התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי
31 ביולי 2015
ההתקדמות בטכנולוגיות ביו-חומרים מאפשרת פיתוח מבנים תלת מימדיים מרובי תאים. פיתחנו פרוטוקולי אלקטרו-ספינינג לייצור שלושה פיגומים בודדים לתרבית התאים המבניים העיקריים של דרכי הנשימה כדי לספק מודל תלת מימדי במבחנה של דופן הסימפונות של דרכי הנשימה.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע אלקטרו-ספינינג (electro spinning) של פיגום תלת-ממדי דו-פאזי, המאפשר תרבית משותפת של תאים אנושיים בוגרים ומובחנים במלואם, במטרה לשחזר את המטריצה החוץ-תאית הטבעית שבה התאים הללו נתקלים ב-C two. הדבר מושג תחילה על ידי אלקטרו-ספינינג של פיגום מיקרו-סיבים בעלי יישור אקראי. השלב השני הוא יצירת פיגום דו-פאזי על ידי אלקטרו-ספינינג של שכבת ננו-סיבים בעלי יישור אקראי ישירות על פיגום המיקרו-סיבים.
לאחר מכן, מכינים בנסיגה אלקטרוסטטית פיגום ננו-סיבים מיושר נפרד. השלב הסופי הוא זריעת כל פיגום עם סוג התאים המתאים לו, וגידול משותף של הפיגומים במערכת ביו-ראקטור עם זרימה כקונסטרוקציה אחת. לבסוף, ניתן לנתח אינטראקציות רב-תאיות באמצעות מדידה של שחרור מתווכים וצביעה אימונוהיסטוכימית.
המבנה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קרומים טרנספורמיים דו-ממדיים (2D), הוא שפיגומים חשמליים מספקים סביבה סיבית תלת-ממדית (3D) שניתן להתאימה כדי לספק מורפולוגיה רלוונטית פיזיולוגית. זהו מבנה נקבובי יותר המאפשר תרבית של סוגי תאים מרובים.
שיטה זו מספקת פלטפורמה יציבה המשתמשת בתאים אנושיים חולים, בריאים או כאלו השייכים לקו תאים (cohorted), כמודל in vitro. הדבר יסייע להפחית את ההסתמכות שלנו על מודלים של בעלי חיים, אשר מוגבלים ברמת הרלוונטיות שלהם למחלות אנושיות, ויפחית את מספר בעלי החיים המשמשים בניסויים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מחלות כגון אסתמה ו-COPD, היא יכולה להיות מיושמת גם על מערכות אחרות, כגון למחקר של מחלות דלקתיות של המעי, או לפיתוח מודל עור לבדיקות כימיות.
ראשית, הכינו שלושה תמיסות שונות של PET בנפח 10 מיליליטר על ידי המסה של 8%, 10% ו-30% PET לתוך תערובות של יחס אחד-לאחד של כלורומתאן וחומצה טריכלורואצטית. ערבבו את התמיסות למשך לילה בטמפרטורת החדר כדי להמיס את ה-PET עד למחרת. העבירו את תמיסות ה-PET למזרקים וחברו מחט במידה 23 למזרק המכיל את תערובת ה-8%, ומחטים במידה 18 לשני המזרקים האחרים המכילים את תמיסות ה-10% וה-30% PET.
הכינו את פיגום המיקרוסיבים. ראשית, טענו למשאבת המזרקים את המזרק המכיל את תמיסת ה-30%PET, כאשר חוד הנוכלי פונה כלפי מטה. מקמו את התוף במרחק של 15 סנטימטרים מקצה המחט וודאו כי המחט מופנית למרכז התוף.
חברו את קו אספקת החשמל החיובי לקצה המחט באמצעות תליס תנימים ממתכת, והאריצו את ה-manl על ידי חיבור קו ההארקה לשקע הבננה. הפעילו את המנוע והגדירו את מהירות ה-manl ל-60 RPMs. הפעילו את משאבת המזרקים כדי לספק קצב זרימה של 2.0 milliliters per hour.
