה מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 20 μl של השעיה תא והעברה לhaemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את haemocytometer תחת מיקרוסקופ אור ותמונה במטרת x10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס קווי הרשת ולספור את מספר התאים ב4 x 4 ריבועים בכל פינה של הרשת ואשר נופלים בתוך הריבוע ואלה החוצים את יד ימין או קו גבול תחתון. רוזן לכל סט של 4 x 4 ריבועים (4 סעיפים לרשת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ספירת resuspension ותא שלוש פעמים (שלבים 6.6-6.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את ספירת תאים הממוצעת ולקבוע את עוצמת הקול של מדיה הנדרשת לresuspension תא (תא ריכוז 60200 ב -200 μl). לדוגמא, לקבוע את ספירת תאים הממוצעת מhaemocytometer ולאחר מכן לקבוע את המספר הממוצע הכולל של תאים משלושה סעיפים נפרדים. תכפיל את זה ב 1 x 10 4 לתת מספר התאים למ&quot;ל, ואז להכפיל בנפח הכולל של השעיה תא לתת למספר הטל של תאים. השתמש בנוסחא הבאה כדי לקבוע נפח של תקשורת הנדרשת לresuspension: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב241 XG במשך 5 דקות. </li></ol> זריעת 7. Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מצינור centrifuged עוזב את התא גלולה ולהחליף עם מחושב נפח התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים והתקשורת אפילו לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה Gilson P200, לוותר לאט 200 μl של השעיה תא על כל פיגום על ידי הפעלת קצה פיפטה לאורך הפיגום ומתחת לפני השטח הנוזלי תקשורת. השאר באין מפריע במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכלי bioreactor, לוותר 200 μl של השעיה תא דרך היציאה הראשית. Top-עד התקשורת נותרה 2 מיליליטר התרבות דרך יציאות המזרק כדי לתת נפח כולל של 10 מיליליטר. </li></ol> 8. ניסויי התחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כלי bioreactor לbioreactor RCCS-4DQ ולהגדיר כדי לסובב בשעה 9 בסל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טראןספיר הצלחות גם עם התרבות מוסיף תא ושקתות לצלחת שייקר ולהגדיר כדי לסובב ב 30 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחות גם עם התרבות מוסיף תא ושקתות למדף של חממת תא נקבעה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (תרבות סטטית). </li></ol> 9. DNA Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות - מאגר תמוגה, מאגר 1x TE, תקני ה- DNA ופתרון עובד DNA תא - בהתאם להנחיות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, להסיר את הדגימות מהחממה ולמקם תחת הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השברים תקשורת מכל המדגמים ומניח בצינורות צנטריפוגה שכותרתו בנפרד. צנטריפוגה הצינורות 241 XG. הסר את supernatant ולהוסיף למאגר תמוגה 3 מיליליטר. Resuspend הפתרון להתפרקות התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים להסיר את הפיגומים ומקום בצינורות צנטריפוגה המכילים 3 מיליליטר חיץ תמוגה (לפיגומים בתוך כלי bioreactor, להסיר את הפיגום לפני aspiratingקוטר). לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא, לשחרר ראשון פיגום על ידי חיתוך הפיגום בסמוך לשפת של insert באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של חיץ תמוגה לכל כלי קיבול פיגום ולגרד את פני השטח (במרץ להתסיס לכלי bioreactor). הסר את מאגר תמוגה ומניח בצינורות צנטריפוגה שכותרתו בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת כל צינור צנטריפוגות במשך כ 1 דק &#39;על מנת להבטיח תסיסה מספקת של התאים וחיץ ולעודד תמוגה של קרום התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת גם שחורה 96, להוסיף למאגר תמוגה 100 μl לכל חלק מדגם - פיגום, תקשורת וגם (לשכפל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחושך, להוסיף של פתרון ה- DNA תא 100 μl לכל הבארות המכילות מאגר תמוגה ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל בארות עם חיץ תמוגה מכיל לא פתרון ה- DNA ו- DNA של התאים כדי לספק שליטה שלילית וחיובית לצלחת גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בצלחת-קורא הקרינה, למדוד את הספיגה של הבארs באמצעות 485 ננומטר עירור ופליטת 520 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשוות את הנתונים עם עקומת הסטנדרט שנוצרה מתקני ה- DNA על פי הוראות היצרן. </li></ol> 10. סריקת אלקטרונים מיקרוסקופ קיבוע (SEM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים תחת זרימה למינרית: לאחר 4 שעות, להסיר את כל הפיגומים מהקיבול והמקום שלהם בתוך צלחת 6-היטב חדשה (בארות נפרדות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים על הספסל הפתוח: כל אחד היטב, להוסיף 2 מיליליטר של 1.5% glutaraldehyde v / v בPBS, כדי להבטיח כיסוי של הפיגום מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הצלחת למשך 30 דקות מינימום ב 4 מעלות צלזיוס במשך קיבוע תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מקבע ולשטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את הפיגומים עם הגדלת ריכוזים של אתנול במים מזוקקים מתחילה עם 50% v / v, ואחריו 70% v / v ו- 90% v / v. עבור כל ריכוז, submerse מלא הפיגומים בsolution (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 3 דקות. מחק את הפתרון וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליבש באתנול 100% על ידי submersing מלא הפיגומים בפתרון (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 5 דקות. מחק את הפתרון וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימי לייבש את הפיגומים באמצעות hexamethyldisilazane (HMDS) בתוך ארון קטר. לטבול את הפיגומים בHMDS (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 5 דקות. הסר את HMDS וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את HMDS ולאפשר הפיגומים לייבוש. הר הפיגומים של ספחי SEM זמינים מסחרי (במקרה זה ספחי נירוסטה עם כרטיסיות פחמן דבק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקל על הצפייה בSEM, מעיל הדגימות באמצעות coater זהב-גמגום למשך 2 דקות על מנת להבטיח כיסוי דק ואפילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מקום בתוך SEM ולדמיין את פיגומי תא זרע באמצעות קרן אלקטרונים 5 קאב. </li></ol>

