עצמי הרכבה של צורות דו-ממדיות מורכבות מחד-גדילי דנ"א אריחים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא ליצור ננו-מבנים מורכבים של DNA באמצעות אריחים של רצפים חד-גדיליים. מטרה זו מושגת על ידי ערבוב של גדילי DNA סינתטיים שתוכננו בקפידה בתוך תמיסת בופר רצויה כדי ליצור את ננו-מבנה ה-DNA המבוקש כשלב שני. הדגימה עוברת חימום וקירור הדרגתי (annealing), במהלכה מתרחשת ההרכבה העצמית של המבנה.

בשלב הבא, מבוצעים אלקטרופורזה של ג'ל אגרוס (agros) במצב טבעי (native) ודימות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לאמת את היווצרותן המוצלחת של הננו-מבנים. התוצאות מראות ננו-מבני DNA שהורכבו עצמית על בסיס אלקטרופורזה של ג'ל אגרוס במצב טבעי ודימות במיקרוסקופ כוח אטומי. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בכך, כיוון שהכנת הדגימות עבור הרכבה עצמית כזו נראית מסובכת. לפני תחילת הליך זה, השג רצפי גדילי DNA רכיבים ברצפים ספציפיים, מומסים במים נקיים מ-RNA, מיצר אוליגו-נוקלאוטידים, בלוחיות Vbo בעלות 96 בארות; העבר בפיפטה 1 µL מכל אחת מ-362 הבארות עבור 24 הסלילים עם 28 פיתולים.

הוסיפו 100 µM לכל גדיל למבחנה בנפח 2 mL. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה 138 µL של מים מזוקקים ודה-יוניים כדי להכין תמיסת סטוק בריכוז של 200 nM לכל גדיל.

הוסף 50 µL מהתמיסה המרוכזת בריכוז 200 nM, 10 µL של annealing buffer A בריכוז 10x ו-40 µL של מים מזוקקים ודה-יוניים לתוך מבחנת PCR בנפח 0.2 mL. לאחר מכן, בצע annealing לדגימה למשך 17 שעות בתוך תרמוסייקלר, עם קירור מ-90 ל-25 °C.

לאחר הכנת ג'ל אגרוז 2% טבעי שנצבע מראש ב-SYBR safe, הרצו אותו במשך שעתיים במתח של 100 וולט בתוך אמבט מי קרח. עם סיום ההרצה, דמיינו את הג'ל באמצעות סורק ג'לים עם מסנן מתאים לצבע SYBR safe על Transluminator של אור כחול. חתכו את הפס הדומיננטי בעל ניידות דומה לפס של 1,500 זוגות בסיסים של סולם DNA של 1 Kilobase באמצעות להב תער חד ונקי. הניחו את חתיכות הג'ל הרצויות בעמודת ספין (spin column) ולאחר מכן רסקו את הג'ל לחתיכות קטנות באמצעות פלסטל (micro tube pestle), ואז סובבו בצנטריפוגה ב-438 G למשך שלוש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגציה, מדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר ultraviolet באורך גל של 260 ננומטר. בשלב זה, קלף את ה-MICA המחוברת לדיסק המתכתי של הדגימה באמצעות סרט דביק (scotch tape) כדי לקבל משטח שטוח, והנח את דיסק הדגימה על במת הדמיה של המיקרוסקופ.

הוסף 40 µL של באפר A בריכוז 1x, ולאחריו 5 µL של הדגימה המזוהה של 24 HELOCs בסידור מלבני של 28 סיבובים, לפני השטח של ה-Mica שנוקו לאחרונה. המתן כמעט שתי דקות להתיישבות התערובת. התקן שבב קנטילבר מסיליקון ניטריד מסוג A FM על תושבת קנטילבר, ובצע הדמיה של הדגימה במצב tapping fluid, תוך שימוש בגודל סריקה של 2 µm וב-1024 קווים לרזולוציה.

וקצב סריקה של 0.5 עד 1 Hz עבור סימון פנימי המחובר למקטע של 17 נוקלאוטידים במיקום '3 עבור שמונה אריחים פנימיים ושש אריחי גבול של המלבן. ערבב את 28 הגדילים בעלי הידיות עם שאר גדילי הרכיבים של 24 ה-HELOCs במלבן של 28 סיבובים כדי להכין תמיסת מלאי בריכוז 200 nM עבור סימון גבול. ערבב את 14 הגדילים בעלי הידיות עם שאר גדילי הרכיבים של 24 ה-HELOCs במלבן של 28 סיבובים כדי לקבל תמיסת מלאי בריכוז 200 nM עבור סימון פנימי.

עבור סימון הגבולות, הוסף למבחנת PCR 50 µL של תמיסת המלאי בריכוז 200 nM, 60 µL של רכיבי anti handle modified biotin בריכוז 100 µM, 10 µL של annealing buffer A בריכוז 10x ו-34 µL של מים מזוקקים ומדה-יונים.