במהלך יצירת פיגומי המיקרוסיבים, יש להניח למשאבה לפעול עד שהתמיסה תידחף מקצה המחט, וזאת כדי להכין את המערכת על ידי הוצאת כל האוויר מהמחט. לאחר מכן, יש לעצור את המשאבה במשאבת המזרקים.
הגדירו את הנפח הכולל של התמיסה שיש להשריץ לשני מיליליטרים והפעילו את המשאבה. לאחר מכן, הכניסו פוטנציאל של 14 kilovolts בין המחט למנדרל (mandrel) לצורך טריקה חשמלית (electro spin) למשך שעה אחת, עד ששני מיליליטרים של תמיסת 30% PET יטרוקו חשמלית. כאשר פיגום המיקרו-סיבים עדיין נמצא על המנדרל, כבו את הפוטנציאל החשמלי. הסירו את תפסן התנימים (crocodile clip) והחליפו את המזרק המכיל את תמיסת ה-30% PET במזרק המכיל את תמיסת ה-8% PET.
לאחר מכן, חברו מחדש את תליב התניב למחט במידה 23. שנו את קצב הזרימה של משאבת המזרק ל-0.5 milliliters לשעה ובצעו החלטה (prime) למחט על ידי הפעלת משאבת המזרק עד להזרמת התמיסה מקצה המחט. כאשר המנדריל ממשיך להסתובב במהירות של 60 RPMs, הפילו פוטנציאל של 14 kilovolt בין קצה המחט למנדריל, והגדירו את הנפח הכולל שיוזרק על ידי משאבת המזרק לשני milliliters.
בצעו אלקטרו-ספינינג למשך ארבע שעות, עד ששני מיליליטרים של תמיסת 8%PET יעברו תהליך אלקטרו-ספינינג. עם השלמת האלקטרו-ספינינג, כבו את ספק הכוח ואת המנוע המסובב את המנדרל. חתכו את הפיגום הביפאזי באמצעות להב לאורך רוחב המנדרל, כדי להפיק גיליון פיגום דו-ממדי בגודל שטח הפנים של המנדרל.
להכנת פיגומים (scaffolds) של PET מיושרים, טענו את המזרק המכיל תמיסת PET בריכוז 10% לתוך משאבת המזרקים, כאשר חוד המחט פונה כלפי מטה. לאחר מכן, חברו את תפס התנימים למחט. הגדירו את קצב הזרימה ל-0.5 milliliters per hour ובצעו ה priming (הזרמת תמיסה ראשונית) למחט עם תמיסת ה-PET.
לאחר מכן, הפעילו את המנוע והגדירו את מהירות הסיבוב של המנדרל ל-2000 RPMs. כעת, הפעילו את משאבת המזרקים. הגדירו את מתח ההספקה ל-14 kilovolts והפעילו את ספק הכוח לאלקטרו-ספינינג למשך ארבע שעות, עד ששני מיליליטר של תמיסה יעברו אלקטרו-ספינינג.
עם השלמת תהליך האלקטרו-ספינינג (electro spinning), כבה את ספק הכוח ואת המנוע. חתוך את הפיגום בעזרת להב לאורך רוחב המנדרל כדי להפיק גיליון פיגום דו-ממדי ומיושר. אחסן את הפיגומים שהופקו באלקטרו-ספינינג בנייר אלומיניום כדי להפחית את המטען האלקטרוסטטי.
השתמש במחץ ביופסיה בקוטר 0.8 מילימטר כדי להוציא דיסקיות של פיגומים (scaffolds) דו-פאזיים או מיושרים מגילי ה-SPU. לאחר מכן, הדבק את הדיסקית של הפיגום הדו-פאזי לאטב בעזרת דבק אקווריום לא רעיל. הנח את האטבים והפיגומים לתוך פלטת תרבית רקמות בעלת 12 בארות.