<ol><li>Jauregui, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+biomaterials.+The+role+of+several+extracellular+matrix+components+in+the+attachment+of+non-transformed+fibroblasts+and+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+transactions%2FAmerican+Society+for+Artificial+Internal+Organs%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells.</a> ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33 (2), 66-74 (1986).</li>
<li>Puca, A., Russo, G., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Mechano-Transduction+via+Simulated+Microgravity+and+its+Effects+on+Intracellular+Trafficking+of+VEGFR%27s%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's.</a> Oncotarget. 3 (4), 426(2012).</li>
<li>Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulated+microgravity+impairs+leukemic+cell+survival+through+altering+VEGFR-2%2FVEGF-A+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway.</a> Annals of biomedical engineering. 33 (10), 1405-1410 (2005).</li>
<li>Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Turning+Lateral+Vessel+Bioreactor+Improves+Embryoid+Body+Formation+and+Cardiogenic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Cellular Reprogramming. 15 (5), 443-458 (2013).</li>
<li>Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+the+Microgravity+Rotating+Culture+System+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells.</a> Molecular biotechnology. 54 (2), 331-336 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotating+Microgravity-Bioreactor+Cultivation+Enhances+the+Hepatic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+on+Biodegradable+Polymer+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (21-22), 2376-2385 (2012).</li>
<li>Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-ceramic+Composite+Scaffolds+for+Bioreactor-based+Bone+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 471 (8), 2422-2433 (2013).</li>
<li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+suspension+culture%3A+the+rotating-wall+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), F12-F25 (2001).</li>
<li>Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+2D+and+3D+electrospun+scaffolds+intended+for+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24 (6), 1605-1614 (2011).</li>
<li>Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+in+hydroxyapatite-loaded+microsphere-based+scaffolds.%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 757-767 (2011).</li>
<li>Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+cell+sheet+technology+and+electrospun+scaffolding+for+engineered+tubular%2C+aligned%2C+and+contractile+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels.</a> Biomaterials. 35 (9), 2713-2719 (2014).</li>
<li>Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+electrospun+scaffolds+for+annulus+fibrosus+tissue+engineering%3A+effect+of+scaffold+structure+and+composition+on+annulus+fibrosus+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro.</a> Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).</li>
<li>Yavin, E., Yavin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+and+culture+of+dissociated+cells+from+rat+embryo+cerebral+hemispheres+on+polylysine-coated+surface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface.</a> The Journal of cell biology. 62 (2), 540-546 (1974).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guan%2C+of+focal+adhesion+kinase+with+its+potential+substrate+phosphatidylinositol+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (21), 10148-10152 (1994).</li>
<li>Grant, D. S., Tashiro, K. -I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+different+laminin+domains+mediate+the+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro.</a> Cell. 58 (5), 933-943 (1989).</li>
<li>Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+engineering%3A+cell+seeding%2C+cultivation+parameters%2C+and+tissue+construct+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization.</a> Biotechnology and bioengineering. 64 (5), 580-589 (1999).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מטריצות סיבי electrospun מפוברקות מbiopolymers משמשות באופן קבוע כדי לתמוך מצורף תא ושגשוג עבור יישומים ביולוגי ו / או הנדסת רקמות 11,12. במקרים אלה, המטריצות הן לעתים קרובות סדינים דקים של סיבים בקלות לכסות את כל הבסיס של צלחת גם תרבית תאים ובכך נמצאים בקשר מלא עם תאי זרע אשר משפר מצורף תא. עם זאת, אם הפיגום הביולוגי אינו מכסה את הבסיס של הצלחת גם באופן מלא, יש סיכוי גבוה שחלק גדול מתאי זרע לא יישאר במגע עם הפיגום וסופו של דבר לא תוכל לצרף. מחקר זה בדק כמה שיטות שונות לזריעת תאים על פיגומים שאינך מכסים את הבסיס של הצלחת גם, על מנת לקבוע טכניקה מותאמת שיכול להיות מומלצת לניסויים מבוססי תאי עתיד. חמישה סט-אפים שונים נחקרו (איור 1): scaffoLDS (חוט electrospun) שנערך באמצעות מוסיף תרבית תאים בתוך צלחות גם מחייב נמוכים וגם כל הזמן תחת תנאים סטטיים או מזועזע ליום 30 בסל&quot;ד; פיגומים ממוקמים בתוך שקתות PTFE צרות והחזיקו סטטי או מזועזעים ליום 30 בסל&quot;ד; ופיגומים שוכנו בתוך כלי bioreactor מסתובבים בסל&quot;ד 9. קביעת מספר התאים שדבקו בחוטי electrospun ידי assay DNA הוכיח אחוז נמוך של קובץ מצורף לכל להגדיר קופצים זריעה (איור 2); וזה אושר גם מסריקת micrographs אלקטרונים (SEM) (איור 3). קובץ מצורף גדול תא - 30% או ~ 18060 תאים ד&quot;ר גינזבורג נצפה לחוטים שהוחזקו בתוך התרבות מוסיף תא ונתונים לתנועה רציפה. מעניין, קובץ מצורף הנמוך ביותר תא (15%) הושג עבור חוטים שנערכו על ידי התרבות מוסיף תא אבל כל הזמן תחת תנאים סטטיים, אשר הייתי מציע כי הכללת תנועת רדיאלי יש השפעה חיובית על שמירת תאים במגע עם הפיגום. עם זאת,יש לציין כי מלקחיים רציפים של הזרימה של התקשורת עשויים להיות אחראים לagglomerates התא נצפה מתמונות SEM. הצלחת שייקר נקבעה על ההגדרה הנמוכה ביותר שלה - 30 סל&quot;ד - אשר יכולה להיות מגבלה להגדרה זו. בתנועות איטיות רדיאלי עשויה לעזור למנוע או להפחית את מסכת תא וגם יכול לשפר מצורף תא כמו תאים חווים פחות כוח. ניסויים עתידיים צריכים להתמקד באופטימיזציה של המהירות שייקר האידיאלית עבור קובץ מצורף תא משופר. שילוב תנועה לחוטים שנערכו בתוך השקתות לא הביא למגמה דומה, עם שני תרחישי מניב קובץ מצורף 18% (~ 10836 תאים); למרות שזה יכול להיות בגלל הציפה החלקית של הפיגומים בתוך השקתות (נצפה לשקתות מונחות על הצלחת שייקר) כפי שהם אינם מעוגנים לבסיס. צף חלקי של הפיגום ימנע את כל תאים ששקעו לתחתית השוקת מלבוא במגע עם החומר והדבקות. לtההגדרה המסוימת שלו, השוקת שכנה בתוך צלחת פטרי וסך הכל 10 מיליליטר נפח התקשורת הוסיף. הממדים הקטנים של השוקת אומר כי הרוב המכריע של התקשורת קיים בתוך צלחת פטרי ואם יש תנועה, תאים עשויים להתרחק מן השוקת לצלחת פטרי ולהישאר לגמרי מחוץ להישג ידם של הפיגום. כדי להתגבר על מגבלות אלה, ניסויים נוספים צריכים לכלול צעד נוסף בפרוטוקול, לפיה את הקצוות של הפיגומים שהוצמדו לבסיס של השקתות באמצעות קנס-מחטים סטריליות, כיוון שזו צריכה למנוע הציפה והתנועה (במיוחד שלהם לפיגומים החשופים ל תנועת רדיאלי), שסופו של דבר צריך להוביל לעלייה במספר התאים הקשורים בפיגום. 16% מתאים שמחוברים לחוטים הנוכחיים בתוך כלי סיבוביים. למרות היותו טכניקה מבוססת היטב לתרבות 3D, בעיות לא מתעוררות עם הסרת פיגומים מהנמל העיקרי של כלי, אשר עשויים להסתיים באופן רופף ATTACתאי הד לאיבוד. כלי שניתן לפתוח באופן מלא היה למנוע את הבעיה; אלה זמינים לרכישה, אבל הם הרבה יותר יקרים מאשר כלי חד פעמי המשמשים במחקר זה. מחקר זה מדגים את הבעיות הנוכחיות עם זריעת פיגומים שאינם מכסים את כל הבסיס של צלחות גם תרבית תאים סטנדרטית. זריעת מספר תא ידוע הביאה פחות מ מצרף שלישית לפיגום, למרות שטח הפנים של הפיגום המאפשרים לכל התאים לדבוק. לכך יכולה להיות השלכות מזיקות במבחנים מבוססי תאים אחרים שעשויים להעריך את ההתאמה הביולוגית ותא-חומר / תאי תאי ההתנהגות ואינטראקציות עם הפיגום כהתקן רפואי עתידי אפשרי. מגבלות נוספות של המחקר עשויות לכלול את נקודת זמן 4 שעות - למרות היותו מספיק זמן כדי להבטיח זריעת תאים ראשונית (תאים הוכחו לצרף היטב למצעים בתוך שלושים דקות 13,14,15), זה עשוי להיות סביר בvestigate נקודות הזמן מאוחר יותר מתן תאים אינם מתרבים במסגרת זמן ארוכה יותר כמו זה שאחרת להטות את מספר התא מתחיל. הקטנת הנפח של תקשורת, במקרה זה 10 מיליליטר, יכול גם לשפר את הקשר בין התאים והפיגום וסופו של דבר להגדיל את קובץ מצורף תא. מחקרים עתידיים צריכים לקחת בחשבון גם את כדאיויות תא כתהליך של זריעת תאים יכול לגרום לניזק לתאים ו / או תא מות 16. מבחני DNA התא אינם מבחינים בין תאי קיימא ולא ברי קיימא, כמו assay מת / כגון חי, למשל, הייתי להדגיש את רמת הכדאיות. חקירה זו מעלה את מודעות למספר האמיתי של תאים שמייחסים לפיגום למרות זריעת כמות ידועה. ללימודים המסתמכים על מספר ההתחלה של תאים, חשוב מאוד שחוקרים יודעים בדיוק כמה של דמות שאכן לדבוק במצע של עניין.

