עצמי הרכבה של צורות דו-ממדיות מורכבות מחד-גדילי דנ"א אריחים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור ננו-מבנים מורכבים של DNA עם אריחים חד-גדיליים. זה מושג על ידי ערבוב גדילי DNA סינתטיים שתוכננו בקפידה בתמיסת חיץ רצויה ליצירת ננו-מבנה ה-DNA הרצוי כשלב שני. המדגם הוא כריעה שבמהלכה מתרחשת הרכבה עצמית של המבנה.

לאחר מכן, מבוצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוס מקומי והדמיית מיקרוסקופ כוח אטומי על מנת לאמת את היווצרותם המוצלחת של הננו-מבנים. התוצאות מראות ננו-מבנים של DNA בהרכבה עצמית המבוססים על אגרוס מקומי, אלקטרופורזה של ג'ל והדמיית מיקרוסקופ כוח אטומי. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהכנת דגימה של הרכבה עצמית כזו נראתה מסובכת לפני תחילת הליך זה השיגו גדילי רכיבי DNA של רצפים מוגדרים מומסים במים חופשיים של RNA מיצרן אוליגונוקלאוטידים ב-Vbo 96 לוחות באר פיפטה מיקרוליטר אחד מכל אחת מ-362 הבארות עבור 24 הסלילים ב-28 סיבובים.

מלבן הוסף 100 מיקרומולר לכל גדיל למבחנה של שני מיליליטר. לאחר מכן הוסף 138 מיקרוליטר של מים מזוקקים דה-יונים למבחנה כדי ליצור תמיסת מלאי. בריכוז של 200 ננו טוחנת לגדיל.

הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת המלאי 200 אנו טוחנת. 10 מיקרוליטר של 10 x חישול מאגר A ו-40 מיקרוליטר מים מזוקקים דה-יונים לצינור PCR של 0.2 מיליליטר. לאחר מכן, דגימה למשך 17 שעות במחזור תרמי מתקרר מ-90 עד 25 מעלות צלזיוס.

לאחר הכנת ג'ל מקורי 2% אגרוס צבוע מראש בכספת SYBR, הפעל אותו במשך שעתיים ב-100 וולט באמבט מי קרח. בסיום הדמיה את הג'ל באמצעות סורק ג'ל עם מסנן מתאים לכתם הבטוח של SYBR על אור כחול Transluminator מסיר את הרצועה הדומיננטית עם ניידות דומה לפס של 1,500 זוגות בסיסים של סולם ה-DNA האחד של קילו-בסיס באמצעות סכין גילוח נקי וחד מניחים את חתיכות הג'ל הרצויות בעמודת סיבוב ולאחר מכן מועכים את הג'ל לחתיכות עדינות בעזרת מיקרו שפופרת פלה ואז צנטריפוגה בחום של 438 גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בעקבות צנטריפוגה. מדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר אולטרה סגול ב-260 ננומטר. בשלב זה, קלף את ה-MICA המחובר לדיסק מתכתי של דגימה באמצעות סקוטש כדי לקבל משטח ישר והנח דיסק דגימה על שלב ההדמיה של המיקרוסקופ.

הוסף 40 מיקרוליטר של x אחד ומאגר כריעה A ואחריו חמישה מיקרוליטר מהדגימה המטוהרת של 24 HELOCs על 28 סיבובים של מלבן למשטח מיכה שזה עתה נחתך. תנו לתערובת להתייצב במשך כשתי דקות. התקן שבב שלוחה ניטריט סיליקון FM על מחזיק שלוחה דמיין את הדגימה במצב הקשה נוזלית באמצעות גודל סריקה של שני מיקרומטר 1024 קווים לרזולוציה.

וקצב סריקה של 0.5 עד הרץ אחד לתיוג פנימי המחובר לשלושה מקטעי נוקלאוטידים ראשוניים 17 לשמונה אריחים פנימיים ושישה אריחי גבול של המלבן. מערבבים את 28 הגדילים עם ידיות עם שאר גדילי הרכיבים של 24 HELOCs על מלבן של 28 סיבובים כדי ליצור תמיסת מלאי של 200 ננו-מולרית לתיוג גבולות. מערבבים את 14 הגדילים עם ידיות עם שאר הגדילים המרכיבים של 24 ימי העקב על מלבן 28 סיבובים כדי לקבל תמיסת מלאי של 200 ננו-מולרית לתיוג פנימי.

לתיוג הגבול, הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת המלאי 200 ננו-מולרי. 60 מיקרוליטר מתוך 100 גדילי אנטי ידית של ביוטין מיקרו-מולרי. 10 מיקרוליטר של 10 x חישול מאגר A ו -34 מיקרוליטר מים מזוקקים דה-יונים למבחנת PCR.