עקרו את האטמים והפיגומים באמצעות קרינת ultraviolet I למשך 30 דקות על כל צד של הפיגומים. לאחר מכן, השריהם בתמיסת antibiotic antimycotic בריכוז 20% למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הפיגומים עם PBS שלוש פעמים ואחסנו את הפיגומים ב-PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד השימוש.
העבירו את הפיגומים הדו-פאזיים מה-PBS לפלטת 12 בארות חדשה וחממו אותם במצע DMEM המועשר ב-10% FCS למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. הסירו את מצע ה-DMEM המועשר והניחו את פאזת המיקרוסיבים של הפיגומים; זרעו 15,000 תאי פיברובלסט MRC five ב-30 microliters של מצע DMEM מועשר על כל פיגום כדי לסייע לפיברובלסטים לחדור אל תוך הפיגום. הניחו את הפלטה על מערבל אורביטלי וערבבו את הפיגומים ב-100 RPMs למשך שעתיים.
לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטרים של מצע DMEM מועשר לכל פיגום (scaffold) והדגירו את הפיגומים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. למחרת, הוציאו את המצע מהבארים והפכו את הפיגומים כך שפאזת הננו-סיבים של הפיגומים תפנה כלפי מעלה (apically). לאחר מכן, זרעו 30,000 תאי אפיתל Cali 3 ב-30 מיקרוליטר של מצע DMEM-F12 מועשר עם 10% FCS על פאזת הננו-סיבים של הפיגום.
דגרו את הפיגום למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide לפני השקעת הפיגומים בתערובת של 70 30 של D-M-E-M-F 12 ומצע DMEM מועשר, והמשיכו בדגירה סטטית למשך 12 שעות נוספות לתרבית של תאי שריר חלק של דרכי הנשימה. ראשית, העבירו את הפיגומים המיושרים מה-PBS לפלטת 12 באריים רעננה וחממו אותם יחד עם מצע DMEM מועשר למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. הסירו את מצע ה-DMEM המועשר והוסיפו 25,000 תאי שריר חלק של דרכי הנשימה ב-30 microliters של מצע DMEM מועשר לכל פיגום, ודגרו אותם למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide.
לאחר ההצמדה, טבול את הפיגומים במצע DMEM מועשר. החזר אותם למדגרה והשאר אותם למשך הלילה לפני הקמת תרבית משולשת (tri culture) בביוראקטור. למחרת, הנח את הפיגום הדו-פאזי המושתל לתוך תא הביוראקטור, כאשר הפאזה האפיתלית פונה כלפי מעלה לתוך התא.
לאחר מכן, מקמו את הפיגום המיושר מתחת לפיגום הדו-פאזי, כך שיהיה צמוד לשלב המיקרו-סיבים של הפיגום הדו-פאזי. נעלו את שתי תאי הביוראקטור יחד. לאחר מכן, הרכיבו שני מעגלי זרימה לפרפוזיה בתוך אינקובטור כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה, והזרים מצע גידול בשני המעגלים בקצב של כ-0.1 milliliters per minute באמצעות משאבה פריסטלטית לאחר שבוע.
הסר את המצע מהתא האפיקלי ומהתרבית. גידל את התאי האפיתליים בממשק אוויר-נוזל למשך שבוע נוסף לפני הניתוח; לאחר שבועיים בביוראקטור, פיקסרו וחתכו את פיגום התרבית המשולשת המוצג כאן כדי להראות גרעיני תאים המפוזרים בכל שלוש השכבות של המבנה. גרעיני התאים נצבעו ב-DPI ומופיעים בכחול, בעוד חומר הפיגום מופיע באפור. להלן תמונות ממיקרוסקופ אלקטרוני סורק של פיגסוני הננו-סיבים, המיקרו-סיבים והפיגסונים המיושרים שהוכנו לזריעה של תאי אפיתל, פיברובלסטים ותאי שריר חלק, בהתאמה.