פיגומים באופן שיגרתי בשלבי פיתוח ומחקר ליישומים ביולוגי והנדסת רקמות. ככזה, הם זורעים בדרך כלל עם תאים וההתנהגות במבחנה שלהם מאופיינים באמצעות מבחני הקובעים שגשוג תאים ומספר תא, למשל. בניסויים כגון אלה, קיימים הכרח כי מספר התאים הראשוני ידוע ולעתים קרובות חוקרים לקבוע את ריכוז הזריעה במונחים של מספר התאים למ&quot;ל או 2 סנטימטר. בזמן הזה הוא תרגול טוב, בעיקר למטרות בהיקף של עד, זה אינו לוקח בחשבון את המספר האמיתי של תאים שידבקו אל פני השטח הפיגום (שהוא גם תלוי במאפייני ההדבקה של פני השטח הביולוגי 1). הדבר נכון במיוחד עבור פיגומים שאינם מכסים את כל הבסיס של הצלחת גם תרבית התאים כמו תאים עלולים ליפול מהמבנה ו, בשל האופי לעתים קרובות סטטית של הניסוי, ייתכן שלעולם לא יחזרו במגע עם החומר של inteשאר. חוטי electrospun סיבים הם דוגמא טובה של פיגום שאינו מכסה את הבסיס של הבאר (איור 1 א). במקרה זה, יש להשתמש בצלחות גם מחייב נמוכים שלא היו שטופל פני השטח כדי למנוע מתאים הקשורים בשטח של הצלחת ולכן מעוותים את התוצאות של assay כל מבוסס היטב. הצלחות גם משמשות בקלות לזריעת תאים על פיגומים, אבל הם לא השיטה היחידה זמינה. מערכות תרבית תאי רוטרי, סוג של bioreactor שפותח על ידי החטיבה למדעי החיים בנאס&quot;א בשנת 1980 מאוחר, יכולות לשמש באופן דומה לזרע פיגומים בסביבה תלת-ממדית (3D) עם כביד מדומה. סוג זה של bioreactor עדיין בחירה פופולרית עם חוקרים ברחבי העולם וכבר שולב במחקרים לתא איתות 2,3, תאי גזע והנדסת רקמות 4,5 6,7. מה שעושה את bioreactor הסיבובי עדיף על צלחות גם הוא התחזוקהשל סביבת 3D, אשר מסייעת במניעת תאים מובחנים מdedifferentiating, כפי שקורה לעתים קרובות כאשר בתרבית בתוך תנאי 2D קונבנציונליים 8. מאמר זה חוקר טכניקות שונות לזריעת תאי גזע mesenchymal אנושיים על פולי electrospun (ε-caprolactone) חוטי סיבים כמפוברקים בוסוורת &#39;et al., 9 במטרה למקסם את המספר הראשוני של תאים הקשורים בפיגומים האלה בתוך תקופה של 4 שעות. לתרבות 2D, חוטים נערכו באופן מאובטח בתוך צלחות גם או פולי מחוייט (tetrafluoroethylene) שקתות (PTFE) והמשיכו בתנאים סטטיים, או מזועזע ליום 30 בסל&quot;ד. לתרבות 3D, חוטים ותאים הוחזקו בתוך כלי bioreactor מסתובבים בסל&quot;ד 9.

