אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

בהליך זה, פיגומי PCL מסובבים אלקטרו מוגדרים בדרכים שונות כדי לקבוע מערך זריעת תאים אופטימלי. ראשית, הפיגומים הסטריליים ממוקמים במערכים השונים הנחקרים, כולל תוספות תרבית תאים, שקתות וכלים סיבוביים של ביו-ריאקטור. ברגע שהם נמצאים במקום, מספר ידוע של תאים נזרעים על הפיגום ואז נשארים ללא הפרעה למשך 20 דקות.

לאחר מכן כל הדגימות מועברות בזהירות לחממה, מוגדרות 5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס, ונתונות לתנאים סטטיים או דינמיים לפני שעות העבודה. לאחר זמן תרבית זה, מספר התאים שנצמדו לפיגום נקבע על ידי בדיקת DNA כדי לכמת את כמות התאים באמצעי הפיגום ובשברי הבאר. בסופו של דבר, זה מושג על ידי כימות ה- DNA הקיים על הפיגום, הבאר ובמדיה שמסביב כדי לראות את ההצמדה של תאים לפיגומים משתמשים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק או SEM.

הרעיון למחקר הזה עלה לנו לראשונה כשידענו שהפיגומים שלנו לא מכסים את כל בסיס לוחית הבאר, מה שאומר שהייתה אפשרות שלא כל התאים יהיו במגע עם הפיגום ולכן יוכלו להתחבר. כדי להתחיל, הגדר את תוספות תרבית התאים מתחת לזרימת הלמינה על ידי פתיחת תוספות תרבית התאים הסטריליות של שש בארות והפרדת הטבעות הקצרות יותר עם השיניים מהגופים הטבעתיים הרחבים יותר. לאחר מכן קחו את הטבעת כשהשיניים פונות כלפי מעלה ועטפו את אחד מפיגומי ארבעת הסנטימטרים מעל מרכז הטבעת, וודאו שהיא חופפת משני הצדדים.

קח את הגוף הטבעתי ומקם אותו מעל טבעת השן והפיגום. לאחר מכן דחף כלפי מטה, וודא שהפיגום נשאר במקומו ומונח דרך מרכז תרבית התאים. להוסיף. הנח את תוספת תרבית התאים עם פיגום לבאר של צלחת כריכה נמוכה של שש בארות, והוסף 10 מיליליטר של אמצעי תרבית לפיגום.

לאחר מכן הניחו שקתות פוליטטרפלואורואתילן לצלחות פטרי בודדות והוסיפו 10 מיליליטר של מצע תרבית לשוקת. בעזרת מלקחיים עטפו את אחד מפיגומי שלושת הסנטימטרים לתוך השוקת, וודאו שאורכו מקביל לקצה הארוך יותר של השוקת. כדי להקים את כלי הביוריאקטור תחת זרימת למינה, הוציא 10 מיליליטר של מי מלח סטריליים עם פוספט או PBS דרך היציאה הראשית של כלי הביוריאקטור.

לאחר 10 דקות, הסר את ה- PBS והחלף בשמונה מיליליטר של אמצעי תרבית באמצעות מלקחיים. הכנס אחד מפיגומי שלושת הסנטימטרים לכלי השיט דרך היציאה הראשית. לאחר מכן התייצב מחוץ ליציאה הראשית.

לאחר ביצוע ספירת תאי גזע מזנכימליים אנושיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, שאפו את המדיה מצינור הצנטריפוגה היוצא מגלולת התא והחליפו בנפח המדיה המחושב. Resus משהה את התאים והמדיה לתערובת אחידה. בעזרת פיפטה P 200 גילסון הוציא לאט 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל פיגום על ידי העברת קצה הפיפטה לאורך הפיגום ומתחת למשטח נוזל המדיה.

השאירו ללא הפרעה למשך 20 דקות, או שכלי הביוריאקטור חילקו 200 מיקרוליטר של תרחיף התאים דרך היציאה הראשית. מלאו את שני המיליליטר הנותרים של אמצעי התרבות על ידי יציאות המזרק כדי לתת נפח כולל של 10 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו את כלי הביוריאקטור לביו-ריאקטור של הכלי הסיבובי, והכינו להסתובב.

בתשעה סל"ד, העבירו את לוחות הבאר עם תוספות ושקתות תרבית תאים לצלחת השייקר והגדירו להסתובב ב-30 סל"ד בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס, 5% או התרבית הסטטית. העבירו את צלחות הבאר עם תוספות תרבית התאים והשקתות למדף של חממת תרבית תאים. מוגדר על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר ארבע שעות, הוציאו את הדגימות מהחממה והניחו תחת זרימת למינה. לאחר מכן, הסר את שברי המדיה מכל הדגימות והניח בצינורות צנטריפוגה המסומנים בנפרד. לאחר צנטריפוגה למשך חמש דקות ב 241 פעמים G, הסר את הסופינט לפני הוספת שלושה מיליליטר של מערבולת חיץ ליזה, הפתרון לפירוק כדור התא שהפיגומים המוחזקים בתוך תרבית התא מוסיף ראשית, שחרר את הפיגום על ידי חיתוך הפיגום קרוב לקצה התוספות באמצעות פיגום.