לתיוג פנימי, הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת המלאי של 200 ננו-מולאר. שלושה מיקרוליטרים של הגדיל הפנימי נגד ידית ביוטין ב-100 מיקרומולר. 10 מיקרוליטר של 10 x חישול מאגר A ו-37 מיקרוליטר מים מזוקקים דה-יונים למבחנה PCR.

לאחר מכן שוקלים 0.06 גרם פורמט משתנה בשלושה מיליליטר מים מזוקקים. להכנת תמיסת כתם משתנה מימית של 2%, יש לסנן את תמיסת הכתם באמצעות פילטר של 0.2 מיקרוליטר המחובר למזרק. הוסף חמישה מיקרוליטר של חמישה נתרן הידרוקסיד רגיל למיליליטר אחד מתמיסת הכתם המסוננת.

לאחר מערבולת קצרה של צנטריפוגת התמיסה ב -20, 000 G זוהר. פרוק את הרשתות המצופות פחמן כשהצד המצופה פונה כלפי מעלה באמצעות ההגדרות הבאות בסיום, פיפטה 3.5 מיקרוליטר של דגימה על הרשת המטופלת בפריקת זוהר. לאחר ארבע דקות, השתמש בפיסת נייר סינון כדי לנדף את הדגימה על ידי הבאת נייר הסינון במגע עם הרשת מהצד.

לאחר מכן הוסף מיד 3.5 מיקרוליטר מתמיסת הכתם לרשת. לאחר דקה אחת, נדפו את הכתם והחזיקו את נייר הסינון כנגד הרשת למשך דקה עד שתיים. העבר את הרשת למחזיק דגימת TEM.

תמונה באמצעות A-J-E-O-L GM 1400, פעלה ב-80 קילו-וולט בהגדלה שנעה בין 10 K ל-80 K.לאחר זיהוי הצורה, בחר את הגדילים המתאימים לצורה על הבד המולקולרי. החלף את התחום החשוף במקטע פולי T, באורך 10 עד 11 נוקלאוטידים, או הוסף מגן קצה משלים לתחום החשוף וסיים אותו במקטע פולי T באורך 10 עד 11 נוקלאוטידים. למניעת צבירה, צרו ספריית חוטים לבד הציור המולקולרי של 310 פיקסלים, הכולל את המחוך.

סט כוכב אחד סט שני כוכבים, שלושה כוכבים וסט ארבעה כוכבים כדי לתת בסך הכל 1,344 מגיני קצה. לאחר צנטריפוגה של 96 לוחות הבאר עבור הסטים השונים, פיפטה מיקרוליטר אחד של 206 גדילים מסט הליבה, אפס מסט כוכב אחד אפס מהסט, שני כוכב אפס מהסט, שלושה כוכבים ו-24 גדילים מסט ארבעה כוכב לתוך צינור צנטריפוגה של שני מיליליטר. הוסף 20 מיקרוליטר של מים מזוקקים נטולי יונים לצינור כדי ליצור תמיסת מלאי של 400 ננו-מולרית של גדילי ה-DNA.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת המלאי של 400 ננו-מולאר. 10 מיקרוליטר של 10 x חישול מאגר B ו-40 מיקרוליטר של מים מזוקקים דה-יונים לצינור PCR של 0.2 מיליליטר עם התערובת במחזור התרמי למשך 17 שעות כמתואר קודם לכן. לאחר טיהור הדגימה ומדידת תמונת ריכוז ה-DNA, הדגימה המשתמשת ב-FM באותו אופן כמו קודם ארבע בונה לבסוף מלבנים בגדלים שונים על ידי שינוי מספר ה-heoc המקביל ומספר הסיבובים הסליליים.

ההרכבה העצמית של אריחים חד-גדיליים תניב 24 HELOCs על 28 סיבובים רצפי DNA מלבניים עבור האריחים החד-גדיליים השונים ניתנים לשינוי ואופטימיזציה כדי לאפשר חלוקת סטרפטוקוקוס ותיוג הפיכת מלבן לצינור. ההרכבה העצמית הניתנת לתכנות של אריחים חד-גדיליים ליצירת צינורות ומלבנים בגדלים שונים ובניית צורות שרירותיות דו-ממדיות באמצעות הקנבס המולקולרי עיצוב החלפת תחום ועיצוב מגן קצה נבדקו כפתרונות לצבירה לאורך תחומים חשופים של צורות שרירותיות. לשני העיצובים יש תפוקת ג'ל דומה ושלמות מבנית, אך עיצוב מגן הקצה חסכוני יותר מכיוון שהוא דורש פחות מיני עזר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור ננו-מבני DNA מורכבים המבוססים על אריחי גדיל יחיד.