<table><tbody><tr>אספקת <td>מים מזוקקים</td><td></td><td>בבית n/a</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Merck</td><td>1117271000</td><td></td></tr><tr><td>פוספט תמיסת מלח חוצצת</td><td>Life Technologies</td><td>70013016</td><td></td></tr><tr><td>תאי גזע מזנכימליים אנושיים</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>MSC מדיה לתרבית</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-28010B</td><td>מחומם ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש</td></tr><tr><td>תערובת תוספי</td><td>תזונה PromoCell GmbH</td><td>C-39810</td><td>הוסף למצע תרבית</td></tr><tr><td>תערובת אנטיביוטית/אנטי-מיוטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>הוסף למצע תרבית</td></tr><tr><td>טריפסין (0.05%) EDTA (0.02%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59417C</td><td>התחמם ל-37 &#176; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים (T75)</td> <td>Becton Dickinson Ltd</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות כריכה נמוכה</td><td>Costar Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>6-well CellCrowns</td><td>Scaffdex</td><td>C00003S</td><td></td></tr><tr><td>Petri-dish 50 מ"ל</td><td>סטרילין</td> עמוק <td>124</td><td></td></tr><tr><td>שקתות PTFE</td><td>ייצור ביתי</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>RCCS חד פעמי כלים 10 מ"ל</td><td>Synthecon</td><td>D-410</td><td></td></tr><tr><td>4 כלי מערכת תרבית תאים סיבובית ביו-ריאקטור</td><td>סינתקון</td><td>RCCS-4DQ</td><td></td></tr><tr><td>צלחת שייקר</td><td>סטיוארט</td><td>SSM1</td><td>מיני שייקר אורביטלי</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>דיגיטלי ביו</td><td>DHC-F01</td> צינור צנטריפוגה <td>חד פעמי C-Chip</td></tr><tr><td></td><td>Deltalab</td><td>352096, 429901</td><td>15 מ"ל ו-50 מ"ל</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>מזרק Hettich</td><td>Rotafix 32 A</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל</td><td>Shield Medicare Ltd</td><td>3039820</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות</td><td>סטרילין</td><td>40305, 47310, 40125</td><td>5, 10 ו-25 מ"ל</td></tr><tr><td>פיפטות גילסון</td><td>SLS</td><td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td><td>P2 - P1000</td></tr><tr><td>קצות פיפטות</td><td>SLS</td><td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה מיקרו 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen Assay</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>הגדרת בדיקה בצלחת</td></tr><tr><td>שחורה כהה 96 בארות</td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות פלואורסצנטי</td><td>BGM Labtech</td><td>FLUOstar Optima</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td> <td>TAAB Laboratories</td><td>G002</td><td>מיוצר לריכוז של 1.5% v/v ב-PBS</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Sigma</td><td>999-97-3</td><td></td></tr><tr><td>בדלי אלומיניום (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>טבליות פחמן (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>ציפוי מקרטע זהב</td><td>אדוארדס</td><td>S150B</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)</td><td>Phenom World</td><td>Phenom Pro</td><td></td></tr></tbody></table>

אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

מחקר לביו-חומרים והנדסת רקמות לעתים קרובות כולל במבחנה חקירות מבוססות תאים, אשר דורשות ידע ראשוני של מספר התאים מתחיל. בעוד חוקרים נפוצים התייחסות צפיפות הזריעה שלהם זה לא בהכרח מצביע על המספר האמיתי של תאים שדבקו בחומר מדובר. הדבר נכון במיוחד במקרה של חומרים, או פיגומים, שאינך מכסים את הבסיס של צלחות גם תרבית תאים סטנדרטית. מחקר זה חוקר את הקובץ המצורף הראשוני של תאי גזע אנושיים mesenchymal זורעים במספר ידוע על פולי electrospun (ε-caprolactone) חוט לאחר 4 שעות בתרבות. חוטי electrospun הוחזקו בתוך כמה סט-אפים שונים, כוללים כלי bioreactor מסתובבים בסל&quot;ד 9, תרבות מוסיף תא ממוקם בצלחות נמוכות מחייבות היטב וpolytetrafluoroethylene שקתות (PTFE) ממוקמים בתוך צלחות פטרי. שני האחרונים היו נתונים לשני תנאים סטטיים או מיקומו על צלחת שייקר (30 <spastyle = &quot;font-size: -14 פיקסלים; קו-גובה: 28px;&quot; n&gt; סל&quot;ד). לאחר דגירה 4 שעות ב 37 מעלות צלסיוס, 5% CO 2, המיקום של תאים שנזרעו נקבע על ידי assay DNA תא. פיגומים הוסרו מאריזותיהם והניחו במאגר תמוגה. חלק התקשורת הוסר באופן דומה וcentrifuged - supernatant מושלך וגלול נפרד מאגר תמוגה. תמוגה חיץ נוסף לכל כלי קיבול, או גם, וגרד לשחרר את כל תאים שעלולות להיות נוכח. Assay DNA התא נקבע אחוז התאים הנוכחיים בתוך הפיגום, התקשורת והשברים היטב. קובץ מצורף תא היה נמוך לכל הסט-אפ ניסיוני, עם קובץ מצורף הגדול ביותר (30%) לחוטים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא ונתונים לרועדים תנועה. מחקר זה מעלה את מודעות למספר האמיתי של תאים הקשורים בפיגומים בלי קשר לצפיפות זריעת תא המוצהרת.

התוצאות מדגישות את מיקומם של התאים הבאים שלאחר זריעה 4 שעות לכל ניסיוני הגדרה נחקרו. איור 2 א ממחיש את אחוז התאים שמחוברים אל פני השטח הפיגום בתקופה זו. גורם המרה של 8.5 pg / תא משמש להמרת תוכן DNA נמדד במספר תא ובכך לקבוע את אחוז התאים 10. לכל להגדיר קופצים הזריעה נחקר, אחוז המצורף תא הוא נמוך יחסית, עם דבקות הגדולה תא (30%) לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא ומזועזע ליום 30 בסל"ד (הכנס אכר). הדבקות הנמוכה ביותר (15%) הייתה לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא וכל זמן תחת תנאים סטטיים (הכנס סטטי). מספר גדול של תאים נכחו בתוך שבריר התקשורת (איור 2), בעיקר לתרבות מוסיף תא שנערך בתוך צלחות נמוכות מחייבות (הכנס סטטי) וכלי סיבוביים להיות 50% ו- 51%בהתאמה. פיגומים שנערכו בתוך השקתות הפגינו מספר גדל מתאים קיימים בתוך המחזיק עצמו - 48% מתאים לשוקת שאכר ו -50% לשוקת סטטי. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אפשר הערכה חזותית של פיגומי תא-זרע (איור 3). נציג תמונות מודגשות נוכחות מוגבלת של תאים על פני השטח הסיביים, ללא קשר לזריעת הגדרה. עם זאת, מספר גדול יותר של תאים והתא agglomerates נכחו על הפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא ומזועזע ליום 30 בסל"ד (הכנס אכר). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg"> איור 1. ניסיוני סט-אפ, שבו electrospun חוט מוחזק במסגרת; (א) מוסיף תרבית תאים וצלחת גם מחייב נמוך; פולי (B) (tetrafluoroethylene) שוקת (PTFE) וצלחת פטרי; ו(ג) כלי bioreactor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg"> מיקום 2. איור של תאים 4 שעות Post-זריעה על PCL electrospun חוטים באמצעות הגדר קופצים זריעה שונה. () מדגים את אחוז התאים שצורפו לפיגום PCL (ממוצע ± סטיית תקן); (ב) מדגיש את התפשטות אחוז מיקום תא בתוך שלושה שברים - תקשורת, גם ופיגום (n = 4, הנתונים שהוצגו כ אומר ערכים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig3.jpg" ftp_upload> איור 3. הנציגים micrographs אלקטרונים סורק עבור PCL חוטים electrospun עם תאי גזע mesenchymal האדם, 4 שעות לאחר זריעה ראשונית באמצעות ניסיוני סט-אפים שונים. (כל התמונות בהגדלה 1,000X, סרגל קנה מידה = 130 מיקרומטר.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