לאחר מכן בעזרת מלקחיים, הסר את הפיגומים והניח בצינורות צנטריפוגה המכילים שלושה מיליליטר של מאגר ליזה. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של מאגר ליזה לכל שקע פיגום וגרד את פני השטח. הסר את מאגר הליזיס והנח בצינורות צנטריפוגה המסומנים בנפרד.

מערבולת כל צינור צנטריפוגה למשך כדקה אחת כדי להבטיח תסיסה מספקת ולעודד ליזה של קרום התא. בצלחת שחורה של 96 בארות הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל מדיית פיגום שבר דגימה, ובכן בחושך, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת DNA תאים לכל הבארות המכילות מאגר ליזה וערבב. כלול בעדינות בארות עם מאגר ליזה שאינו מכיל תמיסת DNA ותאי DNA כדי לספק בקרה שלילית וחיובית לצלחת הבאר.

בעזרת קורא לוחות פלואורסצנטי, מדוד את ספיגת הבארות בעירור של 485 ננומטר ופליטה של 520 ננומטר. השווה את הנתונים לעקומה הסטנדרטית שנוצרה מתקני ה-DNA בהתאם להוראות היצרן לביצוע קיבוע SEM. לאחר ארבע שעות של דגירה, הסר את כל הפיגומים מכלי הקיבול שלהם והנח בתוך בארות נפרדות של צלחת חדשה של שש בארות וזרימת למינה.

לאחר מכן שטפו את הפיגומים פעמיים עם PBS לכל אחד. ובכן, הוסף שני מיליליטר של 1.5% גלוטראלדהיד ב-PBS כדי להבטיח כיסוי מלא בפיגום. השאירו את הצלחת למשך 30 דקות לפחות בארבע מעלות צלזיוס לקיבוע סל.

הסר את תמיסת הקיבוע ושטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS. לאחר מכן העבירו את הפיגומים לצלחת באר חדשה כדי לייבש אותם עם ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול במים מזוקקים, החל מ-50% אתנול ואחריו 70% ולאחר מכן 90% לכל ריכוז. טבלו את הפיגומים במלואם בתמיסה והשאירו למשך שלוש דקות לפני שזורקים את התמיסה וחוזרים על הפעולה.

לאחר ייבוש הפיגומים ב-100% אתנול על ידי טבילה מלאה של הפיגומים בתמיסה והשארתם למשך חמש דקות, השליכו את התמיסה וחזרו על ייבוש כימי של הפיגומים. שימוש ב-HMDS בתוך ארון אדים. טבלו את הפיגומים ב-HMDS והשאירו למשך חמש דקות לפני הסרת ה-HMDS לאחר חזרה פעם אחת.

הסר את ה-HMDS ואפשר לפיגומים להתייבש. לאחר מכן הרכיבו את הפיגומים על בדלי SEM הזמינים מסחרית כדי להקל על הצפייה בתוך שכבת ה-SEM, הדגימות עם שכבת ספוטר זהב למשך שתי דקות כדי להבטיח כיסוי דק ואחיד. לבסוף, מקם את הדגימות בתוך ה-SEM ודמיין את הפיגומים היושבים בתא באמצעות קרן אלקטרונים של חמישה קילו.

התוצאות מדגישות את מיקום התאים לאחר ארבע שעות לאחר הזריעה עבור כל מערך ניסוי שנחקר. איור זה מדגים את אחוז התאים שנצמדו למשטח הפיגום במהלך תקופה זו שבה נחקרו כל מערכי הזריעה. אחוז ההתקשרות של התא נמוך יחסית, אך היצמדות התאים הגדולה ביותר לפיגומים המוחזקים בתוך תוספות תרבית תאים ומטלטלים ב-30 סל"ד.

ההיצמדות הנמוכה ביותר הייתה לפיגומים שהוחזקו בתוך תוספות תרבית התאים ונשמרו בתנאים סטטיים. מספר רב של תאים היו נוכחים בתוך חלק המדיה, בעיקר עבור תרבית תאים. תוספות המוחזקות בתוך לוחות כריכה נמוכים ב-50% וכלים סיבוביים ב-51% פיגומים המוחזקים בתוך השקתות הדגימו מספר מוגבר של תאים הנמצאים בתוך המחזיק עצמו.

48% לשייקר שוקת ו-50% לסריקה סטטית של שוקת. מיקרוסקופיה אלקטרו-מיקרוסקופית אפשרה הערכה חזותית של פיגומי התא שנזרעו. תמונות מייצגות הדגישו נוכחות מוגבלת של תאים על פני השטח הסיבי ללא קשר להגדרת הזריעה.

עם זאת, מספר גדול יותר של תאים וצברי תאים היו נוכחים על הפיגומים שהוחזקו בתוך תוספות תרבית תאים וניערו ב-30 RP M.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב שזריעת מספר ידוע של תאים לא בהכרח שווה למספר התאים הרב שמתחברים בפועל לפיגום, במיוחד עבור פיגומים שאינם מכסים את כל בסיס לוחות הבר. עבור פיגומים כאלה, מומלץ לבצע תחילה אופטימיזציה של מערכי זריעה שונים של תאים על מנת למקסם את ההתקשרות הראשונית של התא לפיגום.