התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי במבחנה דגם של חומת Airway

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסובב אלקטרו פיגום פאזי תלת מימדי, המאפשר תרבות משותפת של תאים אנושיים בוגרים מובחנים לחלוטין על מנת לשכפל את המטריצה החוץ-תאית הטבעית שתאים אלה נתקלים בה ב-C שתיים. זה מושג על ידי סיבוב אלקטרו ראשון, פיגום מיקרופייבר מיושר באופן אקראי. השלב השני הוא יצירת פיגום דו-פאזי על ידי סיבוב אלקטרו של שכבת ננו-פייבר מיושרת באופן אקראי ישירות על פיגום המיקרופייבר.

לאחר מכן, פיגום ננו-סיבים מיושר נפרד מסובב אלקטרונים. השלב האחרון הוא לזרוע כל פיגום עם סוג התא המתאים לו ולתרבית משותפת של הפיגומים במערכת ביו-ריאקטור שופעת כמבנה יחיד. בסופו של דבר, ניתן לנתח אינטראקציות רב-תאיות באמצעות מדידה של שחרור מתווך וצביעה חיסונית.

המבנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ממברנות שעברו טרנספורמציה דו-ממדית, הוא שפיגומים חשמליים מספקים סביבה סיבית תלת מימדית הניתנת להתאמה כדי לספק מורפולוגיה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. זהו מבנה נקבובי יותר ומאפשר תרבית ליבה של סוגי תאים מרובים.

שיטה זו מספקת פלטפורמה יציבה המשתמשת בתאים אנושיים עוקבים, חולים או בריאים כמודל במבחנה. זה יעזור להפחית את ההסתמכות שלנו על מודלים של בעלי חיים, שיש להם מגבלה ברלוונטיות שלהם למחלות אנושיות ולהפחית את מספר החיות המשמשות בניסויים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מחלות כמו אסתמה ו-COPD, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות כגון לחקר מחלות דלקתיות של המעי, או לפיתוח מודל עור לבדיקות כימיות.

כדי להתחיל, הכינו שלוש תמיסות שונות של 10 מיליליטר של PET על ידי המסת 8%10% ו-30% PET לתערובות אחד לאחד של כלורו מתאן וחומצה טריכלורואצטית. מערבבים את התמיסות למשך הלילה בטמפרטורת החדר כדי להמיס את ה-PET למחרת. העבירו את תמיסות ה-PET למזרקים והצמידו מחט בגודל 23 למזרק המכיל את תערובת ה-8% ו-18 מחטים לשני המזרקים האחרים המכילים את תמיסות ה-PET של 10% ו-30%.

הכן את פיגום המיקרופייבר. ראשית, טען את המזרק המכיל את תמיסת ה-30% PET לתוך משאבת המזרק עם נקודת המחט בתחתית. מקם את ה-manl 15 סנטימטרים מקצה המחט וודא שהמחט מכוונת למרכז התוף.

חבר את קו אספקת החשמל החיובי לקצה המחט באמצעות קליפ תנין מתכתי והארקה את ה-manl על ידי חיבור קו ההארקה לשקע הבננה. הפעל את המנוע והגדר את מהירות ה-manl ל-60 סל"ד. הפעל את משאבת המזרק כדי לספק קצב זרימה של 2.0 מיליליטר לשעה.

תוך כדי יצירת פיגומי המיקרופייבר. אפשר למשאבה לפעול עד לתמיסה שחולצה מקצה המחט על מנת להניע את המערכת על ידי הוצאת כל אוויר במחט. לאחר מכן עצור את המשאבה על משאבת המזרק.

הגדר את הנפח הכולל של התמיסה שיש להוציא לשני מיליליטר והפעל את המשאבה. לאחר מכן, הפעל פוטנציאל של 14 קילו-וולט בין המחט לסיבוב האלקטרו של הציר למשך שעה אחת עד ששני מיליליטר מתמיסת ה-30% PET הסתובבו עם פיגום המיקרופייבר עדיין על הציר מכבים את פוטנציאל המתח. הסר את תפס התנין והחלף את המזרק המכיל את תמיסת ה-30% PET במזרק המכיל את תמיסת 8% PET.