מאמר זה מתאר מגוון של מערכים לזריעת תאי גזע מזנכימליים אנושיים על חומרים, במקרה זה חוטים אלקטרו-ספוניים, שאינם מכסים את הבסיס של לוחות באר תרבית סטנדרטיים על מנת למקסם ולכמת את מספר התאים שמתחברים בתחילה בהשוואה לצפיפות הזריעה הידועה.

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

בהליך זה, פיגומי PCL מסובבים אלקטרו מוגדרים בדרכים שונות כדי לקבוע מערך זריעת תאים אופטימלי. ראשית, הפיגומים הסטריליים ממוקמים במערכים השונים הנחקרים, כולל תוספות תרבית תאים, שקתות וכלים סיבוביים של ביו-ריאקטור. ברגע שהם נמצאים במקום, מספר ידוע של תאים נזרעים על הפיגום ואז נשארים ללא הפרעה למשך 20 דקות.לאחר מכן כל הדגימות מועברות בזהירות לחממה, מוגדרות 5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס, ונתונות לתנאים סטטיים או דינמיים לפני שעות העבודה. לאחר זמן תרבית זה, מספר התאים שנצמדו לפיגום נקבע על ידי בדיקת DNA כדי לכמת את כמות התאים באמצעי הפיגום ובשברי הבאר. בסופו של דבר, זה מושג על ידי כימות ה- DNA הקיים על הפיגום, הבאר ובמדיה שמסביב כדי לראות את ההצמדה של תאים לפיגומים משתמשים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק או SEM.הרעיון למחקר הזה עלה לנו לראשונה כשידענו שהפיגומים שלנו לא מכסים את כל בסיס לוחית הבאר, מה שאומר שהייתה אפשרות שלא כל התאים יהיו במגע עם הפיגום ולכן יוכלו להתחבר. כדי להתחיל, הגדר את תוספות תרבית התאים מתחת לזרימת הלמינה על ידי פתיחת תוספות תרבית התאים הסטריליות של שש בארות והפרדת הטבעות הקצרות יותר עם השיניים מהגופים הטבעתיים הרחבים יותר. לאחר מכן קחו את הטבעת כשהשיניים פונות כלפי מעלה ועטפו את אחד מפיגומי ארבעת הסנטימטרים מעל מרכז הטבעת, וודאו שהיא חופפת משני הצדדים.קח את הגוף הטבעתי ומקם אותו מעל טבעת השן והפיגום. לאחר מכן דחף כלפי מטה, וודא שהפיגום נשאר במקומו ומונח דרך מרכז תרבית התאים. להוסיף. הנח את תוספת תרבית התאים עם פיגום לבאר של צלחת כריכה נמוכה של שש בארות, והוסף 10 מיליליטר של אמצעי תרבית לפיגום.לאחר מכן הניחו שקתות פוליטטרפלואורואתילן לצלחות פטרי בודדות והוסיפו 10 מיליליטר של מצע תרבית לשוקת. בעזרת מלקחיים עטפו את אחד מפיגומי שלושת הסנטימטרים לתוך השוקת, וודאו שאורכו מקביל לקצה הארוך יותר של השוקת. כדי להקים את כלי הביוריאקטור תחת זרימת למינה, הוציא 10 מיליליטר של מי מלח סטריליים עם פוספט או PBS דרך היציאה הראשית של כלי הביוריאקטור.לאחר 10 דקות, הסר את ה- PBS והחלף בשמונה מיליליטר של אמצעי תרבית באמצעות מלקחיים. הכנס אחד מפיגומי שלושת הסנטימטרים לכלי השיט דרך היציאה הראשית. לאחר מכן התייצב מחוץ ליציאה הראשית.לאחר ביצוע ספירת תאי גזע מזנכימליים אנושיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, שאפו את המדיה מצינור הצנטריפוגה היוצא מגלולת התא והחליפו בנפח המדיה המחושב. Resus משהה את התאים והמדיה לתערובת אחידה. בעזרת פיפטה P 200 גילסון הוציא לאט 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל פיגום על ידי העברת קצה הפיפטה לאורך הפיגום ומתחת למשטח נוזל המדיה.השאירו ללא הפרעה למשך 20 דקות, או שכלי הביוריאקטור חילקו 200 מיקרוליטר של תרחיף התאים דרך היציאה הראשית. מלאו את שני המיליליטר הנותרים של אמצעי התרבות על ידי יציאות המזרק כדי לתת נפח כולל של 10 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו את כלי הביוריאקטור לביו-ריאקטור של הכלי הסיבובי, והכינו להסתובב.בתשעה סל"ד, העבירו את לוחות הבאר עם תוספות ושקתות תרבית תאים לצלחת השייקר והגדירו להסתובב ב-30 סל"ד בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס, 5% או התרבית הסטטית. העבירו את צלחות הבאר עם תוספות תרבית התאים והשקתות למדף של חממת תרבית תאים. מוגדר על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.