לסימון פנימי, הוסיפו למבחנת PCR‏ 50 µL של תמיסת המלאי בריכוז 200 nM,‏ 3 µL של גדיל anti handle biotin modified פנימי בריכוז 100 µM,‏ 10 µL של annealing buffer A בריכוז 10x ו-37 µL של מים מזוקקים ודה-יוניים.

בשלב הבא, שקלו 0.06 גרם של urinal formate בתוך שלושה milliliters של מים מזוקקים. כדי להכין תמיסת צביעה מימית של 2% urinal formate, סננו את תמיסת הצביעה באמצעות מסנן 0.2 microliter המחובר למזרק. הוסיפו חמישה microliters של sodium hydroxide בריכוז five normal לתוך מיליליטר אחד של תמיסת הצביעה המסוננת.

לאחר ערבול קצר של התמיסה במכשיר vortex, סבבו במ centriuge ב-20,000 G. בצעו glow discharge לרשתות המצופות בפחמן כאשר הצד המצופה פונה כלפי מעלה, באמצעות ההגדרות הבאות. בסיום, טפטפו באמצעות פיפטה 3.5 microliters מהדגימה על הרשת שעברה טיפול ב-glow discharge. לאחר ארבע דקות, השתמשו בפיסת נייר סינון כדי לספוג את שארית הדגימה על ידי הבאת נייר הסינון במגע עם דופן הרשת.

מיד לאחר מכן, הוסיפו 3.5 µl של תמיסת הצביעה על גבי הרשת. לאחר דקה אחת, ספגו את הצבע העודף והצמידו את נייר המסנן לרשת למשך דקה עד שתי דקות. העבירו את הרשת למחזיק דגימות TEM.

תמונה באמצעות A-J-E-O-L GM 1400, שהופעל במתח של 80 kilovolts עם הגדלה הנעה בין 10 K ל-80 K. לאחר זיהוי הצורה, בחרו את הגדילים המתאימים לצורה על קנבס המולקולות. החליפו את הדומיין החשוף במקטע poly T, באורך של 10 עד 11 נוקלאוטידים, או הוסיפו מגן קצה (edge protector) המשלים את הדומיין החשוף וסיימו אותו במקטע poly T באורך של 10 עד 11 נוקלאוטידים. כדי למנוע אגרגציה, צרו ספריית גדילים עבור קנבס המולקולות בגודל 310 pixel, הכוללת את המחוך (corset).

הכינו סט כוכב אחד, סט כוכב שתיים, סט כוכב שלוש וסט כוכב ארבע כדי להגיע לסה"כ 1,344 מגני קצוות (edge protectors). לאחר צנטריפוגציה של פלטות 96 הבארות עבור הסטים השונים, העבירו בפיפטה 1 µL של 206 גדילים מהסט הליבה (core set), 0 מהסט כוכב אחד, 0 מהסט כוכב שתיים, 0 מהסט כוכב שלוש ו-24 גדילים מהסט כוכב ארבע אל מבחנת צנטריפוגה של 2 mL. הוסיפו למבחנה 20 µL של מים מזוקקים ודה-יוניים כדי להכין תמיסת סטוק בריכוז 400 nM של גדילי ה-DNA.

בשלב הבא, הוסיפו 50 µL של תמיסת המלאי בריכוז 400 nM, כ-10 µL של באפר annealing B בריכוז 10x ו-40 µL של מים מזוקקים ודה-יוניים לתוך מבחנה ל-PCR בנפח 0.2 mL, והדגירו את התערובת במכשיר התרמו-סייקלר למשך 17 שעות כפי שתואר קודם לכן. לאחר טיהור הדגימה ומדידת ריכוז ה-DNA, דגמו את הדגימה באמצעות FM באותו אופן כפי שנעשה קודם, ולבסוף בנו מלבנים בגדלים שונים פשוט על ידי שינוי מספר ה-heoc המקבילים ומספר סיבובי הסליל.

הרכבה עצמית של אריחים מחד-גדיל תניב מלבן של 24 HELOCs על 28 פניות; רצפי ה-DNA של האריחים החד-גדיליים השונים ניתנים לשינוי ואופטימיזציה כדי לאפשר הפרדה וסימון של strep, והפיכת מלבן לצינור. ההרכבה העצמית התכנונית של אריחים מחד-גדיל ליצירת צינורות ומלבנים בגדלים משתנים, ובניית צורות שרירותיות דו-ממדיות באמצעות קנבס מולקולרי, נבדקו כפתרונות לאגרגציה לאורך דומיינים חשופים של צורות שרירותיות באמצעות תכנון החלפת דומיין ותכנון מגן קצוות. לשני התכנונים תנובה ג'ל ושלמות מבנית דומות, אך תכנון מגן הקצוות הוא יעיל יותר מבחינה כלכלית כיוון שהוא דורש פחות מינים עזריים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן ייצור ננו-מבני DNA מורכבים המבוססים על אריחי גדיל יחיד.