לאחר מכן חבר מחדש את קליפ התנין למחט בגודל 23. שנה את קצב הזרימה של משאבת המזרק ל-0.5 מיליליטר לשעה והפעיל את המחט על ידי הפעלת משאבת המזרק עד שהתמיסה זורמת מהקצה. כאשר הציר ממשיך להסתובב במהירות של 60 סל"ד, הפעל את פוטנציאל ה-14 קילו-וולט בין קצה המחט לשדרה, והגדר את הנפח הכולל שיחולץ על ידי משאבת המזרק לשני מיליליטר.

סיבוב אלקטרו במשך ארבע שעות עד ששני מיליליטר מתמיסת 8% PET סובבו אלקטרו. לאחר השלמת הסיבוב החשמלי, כבה את ספק הכוח ואת המנוע המסובב את השדרה. חותכים את הפיגום הדו-פאזי עם להב לרוחב הציר כדי ליצור יריעת פיגום דו-ממדית בגודל שטח הפנים של הציר.

להכנת פיגומי PET מיושרים, טען את המזרק המכיל תמיסת PET של 10% לתוך משאבת המזרק עם נקודת המחט בתחתית. לאחר מכן חבר את קליפ התנין למחט. הגדר את קצב הזרימה ל-0.5 מיליליטר לשעה ופתח את המחט בתמיסת PET.

לאחר מכן הפעל את המנוע והגדר את מהירות סיבוב הציר ל-2000 סל"ד. לאחר מכן, הפעל את משאבת המזרק. הגדר את אספקת המתח ל-14 קילו-וולט והפעל את הסיבוב החשמלי של ספק הכוח למשך ארבע שעות עד ששני מיליליטר של תמיסה סובבו אלקטרו.

לאחר השלמת הסיבוב החשמלי, כבה את ספק הכוח ואת המנוע. חותכים את הפיגום עם להב לרוחב הציר כדי לייצר יריעת פיגום דו-ממדית מיושרת. אחסן את הפיגומים המסתובבים באלקטרו בנייר אלומיניום כדי להפחית את המטען האלקטרוסטטי.

השתמש בעט ביופסיה בקוטר 0.8 מילימטר כדי לנקב דיסקים של פיגומים דו-פאזיים או מיושרים מגיליונות ה- SPU. לאחר מכן הדביקו את דיסק הפיגום הדו-פאזי לאטם באמצעות דבק אקווריום לא רעיל. מניחים את האטמים והפיגומים בצלחת תרבית רקמות של 12 בארות.

עקר את האטמים והפיגומים באמצעות קרינה אולטרה סגולה I למשך 30 דקות מכל צד של הפיגומים. לאחר מכן השרו בתמיסת אנטי-פטריית אנטיביוטית 20% למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת. שטפו פיגומים עם PP S3 פעמים ואחסנו את הפיגומים ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס עד לשימושם.

העבירו את הפיגומים הדו-פאזיים מה-PBS לצלחת טרייה של 12 בארות וחממו אותם במדיית DMEM בתוספת 10% FCS למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס. הסר את המדיה המשלימה DMEM והנח את שלב המיקרופייבר של הפיגומים זרע 15,000 MRC חמישה תאי פיברובלסטים ב-30 מיקרוליטר של מדיה משלימה DMEM על כל פיגום כדי לעזור לפיברובלסטים לחדור לתוך הפיגום. הנח את הצלחת על שייקר מסלולי וערבב את הפיגומים ב-100 סל"ד למשך שעתיים.

לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של מדיה משלימה DMEM לכל פיגום ודגר את הפיגומים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת, הסר את המדיה מהבארות והפוך את הפיגומים כך ששלב הננו-סיבים של הפיגומים פונה בצורה אפיקלית. לאחר מכן זרע 30,000 קאלי שלושה תאי אפיתל ב-30 מיקרוליטר של מדיה D-M-E-M-F 12 בתוספת 10% FCS על שלב הננו-סיבים של הפיגום.

דגרו את הפיגום במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לפני הטבעת הפיגומים בתערובת של 70 30 של מדיה משלימה D-M-E-M-F 12 ו-DMEM והמשיכו בדגירה סטטית למשך 12 שעות נוספות כדי לתרבית את דרכי הנשימה. תאי שריר חלקים ראשית, העבירו את הפיגומים המיושרים מה-PBS לצלחת טרייה של 12 בארות וחממו אותם ומדיה משלימה DMEM למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. הסר את המדיה המשלימה DMEM והוסף 25,000 תאי שריר חלק בדרכי הנשימה ב-30 מיקרוליטר של מדיה משלימה DMEM לכל פיגום ודגירה במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר החיבור, טבלו את הפיגומים במדיה משלימה DMEM. החזירו אותם לחממה והשאירו אותם למשך הלילה לפני הקמת תרבית תלת-כורית בביו-ריאקטור. למחרת, הנח את פיגום הזרעים הדו-פאזי בתא הביוריאקטור כששלב האפיתל פונה כלפי מעלה לתוך החדר.

לאחר מכן הנח את הפיגום המיושר מתחת לפיגום הדו-פאזי כך שיהיה צמוד לשלב המיקרופייבר של הפיגום הדו-פאזי. נעל את שני התאים של הביוריאקטור יחד. לאחר מכן הרכיבו שני מעגלי זרימת זלוף בתוך חממה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה ושאבו מדיה סביב שני המעגלים במהירות של כ-0.1 מיליליטר לדקה באמצעות משאבה פריסטלטית לאחר שבוע.

הסר את המדיה מהתא האפיקלי והתרבות. תאי האפיתל בממשק נוזל האוויר במשך שבוע נוסף לפני הניתוח לאחר שבועיים בביו-ריאקטור, פיגום התרבית המשולש המוצג כאן תוקן וחתך כדי להראות שגרעיני התאים המפוזרים בכל שלוש השכבות של גרעיני התא נצבעו ב-DPI ונראים כחולים במקום שבו חומר הפיגום נראה אפור. להלן תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של מיקרופייבר ננו-סיבים מסובבים ופיגומים מיושרים שהוכנו לזריעת תאי אפיתל, פיברובלסטים ותאי שריר חלק בהתאמה.

כל שלושת סוגי התאים הראו עלייה בכדאיות כאשר תרבית על הפיגומים האישיים שלהם במשך תקופה של שבועיים. כל אחד מהם גם המשיך לבטא חלבונים ספציפיים לסוג התא לאחר תקופת התרבית בת השבועיים. בזמן שאתה מנסה הליך זה, חשוב לזכור לחקור את המטריצה החוץ-תאית המקורית שאתה מנסה לשחזר עם סיבי האלקטרו.

תא יתנהג אחרת בעת חיבור לטופוגרפיות תלת מימד שונות. לדוגמה, תאי אפיתל ייצרו מחסום תפקודי רק כאשר הם מתורבתים על סיבי ננו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות מערכת תרבות משותפת רב-שכבתית, שיכולה לשמש לחקר אינטראקציות בין-תאיות בתוך סביבת תרבות דינמית.

אל תשכח שחשוב להתאים את פרמטרי הספינינג האלקטרו שלך, כגון קצב זרימה ומתח כך שיתאימו למערכת הפולימר והממס שבה אתה מתכוון להשתמש בעת ביצוע הליך זה. זה חיוני בייצור הסיבים הרצויים. בנוסף, זכור לבחור לסובב מכסה מנוע או ארון מאוורר כדי לאפשר חילוץ נכון של ממסים.