לאחר ארבע שעות, הוציאו את הדגימות מהחממה והניחו תחת זרימת למינה. לאחר מכן, הסר את שברי המדיה מכל הדגימות והניח בצינורות צנטריפוגה המסומנים בנפרד. לאחר צנטריפוגה למשך חמש דקות ב 241 פעמים G, הסר את הסופינט לפני הוספת שלושה מיליליטר של מערבולת חיץ ליזה, הפתרון לפירוק כדור התא שהפיגומים המוחזקים בתוך תרבית התא מוסיף ראשית, שחרר את הפיגום על ידי חיתוך הפיגום קרוב לקצה התוספות באמצעות פיגום.לאחר מכן בעזרת מלקחיים, הסר את הפיגומים והניח בצינורות צנטריפוגה המכילים שלושה מיליליטר של מאגר ליזה. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של מאגר ליזה לכל שקע פיגום וגרד את פני השטח. הסר את מאגר הליזיס והנח בצינורות צנטריפוגה המסומנים בנפרד.מערבולת כל צינור צנטריפוגה למשך כדקה אחת כדי להבטיח תסיסה מספקת ולעודד ליזה של קרום התא. בצלחת שחורה של 96 בארות הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל מדיית פיגום שבר דגימה, ובכן בחושך, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת DNA תאים לכל הבארות המכילות מאגר ליזה וערבב. כלול בעדינות בארות עם מאגר ליזה שאינו מכיל תמיסת DNA ותאי DNA כדי לספק בקרה שלילית וחיובית לצלחת הבאר.בעזרת קורא לוחות פלואורסצנטי, מדוד את ספיגת הבארות בעירור של 485 ננומטר ופליטה של 520 ננומטר. השווה את הנתונים לעקומה הסטנדרטית שנוצרה מתקני ה-DNA בהתאם להוראות היצרן לביצוע קיבוע SEM. לאחר ארבע שעות של דגירה, הסר את כל הפיגומים מכלי הקיבול שלהם והנח בתוך בארות נפרדות של צלחת חדשה של שש בארות וזרימת למינה.לאחר מכן שטפו את הפיגומים פעמיים עם PBS לכל אחד. ובכן, הוסף שני מיליליטר של 1.5% גלוטראלדהיד ב-PBS כדי להבטיח כיסוי מלא בפיגום. השאירו את הצלחת למשך 30 דקות לפחות בארבע מעלות צלזיוס לקיבוע סל.הסר את תמיסת הקיבוע ושטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS. לאחר מכן העבירו את הפיגומים לצלחת באר חדשה כדי לייבש אותם עם ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול במים מזוקקים, החל מ-50% אתנול ואחריו 70% ולאחר מכן 90% לכל ריכוז. טבלו את הפיגומים במלואם בתמיסה והשאירו למשך שלוש דקות לפני שזורקים את התמיסה וחוזרים על הפעולה.לאחר ייבוש הפיגומים ב-100% אתנול על ידי טבילה מלאה של הפיגומים בתמיסה והשארתם למשך חמש דקות, השליכו את התמיסה וחזרו על ייבוש כימי של הפיגומים. שימוש ב-HMDS בתוך ארון אדים. טבלו את הפיגומים ב-HMDS והשאירו למשך חמש דקות לפני הסרת ה-HMDS לאחר חזרה פעם אחת.הסר את ה-HMDS ואפשר לפיגומים להתייבש. לאחר מכן הרכיבו את הפיגומים על בדלי SEM הזמינים מסחרית כדי להקל על הצפייה בתוך שכבת ה-SEM, הדגימות עם שכבת ספוטר זהב למשך שתי דקות כדי להבטיח כיסוי דק ואחיד. לבסוף, מקם את הדגימות בתוך ה-SEM ודמיין את הפיגומים היושבים בתא באמצעות קרן אלקטרונים של חמישה קילו.התוצאות מדגישות את מיקום התאים לאחר ארבע שעות לאחר הזריעה עבור כל מערך ניסוי שנחקר. איור זה מדגים את אחוז התאים שנצמדו למשטח הפיגום במהלך תקופה זו שבה נחקרו כל מערכי הזריעה. אחוז ההתקשרות של התא נמוך יחסית, אך היצמדות התאים הגדולה ביותר לפיגומים המוחזקים בתוך תוספות תרבית תאים ומטלטלים ב-30 סל"ד.ההיצמדות הנמוכה ביותר הייתה לפיגומים שהוחזקו בתוך תוספות תרבית התאים ונשמרו בתנאים סטטיים. מספר רב של תאים היו נוכחים בתוך חלק המדיה, בעיקר עבור תרבית תאים. תוספות המוחזקות בתוך לוחות כריכה נמוכים ב-50% וכלים סיבוביים ב-51% פיגומים המוחזקים בתוך השקתות הדגימו מספר מוגבר של תאים הנמצאים בתוך המחזיק עצמו.48% לשייקר שוקת ו-50% לסריקה סטטית של שוקת. מיקרוסקופיה אלקטרו-מיקרוסקופית אפשרה הערכה חזותית של פיגומי התא שנזרעו. תמונות מייצגות הדגישו נוכחות מוגבלת של תאים על פני השטח הסיבי ללא קשר להגדרת הזריעה.עם זאת, מספר גדול יותר של תאים וצברי תאים היו נוכחים על הפיגומים שהוחזקו בתוך תוספות תרבית תאים וניערו ב-30 RP M.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב שזריעת מספר ידוע של תאים לא בהכרח שווה למספר התאים הרב שמתחברים בפועל לפיגום, במיוחד עבור פיגומים שאינם מכסים את כל בסיס לוחות הבר. עבור פיגומים כאלה, מומלץ לבצע תחילה אופטימיזציה של מערכי זריעה שונים של תאים על מנת למקסם את ההתקשרות הראשונית של התא לפיגום.