כל שלושת סוגי התאים הראו עלייה בחיוניות כאשר תורשרו על הפיגומים האינדיבידואליים שלהם לאורך תקופה של שבועיים. כל אחד מהם המשיך לבטא חלבונים ספציפיים לסוג התא לאחר תקופת תרבית של שבועיים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לחקור את המטריצה החוץ-תאית טבעית שאתם מנסים לשחזר באמצעות הסיבים החשמליים.
תאים יתנהגו באופן שונה כאשר הם נצמדים לטופוגרפיות תלת-ממדיות שונות. לדוגמה, תאי אפיתל ייצרו מחסום תפקודי רק כאשר הם מגודלים על סיבי ננו. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובהB לגבי האופן שבו בונים מערכת של תרביות משולבות רב-שכבתיות, שניתן להשתמש בה לחקר אינטראקציות בין-תאיות בתוך סביבת תרבית דינמית.
אל תשכחו כי חשוב להתאים את פרמטרי האלקטרו-ספינינג (electro spinning), כגון קצב הזרימה והמתח, למערכת הפולימר והממס שאתם מתכוונים להשתמש בהם בעת ביצוע הליך זה. דבר זה חיוני ליצירת הסיבים הרצויים. בנוסף, זכרו לבצע אלקטרו-ספינינג בתוך מ常用的 מזה או ארון עם מערכת פליטה, כדי לאפשר שאיבה תקינה של הממסים.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה ליצירת מבנים תלת-ממדיים בעלי מספר סוגי תאים באמצעות טכניקות של אלקטרוספינינג (electrospinning). הפיגומים שפותחו נועדו לשחזר את דופן הסימפונות בדרכי הנשימה, ובכך להקל על תרבית משותפת (co-culture) של תאי אדם מובחנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביומטריאלים
- הנדסת רקמות
- תרבית תאים
רקע
- התקדמויות בטכנולוגיות של חומרים ביולוגיים אפשרו את הפיתוח של מודלים מורכבים של רקמות.
- שיטות קיימות נשענות לרוב על תרביות דו-ממדיות (2D), שאינן מייצגות באופן מדויק סביבות in vivo.
- פיגומים תלת-ממדיים (3D) יכולים לשפר אינטראקציות תאיות ולחקות את המטריקס החוץ-תאי.
- מחקר זה מתמקד בתאים מבניים של דרכי הנשימה ובאינטראקציות ביניהם בסביבה מבוקרת.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל תלת-ממדי (3D) in vitro של דופן הברונכיולות בדרכי הנשימה.
- סיוע בתרבית משותפת (co-culture) של סוגי תאים מרובים למידול טוב יותר של מחלות.
- הפחתת ההסתמכות על מודלים של בעלי חיים במחקר.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- אלקטרוספינינג של פיגומים המורכבים ממיקרוסיבים וננוסיבים.
- תרבית משותפת של תאי אדם בוגרים ומובחנים.
- שימוש במערכת ביו-ראקטור עם פרפוזיה להגברת אספקת הנוטריאנטים.
- מדידת אינטראקציות תאיות באמצעות שחרור מדיאטורים וצביעה אימונוהיסטוכימית.
תוצאות עיקריות
- הפיגומים שיוצרו באלקטרוספינינג תמכו בהצלחה בצמיחה של סוגי תאים מרובים.
- מבנים בתלת-ממד הדגימו אינטראקציות תאיות משופרות בהשוואה לתרביות דו-ממדיות מסורתיות.
- יישומים פוטנציאליים כוללים חקר מחלות כגון אסתמה ו-COPD.
- השיטה מספקת פלטפורמה יציבה לניסויים in vitro.
מסקנות
- טכניקה זו של אלקטרוספינינג (electrospinning) מציעה גישה מבטיחה ליצירת מודלים של רקמות בעלי רלוונטיות פיזיולוגית.