optimizing-attachment-human-mesenchymal-stem-cells-on-poly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תהליך electrospinning פולימרים של הנדסת רקמות והתרבות תא מופנית במאמר זה. באופן ספציפי, electrospinning של macromers photoreactive עם יכולות עיבוד נוסף של photopatterning ורב פולימר electrospinning מתואר.

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

מטרת מחקר זה הייתה לחקות את הארכיטקטורה יליד three שכבות של דופן העורק. כדי להשיג זאת, electrospinning הועסק עם השימוש נחיר (קלט פלט) 3-1 תערובות של polycaprolactone, אלסטין, קולגן ו.

Tri-שכבתית Electrospinning לחקות ארכיטקטורה העורקים באמצעות שפת Polycaprolactone, אלסטין, קולגן ו: מחקר ראשוני

מזדהות סיבים electrospun ישיר על גדילה של נוירונים במבחנה הם מרכיב הפוטנציאל של פיגומים התחדשות עצבים. אנו מתארים את הליך הכנת מצעים electrospun סיבים ותרבות חופשית בסרום של חושי העיקרי עכברוש E15 (DRG) ו הנוירונים המנוע. ויזואליזציה של נוירונים ידי immunocytochemistry כלולה גם.

תרבות מוטור ראשיים עצב סנסורי בתקשורת מוגדר על electrospun פולי-L-lactide nanofiber פיגומים

Electrospinning טכניקות יכולים ליצור מגוון של nanofibrous פיגומים להנדסת רקמות או יישומים אחרים. אנו מתארים כאן הליך כדי לייעל את הפרמטרים של הפתרון electrospinning ומכשירים להשיג סיבים עם מורפולוגיה הרצוי ויישור. בעיות נפוצות טכניקות לפתרון בעיות מוצגים גם.

יסודות Electrospinning: פתרון אופטימיזציה פרמטרים Apparatus

פיגומים Electrospun יכול להיות מעובד הייצור עבור יישומים הנדסת רקמות. כאן אנו מתארים שיטות ספינינג פיגומים מורכבים (על ידי ספינינג רצופים), להכנת פיגומים עבים יותר (על ידי שכבות רב באמצעות אדי חום או חישול), להשגת עקרות (ייצור מזוהם או פירסום הייצור עיקור) ו להשגת תכונות ביומכניים המתאימים.

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

סינתזה וייצור של סיבי electrospun ארוכים המשתרעים על שטח גדול יותר הפקדה באמצעות אספן חדש תוכנן מפולימר מתכלה רומן בשם פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) דווחה. הסיבים היו מסוגלים לתמוך בצמיחה של תאים שמקורם בתאי גזע pluripotent עכבר.

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק פיגומי nanofiber electrospun עם ארגון מדורג של סיבים ולחקור את היישומים שלהם בויסות מורפולוגיה תא / אורינטציה. הדרגתיים בכל קשורים לתכונות פיסיקליות וכימיות של פיגומי nanofiber מציע מגוון רחב של יישומים בתחום ביו-רפואיים.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

חומרים פולימריים סופר-הידרופוביים דו-ממדיים ותלת-ממדיים מוכנים על ידי אלקטרו-ספינינג או ריסוס אלקטרו פולימרים מתכלים מעורבבים עם פולימר בעל אנרגיית פני שטח נמוכה יותר בעל הרכב דומה.

בודה חומרים פולימריים עבור יישומים ביו-הידרופובי

פרוטוקול זה משמש כקו מנחה מקיף כדי לבדות פיגומים ויה electrospinning עם הפולימר נמס במצב כתיבה ישירה. אנו באופן שיטתי המתווה את התהליך, להגדיר את הגדרות הפרמטר המתאים להשגת ארכיטקטורות יישוב לגרדום.

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

כתב יד זה מתאר את ההליך כדי להמציא לאפיין את סיבי electrospun פולי Griffithsin-לאחרונה (חומצה לקטית-co-גליקולית) הממחישים דבק חזק ופעילות אנטי נגד זיהום מסוג 1 וירוס הכשל החיסוני האנושי במבחנה. שיטות השתמשו כדי לסנתז, שינוי פני השטח, לאפיין את המורפולוגיה וכתוצאה מכך, נטיה, ואת desorption של Griffithsin מסיבי השטח-השתנה מתוארים.

ייצור ואפיון של סיבים Griffithsin-השתנה פיגומים לצורך מניעת מחלות המועברות

למד אופטימיזציה של הידבקות תאי גזע מזנכימליים אנושיים לסקפולדים מסיבי PCL אלקטרוספין. השיטה משווה תנאי סטטיים ודינמיים להגברת ההידבקות הראשונית בהנדסת רקמות.

אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

גלה סרטונים נוספים