- היא יכולה לקדם באופן משמעותי את המחקר במחלות נשימתיות ומעבר להן.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון יישומים נוספים במערכות איברים אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פיגומים תלת-שכבתיים המיוצרים בסיבוב אלקטרוסטטי (electrospun) מאפשרים יצירת מודלים של דרכי הנשימה in vitro הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, ובכך תומכים בביטחון חיזוי במחקרים של מחלות נשימה. פלטפורמה זו מקדמת תיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים והפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי שכפול סביבות של מטריצה חוץ-תאית טבעית עבור סוגים מרובים של תאים אנושיים. גישה זו מפחיתה את ההסתמכות על מודלים בבעלי חיים ומשפרת את הרצף התרגומי עבור פורטפוליו מו"פ פרמצבטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תקשורת בין-תאית (cross-talk) בהקשר תלת-ממדי רלוונטי לרקמה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי שמירה על פנוטיפים של תאים מובחנים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות פרמטרים מבוקרים של המיקרו-סביבה.
- משפר את רמת הביטחון החזויית עבור מטרות ומסלולים של מחלות דרכי הנשימה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פיגומים תלת-ממדיים סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור בדיקות של תרביות משותפות של סוגי תאים מרובים.
- מספק תוצאות כמותיות באמצעות מדידת שחרור מתווכים וקריאות של צביעה אימונוהיסטוכימית.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות תרכובות במערכות הרלוונטיות למחלה.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור קמפיינים שונים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים in vitro למבנה רקמת דרכי הנשימה האנושיות לצורך מחקרי ביומרקרים טרנסלציונליים.
- מפחיתה סיכון טרנסלציונלי על ידי מידול מנגנוני מחלה במבנים רלוונטיים פיזיולוגית.
- מסייעת בקבלת החלטות על קידום פרויקטים המותאמות לסיכון עבור תוכניות למחלות נשימה ודלקתיות.
- מאפשרת רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני במערכות הרלוונטיות לבני אדם.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
מערכת פיגום זו בעלת שלושה שכבות משלבת שלבי גילוי מוקדמים ועד למחקר פרה-קליני, ותומכת בתיקוף מטרות, סינון ומחקרים תרגומיים במסלולי פיתוח למחלות בדרכי הנשימה.
- ביולוגיה של התגליות: משחזרת מיקרו-סביבות של דופן דרכי הנשימה לצורך בחינת היפותזות והבהרת מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת פיגומים תלת-ממדיים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, לצורך ניתוח כמותי של סוגי תאים מרובים.
- אנליזה: מאפשרת מדידה של שחרור מתווכים וביטוי חלבונים למחקרים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מספקת מודלים רלוונטיים למחלה לצורך התאמת ביומארקרים ומחקרים מכניסטיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה מודולרית וניתנת להתאמה ליישומי מידול רקמות מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של מחלות דרכי הנשימה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של ייצור פיגומים בתלת-ממד ושל זרימות עבודה של תרבית משותפת (co-culture) לצורך הדירות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הפחתת התלות במודלים של בעלי חיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים וקידום של נכסי מחקר למחלות נשימה ודלקת.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקת electrospinning, בתרביות תאים ובתפעול ביו-ריאקטורים.
- נדרשת גישה לציוד לייצור פיגומים (scaffolds) ולמערכות ביו-ריאקטור עם פרפוזיה.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי הפיגומים ושל פרוטוקולי זריעת התאים.
- התאמה למודלים של רקמות אחרות מחייבת התאמה של תכונות הפיגום למאפייני ה-ECM הטבעי.
- טיפול בממסים ואופטימיזציה של פרמטרים הם קריטיים ליצירת פיגומים הניתנים לשחזור.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Electrospinning Biphasic and Aligned Polyethylene Terephthalate Scaffolds
5:34
Sterilization of Scaffolds
6:24
Seeding of Fibroblasts and Epithelial Cells onto Biphasic Scaffolds and Airway Smooth Muscle onto Aligned Scaffolds
8:36
Tri-culture Using a Bioreactor System
9:29
Results: Tri-Culture Cells Continue to Produce Cell Type Specific Proteins
10:20
Conclusion
